构建融合蛋白提高重组葡萄糖异构酶的催化性能

GST表达融合蛋白载体pGEX-KG大小：5006bp，氨苄青霉素抗性（Amp r），IPTG诱导表达酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994GST分子量：构建pGEX-KG-YFG重组质粒1、分析所感兴趣的基因（your favorite gene, YFG）Primer Premier 5.0软件，分析YFG含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG载体的多克隆位点有重合2、确定合适的双酶切位点NEB网站（）Double Digest Finder软件，查找最佳双酶切组合（下表）NEB双酶切图谱BamHI EcoRI NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. BamHI may exhibit star activity in this buffer.XbaI NEBuffer 3 + BSA at 37°C.At least one enzyme has < 100% activity in thisbuffer, so additional units of enzyme and/or longerincubation time may be necessary.NcoI NEBuffer 3 + BSA at 37°C.SalI NEBuffer 3 + BSA at 37°CXhoI NEBuffer 3 + BSA at 37°C.SmaI XbaINEBuffer 4 + BSA at 25°C withSmaI, then add XbaI and raisetemperature to 37°C.At least one enzyme has < 100% activity in thisbuffer, so additional units of enzyme and/or longerincubation time may be necessary.NcoINEBuffer 4 at 25°C with SmaI, thenadd NcoI and raise temperature to37°C.XhoINEBuffer 4 + BSA at 25°C withSmaI, then add XhoI and raisetemperature to 37°C.SacINEBuffer 4 + BSA at 25°C withSmaI, then add SacI and raisetemperature to 37°C.HindIIINEBuffer 4 at 25°C with SmaI, thenadd HindIII and raise temperature to37°C.At least one enzyme has < 100% activity in thisbuffer, so additional units of enzyme and/or longerincubation time may be necessary.EcoRI NcoI NEBuffer EcoRI at 37°C.3、设计PCR上、下游引物Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物酶切位点外最多含6个碱基3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾3’端至少保证有10个碱基完全配对得分（Rating）大于70[注意]上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA）4、引物合成及保存合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：******************，Tel：81767586）；纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳？；价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存5、PCR扩增YFG模板：质粒10ng/μl稀释少量-20°C保存引物：10pmol/μl（10μM）-20°C保存Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb反应条件（1）预变性94°C 5 min（2）变性94°C 30 s（3）退火待定30 s（4）延伸72°C 待定（5）重复2-5 25-30个循环（6）补平缺口72°C 10 min（7）暂存10°C[注意]退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）－4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min循环数小于30，减少错配琼脂糖电泳检测PCR产物0.8%有效分离范围：10~0.8kb；1.0%有效分离浓度7~0.5kb50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml）100V，30-45min拍照或者紫外灯下切胶回收6、构建pGEX-KG-YFG酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng转化铺平板：Amp r挑单克隆：Amp r（四个菌落足够了）鉴定：小提质粒酶切or菌体PCR7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达（1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根）（2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）（3）冰上放置30min（4）42°C，90s（5）冰上放置2-3min（6）加入300μl LB（无抗生素）（相当于菌体10倍体积的LB），37°C，250rpm，1 h （7）4000rpm，2min，弃上清，其余混匀以后涂平板（Amp r），37°C，过夜（16 h）（8）挑单克隆菌落，5ml LB（Amp r），37°C，250rpm，过夜（16 h）（）稀释10倍、20倍、50倍测定OD600（）选择合适的稀释倍数，5ml菌液，37°C，250 rpm，1 h，测定OD600（7）取100μl菌液加入5ml LB（Amp r）（50倍稀释），37°C，250rpm，过夜（16 h）（8）取500μl菌液加入5ml LB（Amp r）（10倍稀释）（其余菌液4°C保存），测OD600 （9）37°C，250 rpm，2 h（OD600：0.6-0.8），测OD600（10）室温放置20 min（摇床降温，30°C）（11）取100μl作为诱导前对照，冰上放置（12）菌液中加入IPTG，终浓度0.5-1 mM（13）30°C，250 rpm，2 -4h（可做时间梯度），测OD600（14）取100μl作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，加入50μl 1×SDS 上样缓冲液（15）取4ml菌液，12000rpm，离心2min，收集到2ml离心管中（16）加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体（17）超声破碎细胞：超声20s，间隔10s，共3-5次，超声强度200-300W（冰浴）（18）超声后菌液换入一个新1.5ml离心管，4°C，12000rpm，离心5min（19）超声后上清：取25μl上清，加入25μl 2×SDS上样缓冲液（其余上清-80°C保存）（20）超声后沉淀：沉淀加入1ml GST裂解缓冲液重悬，取25μl，加入25μl 2×SDS上样缓冲液（其余沉淀-80°C保存）（21）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min（22）8-10%SDS-PAGE，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀（23）考马斯亮蓝染色[注意]（1）菌液OD值小于1即可（2）诱导时间最好做一个梯度，2-6h（3）诱导温度适当摸索，24°C、30°C（4）IPTG浓度可做梯度，1mM（5）超声条件可视实际情况改变，只要使细菌裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠8、测序确认上海生工生物工程技术服务有限公司（Tel：81767529）测序引物：pGEX-3通用引物测序样品：过夜菌1ml；质粒（浓度大于50ng/μl，10μl）9、中提质粒（Promega）10、表达纯化GST融合蛋白（1）已经转化的菌液，或者重新转化BL21（DE3）pLysS（2）活化：取20μl菌液加入11ml LB（Amp r）（500倍稀释），37°C，250rpm，过夜（16 h）（3）取10ml菌液加入100ml LB（Amp r）（10倍稀释）（剩余菌液4°C保存）（4）37°C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8（OD600小于1.0即可）（5）取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置（6）加入IPTG，终浓度1 mM（7）30°C，250rpm，诱导适当时间（预实验确定）（8）取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，收集菌体，加入100μl 1×SDS上样缓冲液（9）其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20 min，收集细胞（10）每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中（无气泡）（11）超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度200-300W（冰浴）（12）将超声后菌液转移到50ml离心管中，4°C，13000rpm，离心20-30min（13）将上清转移到1个50ml离心管中，取出50μl，加入50μl 2×SDS上样缓冲液（其余上清-80°C保存）（14）将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液（或PBS）重悬，取出50μl，加入50μl 2×SDS 上样缓冲液（其余沉淀-80°C保存）（15）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min（16）8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀（17）考马斯亮蓝染色（18）混匀glutathione sepharose beads（4B）（mixed slurry），取200μl加入15ml离心管中（2份）（19）加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3min，弃上清（20）加入超声后上清液，4°C轻柔摇荡60分钟（或过夜）（横放）（21）4°C，3000rpm，离心3min（22）10ml GST裂解缓冲液洗涤2次（冰上）（23）10ml TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT）洗涤2次（冰上）（24）弃上清，加入1倍柱床体积的TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油），混匀（25）取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE（26）-20°C保存beads11、GST-Pull-down（1）10cm培养皿中，未处理的细胞或者转染的细胞（3-5μg质粒转染10cm培养皿，Cos-7、293T或者其他细胞，转染24h）（2）加入1ml 细胞裂解缓冲液，细胞铲刮下细胞（冰上）（3）将裂解液收集到1.5ml离心管中，振荡30s，冰上放置5min，重复2-3次，充分裂解细胞（4）4°C，12000rpm，离心15min，收集上清（5）测定蛋白浓度，取1mg总蛋白做GST-Pull-down？（6）留30μl作为input对照（input与Pull-down蛋白量约为1/10）（7）其余溶液，加入20μl glutathione sepharose beads（PBS洗涤过），4°C，轻柔振荡20min（8）12000rpm，离心3min（9）收集上清，分为两份，一份加入1-15μg GST结合的beads，另一份加入等量GST-融合蛋白结合的beads，4°C，轻柔振荡60min（10）3000rpm，离心3min，回收上清（11）1ml 细胞裂解缓冲液洗涤3次（12）弃尽上清，加入25μl 2×SDS上样缓冲液（13）煮沸3min，12000rpm，离心3min（14）SDS-PAGE，上样顺序：细胞裂解液input、x、GST、x、GST-融合蛋白（x：LSB）（15）考马斯亮蓝染色或免疫印迹[附录]GST裂解缓冲液（前四个组分配好之后4°C保存，DTT和蛋白酶抑制剂现用现加）常用IP细胞裂解液cleared lysates were incubated for 1.5 h with 3 μg immobilized GST or GST-32。

原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。

原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。

本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。

1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。

表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。

（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。

（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。

常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。

（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。

宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。

2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。

（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。

转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。

（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。

转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。

（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。

通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。

3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。

（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。

②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。

酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。

它利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。

锁钥学说（酶的专一性）：酶与底物分子或底物分子的一部分之间，在结构上有严格的互补关系诱导契合学说：酶分子的构象与底物原来并非恰当吻合，只有当底物分子与酶分子相互碰撞时，可诱导底物的构象发生变化，使其与底物配合，然后才结合形成中间络合物，进而引起底物分子发生相应的化学变化。

酶：由生物体细胞合成的具有选择性催化功能的生物大分子( 包括蛋白质和核酸）单纯酶(simple enzyme)：仅由氨基酸残基构成的酶。

结合酶(全酶)(conjugated enzyme)：由蛋白部分(酶蛋白apoenzyme)和非蛋白部分(辅助因子cofactor)组成辅酶（coenzyme）：与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。

辅基（prosthetic group）：与酶结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。

酶的活性中心：酶蛋白上只有少数氨基酸残基参与酶对底物的结合和催化，这些相关氨基酸残基在空间上比较靠近，形成一个与酶显示活性直接有关的区域，称为酶的活性中心。

必需基团：酶活性中心的一些化学基团为酶发挥催化作用所必须，这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失，称为必需基团。

接触残基(contact residues)：和底物直接接触，参与底物的化学转变，是活性中心的重要组成部分。

辅助残基(auxiliary residues)：使酶与底物相互结合，辅助接触残基。

结构残基（structural residues）：维持蛋白酶形成一种有规则的空间构象非贡献残基（non-contributing residues）：不参与酶的催化功能，对酶活性的显示不起作用结合基团：与底物结合的部位，决定酶的专一性；催化基团：促使底物发生化学变化的部位，决定反应的性质。

结构域：蛋白质肽链中一段较独立的具有完整、致密立体结构的区域。

代谢工程改造微生物合成单萜芳香产品的研究进展摘要：单萜及其衍生物是重要的植物天然产物，且具有多种生物学功能。

该类物质在多个领域中均表现出较高的开发利用价值，目前已被作为优质香精香料广泛应用于食品、饮料、化妆品和医药工业中，市场需求日益增长。

从植物中提取这些单萜芳香产品存在着来源少、含量低和分离困难等缺点，很难满足市场需求。

因此，开发生产单萜芳香产品可再生的微生物资源来补充甚至代替原有的植物资源就具有重要的理论意义和应用价值。

近年来，研究人员利用代谢工程技术已经成功构建了合成单萜芳香产品的微生物细胞工厂，达到了利用微生物合成法生产该类工业产品的目的。

本文主要从菌株改造、发酵优化及产物分离等角度总结了相关产物合成的代谢工程实例，并分析了目前利用代谢工程改造微生物合成单萜芳香产品所面临的瓶颈问题及其可能的解决方法，旨在为构建异源、廉价、高效生产单萜芳香产品的微生物细胞工厂并最终实现其绿色制造提供参考。

关键词：代谢工程，单萜，单萜衍生物，微生物细胞工厂，底盘从代谢工程概念的首次提出到现在的30年左右的时间里，在分子生物学、基因组学、生物化学和基因工程等相关学科和技术的推动下，经过几代人的努力，目前代谢工程已经形成了一套比较完备的理论体系和技术方法。

现阶段，代谢工程技术的基本路线就是首先利用先进的生物理论和技术对细胞的代谢途径及调控网络进行分析并提出合理的设计策略，再结合基因重组技术对相关途径和网络进行修饰、改造、扩展或者引入，从而实现改变细胞特性或者提高特定代谢产物产量的目的。

近年来，越来越多的科研人员投身于利用代谢工程技术构建微生物细胞工厂的研究工作。

所谓的微生物细胞工厂如同一般意义上的工厂一样[1]，由微生物细胞作为制造产品的生产厂房，代谢通路担任生产线，培养基提供生产原料和动力来源，而细胞内复杂的反馈和调控机制则是生产管理系统，工厂内各个部门之间密切配合，最终目的是实现目标产品产量的最大化。

这其中最热门的研究就是利用代谢工程技术在不同微生物底盘中成功构建了包括单萜及其衍生物在内的多种植物天然产物的生物合成途径，如柠檬烯、紫苏醇、香叶醇、芳樟醇等。