Vol.33高等学校化学学报No.112012年11月摇摇摇摇摇摇CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES摇摇摇摇摇摇2397~2404
基因芯片用于组分中药新双龙方的配伍机制研究吕琳星1,范雪梅2,梁琼麟2,王文凯1,王义明1,2,罗国安1,2(1.江西中医学院药学院,南昌330004;2.清华大学化学系,北京100084)摘要摇采用基因芯片技术研究了中药新双龙方及其有效组分人参总皂苷和丹参总酚酸治疗急性心肌梗塞(AMI)大鼠的作用机制.以结扎大鼠冠脉左前降支的方法制备急性心梗模型,采用大鼠全基因组表达谱芯片分别筛选出AMI大鼠给药前及新双龙方与组分给药后的差异表达基因(Ratio>2或<0郾5),通过对4组差异基因的综合分析,比较了新双龙方与组分作用方式的异同,从分子调控水平上探讨复方配伍后的增效作用,同时对与药效作用机理直接相关的钙离子转运相关的Cacna1d基因和血管修复相关的Flnb基因进行了实时荧光逆转录聚合酶链式反应(RT鄄PCR)定量.结果表明,新双龙方与2种有效组分对心梗大鼠基因表达的影响不同.对差异基因的聚类分析以及药物的调控作用比较结果均表明复方比组分的疗效更好;通路分析结果表明,新双龙方与组分均主要通过调控钙信号转导通路、丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路(MAPK)信号等通路发挥药效作用,且复方涉及更多通路;筛选出了复方与组分共同调控的靶点基因,其在3组中具有不完全相同的表达趋势,但复方具有更积极的调控作用.本研究结果从分子调控角度证实了复方新双龙方的配伍优势.关键词摇基因表达谱;实时荧光定量聚合酶链式反应;复方配伍;新双龙方;急性心肌梗塞中图分类号摇O652摇摇摇摇文献标识码摇A摇摇摇摇doi:10.7503/cjcu20120347
收稿日期:2012鄄04鄄13.基金项目:国家自然科学基金重点项目(批准号:81130066)和科技部国际合作项目(批准号:2010DFA32420)资助.联系人简介:罗国安,男,教授,博士生导师,主要从事生命分析化学相关研究.E鄄mail:luoga@中药复方双龙方由人参和丹参两味药材配伍而成,主治冠心病气虚血瘀证.具有“益气养血、活血通脉冶的功能.复方中以甘温的人参为君,补充人体不足之气;臣以味苦、微寒的丹参,活血通脉、祛瘀止痛[1].现代药理研究采用大鼠心梗模型证实双龙方对心肌梗塞有明确的治疗作用[2].本课题组[3]采用化学物质组学研究证明人参总皂苷和丹参总酚酸是双龙方治疗心肌缺血的药效物质基础,其配伍后组成的组分中药新双龙方在大鼠急性心肌梗死发生时能够减小心肌梗死范围,减轻心肌损伤程度,增加心肌小血管密度,增加心肌供血,改善心血管功能,但其作用机制尚不清楚.基于AMI是一个多环节共同参与的病理过程,而中药复方正是在整体观、系统论和中医药理论指导下的,考虑“系统鄄系统冶相互作用的“由繁到简冶,即从药材配伍到组分配伍到成分群的过程[4].本研究从分子生物学角度对复方及其有效组分的药理作用作了进一步探讨,旨在阐释组分中药新双龙方的药效和配伍作用.前文[5医已将基因芯片技术应用于中药作用和复方配伍减毒[6]等机制研究,本文通过构建新双龙方及其有效组分人参总皂苷和丹参总酚酸分别干预心梗模型大鼠的全基因组表达谱,采用比较基因组学的模式探讨了3组药物作用方式的异同,从分子调控角度阐释组分中药新双龙方的药效机制及复方配伍优势.1摇实验部分1.1摇试剂与仪器晶芯襅大鼠全基因组表达谱芯片、晶芯襅cRNA扩增标记试剂盒(北京博奥生物有限公司);荧光染料Cy3鄄dCTP/Cy5鄄dCTP(瑞典Amersham公司);Nucleospin襆RNAClean鄄up和Nucleospin襆Extract域(美国MN公司);TrizolReagent(美国Invitrogen公司);FirstStrandcDNASynthesisKit(美国Fermentas公司);RealMasterMix(SYBRGreen)荧光定量试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司];RNasefreewater(美国Quagen公司);无水乙醇、氯仿、异丙醇均为国产分析纯(北方化工厂).丹参总酚酸(批号:20080604,自制),人参总皂苷(批号:20080603,自制),新双龙方由2种组分按药效试验筛出的最佳比例配伍组成.BioMixerTM域芯片杂交仪、LuxScan10KA双通道激光扫描仪(北京博奥生物有限公司)、紫外交联仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);超小型真空浓缩仪(日本Taipec公司);GS482双模块基因扩增仪(英国GeneTechnologies公司);ABI7300RealTimePCRSystem(美国ABI公司);台式冷冻离心机(德国Hettich公司);Biophotometer核酸紫外分析仪(德国Eppendorf公司).1.2摇大鼠急性心梗模型的建立及给药方法清洁级雄性SD大鼠,体重(250依20)g,购自清华大学动物实验中心.采用文献[7]方法建立心梗模型,即在大鼠自主呼吸条件下,迅速开胸挤出心脏进行冠状动脉结扎,通过心电图、心梗面积变化和血清酶学指标检测等证实结扎成功.将大鼠分为模型组(M)、双龙方给药组(NSLF)、丹参总酚酸给药组(TSA)和人参总皂苷给药组(TGS);另设假手术组(SHAM),只进行开胸穿线,但不结扎,每组6只.给药量为5g生药/kg,将NSLF,TSA和TGS组用生理盐水配制成此剂量浓度的混悬液,采用灌胃方式连续给药7d,每天1次;SHAM组和M组灌胃等量生理盐水.7d后将大鼠处死,取其心脏梗死区与正常组织之间的病变区域,剪碎后立即放入冻存管并置于液氮中保存.1.3摇总RNA样本的提取按照Trizol试剂盒操作方法,提取大鼠心脏组织中的总RNA,用RNasefreewater溶解.用核酸紫外分析仪检测纯度,OD260nm/280nm值(吸光度)为1郾8~2郾1;用甲醛变性凝胶电泳检测完整性,28S和18S2个条带清晰可见,无拖尾现象;总RNA质量符合芯片实验要求.1.4摇基因芯片杂交及数据分析27KRatGenomeArray为双通道芯片,杂交实验分为4组:SHAM/M,记为SHAM组;NSLF/M,记为NSLF组;TGS/M,记为TGS组;TSA/M,记为TSA组.按照晶芯襆cRNA扩增标记过程,其中假手术组及给药组作为实验组,荧光标记为Cy5;模型组为共同对照组,荧光标记为Cy3.每组芯片进行3次生物学重复.将点样后的芯片于42益恒温杂交12~14h,采用LuxScan10KA双通道激光扫描仪扫描芯片,结果用BoaoAnalyzer系列软件进行归一化等处理后提取数据.根据Cy5/Cy3的荧光信号变化倍数(Ratio值)筛选差异基因,Ratio值大于2为显著上调表达基因;小于0郾5为显著下调表达基因.1.5摇Real鄄timePCR对芯片差异表达基因的验证取1滋g总RNA逆转录合成cDNA,采用SYBRGreen玉法对待测基因进行实时荧光定量PCR扩增,反应过程:95益,10min;95益,15s;62益,30s;72益,30s;40cycles.PCR引物采用Primer5郾0软件设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(见表1).采用绝对定量分析法,将标准品级别稀释后与待测样本同时进行反应,通过构建标准曲线获得未知样本的量.以管家基因GAPDH为校准基因,模型组为校准样本,分别计算待测基因Cacna1d和Flnb在SHAM组、NSLF组、TSA组和TGS组中相对于M组的表达水平.Table1摇SequenceinformationoftheprimersGeneForwardPrimerReversePrimerAmplificationsizeGAPDHGCATCCTCGGCTACAGTGAGTCCACCACCATGTTGCTGTA125Cacna1dTCCCTTCAGCAGACCAATACCAGCATTTGTGGAGGTGGGAACTT163FlnbAGCCACCGTCCACGACAATAACGATAAGGAGAAAGTGGGATGTTG1192摇结果与讨论2.1摇复方与组分基因表达谱的聚类分析分别对4组芯片数据分析后筛选出SHAM组778个,NSLF组941个,TSA组334个及TGS组9718932高等学校化学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇Vol.33摇个差异基因.采用Cluster3郾0软件及其相匹配的TreeView可视化软件,对差异基因进行层次聚类分析(图1).结果表明,NSLF组、TSA组和TGS组各自聚为一类,表明三者对心肌梗塞具有不同的作用机制.值得注意的是,给药后NSLF组的聚类距离接近SHAM组,表明复方作用后的基因表达与假手术组有最相似的表达趋势,这从调控水平上体现出组分配伍后对基因的调节恢复更接近于假手术组,能使心梗大鼠得到更好的治疗.并且这些基因在复方组的表达并不是单一组分简单相加之和,而是有其特定的调节作用.
生物芯片技术及其在医学上的应用
近年来，随着生物芯片技术的高速发展，其在医学领域中的应用越来越广泛。生物芯片技术是指将微小的生物材料固定在芯片的表面上，以探测生物分子、细胞或组织的一种技术手段。它的优势在于快速、准确、高通量和高灵敏度，被广泛应用于高通量基因分型、蛋白质鉴定、细胞生物分析、药物筛选、立体图像构建等领域。
一、生物芯片技术
生物芯片技术是指使用微电子技术制造出小型芯片，在芯片上通过精巧的设计排列多个生物分子检测元件，可同时进行大量生物学实验，并可快速记录和分析实验结果，极大地提高了实验效率。其中，常用的生物芯片技术有基因芯片技术、蛋白质芯片技术和细胞芯片技术。
1.基因芯片技术
基因芯片技术是基于DNA、RNA的芯片技术，用于同步探测及分析大量基因DNA序列的表达情况，从而了解不同组织、不同状态下基因表达水平的变化，并寻找与特定疾病有关的基因表达水平的差异。它的快速高通量的处理能力可为全基因组表达分析、基因突变筛查、SNP检测、基因亚型鉴定、疾病识别、药物靶标发现和新药研究等提供有力的支持。
2.蛋白质芯片技术
蛋白质芯片技术是利用固相法在玻片、滤膜、微球或微芯片的表面上制备一系列纯化的特异性或全长的蛋白质样品阵列，用于快速大规模地筛选靶蛋白质，分析蛋白质相互作用、酶活性或某些组分与特定蛋白质的结合能力等。它可用于疾病标记物的检测和筛选、蛋白功能鉴定、蛋白特异性鉴别、药物筛选等方面。
3.细胞芯片技术
细胞芯片技术是利用微流控技术制作微小的通道和微型反应器，在芯片上实现细胞的悬浮、培养和观测等操作。它可应用于各种组织细胞的轻松快捷的分离、单细胞的提取、测序和分析，可推广到药物筛选和个性化医疗等领域。
二、生物芯片技术在医学上的应用
生物芯片技术的高通量、高灵敏度、高可靠性和高通用性，使其成为了医学领域中的重要工具，可应用于诊断、预后分析、治疗方案的制定和药物研究等方面。
1.疾病诊断和预后分析
生物技术在中药领域的应用(二)
生物技术在中药领域的应用
生物技术作为一种新兴技术，已经在中药领域得到广泛应用。下面是一些生物技术在中药领域的应用：
1. 基因工程菌生产化合物
生物技术可以利用基因工程菌来生产中药化合物。例如，可以利用大肠杆菌表达中药黄芩中的黄芩素，这样可以大大提高黄芩素的产量，并且可以避免从黄芩根中提取黄芩素的复杂操作。
2. 基因芯片技术
基因芯片技术可以用来研究中药的药效和作用机理。利用基因芯片技术，可以轻松地分析中药在人体细胞中的作用，从而揭示中药的药效和作用机理。
3. 基因序列分析
基因序列分析可以用来研究中药的组成成分和化学结构。利用基因序列分析，可以对中药的各种化学成分进行分析和鉴定，从而更好地理解中药的药效和作用机理。 4. 基因编辑技术
基因编辑技术可以用来改变中药的基因组成，从而改变中药的性质和功效。例如，可以利用基因编辑技术来增加中药的营养价值，或者增强中药的治疗功效。
5. 细胞培养技术
细胞培养技术可以用来生产中药，实现中药的大规模生产和工业化生产。例如，可以通过细胞培养技术生产人参和黄芪等中药。
总之，生物技术在中药领域的应用，可以极大地提高中药的疗效和安全性，为人类健康事业做出更大的贡献。
6. 基因组学研究
基因组学研究可以通过对不同种类中药中的基因组进行比较，发现中药中的活性成分，为中药制药提供更多的基础数据。例如，对含有芫荽醛、巴豆醛等活性成分的香茅基因组进行分析就可以发现这些成分的合成途径以及相关基因。
7. 基因修饰
基因修饰可以通过改变中药的基因组和表观遗传信息，提高中药的药效和治疗效果。例如，通过基因修饰技术，对中药防风进行基因调控，使其产生更多的有效成分，增强了其抗肿瘤、抗癌、抗炎等功效。 8. 细胞凋亡的研究应用
细胞凋亡是一种细胞自我毁灭的过程，当细胞发生癌变或者受到外部物质的损害时，细胞就会通过自我毁灭来维护整体的健康。中药的一些成分能够促进细胞凋亡，对治疗肿瘤等疾病有着重要的作用。生物技术可以用于研究中药的成分如何促进细胞凋亡的过程，进而提高中药的药效。
基因芯片技术的应用
随着生物技术和基因研究的不断进展，基因芯片技术已经广泛应用于生物医学、农业、动植物繁殖、环境保护等领域。本文将从基因芯片技术的原理、应用场景和前景展开阐述，探讨该技术的研究热点和发展趋势。
一、基因芯片技术的原理
基因芯片是一种利用高通量技术同时检测成千上万个基因表达的工具。它通过利用DNA技术将成千上万的基因DNA序列固定在玻璃芯片上，并可检测目标样本中RNA或cDNA的水平。基因芯片技术主要包括以下步骤：
1. 设计芯片：确定目标基因序列，利用计算机技术进行芯片设计，制备出针对目标基因甚至全基因组的芯片。
2. 样本制备：提取RNA或cDNA，并借助反转录技术将RNA转化成cDNA，再对其进行扩增。
3. 杂交：采用特殊设备将目标样本中的cDNA标记为不同颜色的探针，与芯片表面的DNA序列杂交。
4. 扫描和分析：利用激光扫描装置对芯片表面进行扫描，测量复合体的强度，并进行统计和分析。
这样，我们就能够在一张小芯片上探测到成千上万个基因，分析并比较样本之间的差异，从而揭示出基因调控、信号传递和代谢途径等生物学特征。
二、基因芯片技术的应用场景
基因芯片技术的应用范围极广，以下列举几种典型场景：
1. 生物医学
基因芯片技术在生物医学领域中主要用于诊断和治疗基因相关疾病。例如，我们能够将基因芯片应用于肿瘤分型和分级、遗传性疾病的基因筛查、药物研发等方面。此外，基因芯片技术还可以为个体化医学提供技术支持，为临床医生制定精准个体化治疗方案提供重要依据。
2. 农业
基因芯片技术的应用在土地的病虫害监测、作物品种鉴定、转基因食品检测等方面具有重要意义。例如，在生产实践中，农民们经常遭受由于病虫害带来的经济损失，而基因芯片技术能够帮助他们快速诊断设备，确定病虫害的种类和数量，从而更好地进行管理和防范。
3. 环境保护
环境污染问题已经成为全球性的挑战，而基因芯片技术则为环境保护带来了新的手段。例如，通过检测微生物的基因组DNA，我们可以了解大气、水环境以及土壤中的微生物种类组成状况，协助我们了解生态系统的状况和进行环境监测。
