实验目的
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一、 实验目的
1、 通过对比实验来研究哪种方法能达到最佳的实验效果。
2、
建议学生对所取的菠菜与酒精的量的比例作一研究（可以采用10g菠菜叶与5ml无水酒
精组合、10g菠菜叶与10ml无水酒精组合、5g菠菜叶与5ml无水酒精组合、5g 菠菜叶
与10ml无水酒精组合等）；
3、 接采用载玻片的一侧蘸取匀浆，压在滤纸条上
二、 实验原理
叶绿体中的色素溶解于有机溶剂酒精或丙酮，根据此原理可以将叶绿体中的色素
提取出来，形成色素液。
色素在层析液中的溶解度不同，因而随层析液在滤纸上扩散的速度不同，溶解度
越高，扩散速度越快，溶解度越低，扩散速度越慢。根据此原理使各种色素分离开来。
老嫩适中且浓绿的叶，叶绿素含量比较多。
三、 基本操作训练：
【操作步骤】
1、菠菜色素的提取
取2g新鲜菠菜叶，与10mL甲醇拌匀研磨5分钟，弃去滤液。残渣用10mL的石油醚-甲醇（3:2）
混合液进行提取，共提取两次。合并液用水洗后弃去甲醇层，石油醚层进行干燥、浓缩。
2、薄层层析
将上述的浓缩液点在硅胶G的预制板上，分别用石油醚-丙酮（8:2）和石油醚-乙酸乙酯（6:4）
两种溶剂系统展开，经过显色后，进行观察并计算比移值。
3、柱层析
取3g中性氧化铝进行湿法装柱。填料装好后，从柱顶加入上述浓缩液，用石油醚-丙酮（9:1）、
石油醚-丙酮（7:3）和正丁醇-乙醇-水（3:1:1）进行洗脱，依次接收个色素带，即得胡萝卜素（橙
黄色溶液）、叶黄素（黄色溶液）、叶绿素a（蓝绿色溶液）以及叶绿素b（黄绿色溶液）。
【实验流程】
四、实验关键及注意事项
过滤 萃取 洗涤、蒸馏
萃取液
菠菜 菠菜汁
浸膏
薄层层析
柱层析
Rf值
色带、溶液
研磨 石油醚—甲醇 水
注意薄层色谱、柱层析实验操作要点的掌握和应用
五、提问纲要
试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？
六、主要试剂用量、规格
新鲜菠菜2g、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇10ml、硅胶G、中性氧化铝
七、时间分配及控制
计划安排：4h
1滤液过稀
提取色素液操作时，方法欠妥，滤液黄绿色，浓度稀，实验效果欠
佳，只有深绿透明的滤液，才能达到好的分离效果。
1.1 绿叶材料选用不当，有关资料上介绍的绿叶材料，不都是效果最
优的，不能盲从。选用老叶、革质、蜡质的叶片，就难以研磨充分。宜
选老嫩适中且浓绿的叶，如：菠菜、青菜、天竺葵、马铃薯、苷薯的叶。
1.2 所选叶片剪得不碎，加之研磨不充分。实验操作时，尽可能剪碎
叶片，可把几张叶片叠放一起，先剪成丝，再一起横着剪碎，这样省时
省力。加入少许SiO2，CaCO3且迅速充分研磨，研120转左右，使研磨
液呈匀浆状为好，这样各种色素才能充分溶解在提取液里(丙酮或无水乙
醇)。
1.3 过滤时，漏斗基部的脱脂棉太多(或"尼龙布"不是单层)。过滤时，
使用脱脂棉尽可能少，便于得到深绿色的透明滤液，能阻挡住叶渣即可。
切忌用过滤纸过滤，否则色素被吸收，降低滤液中色素的浓度。
1.4加入提取液过多，导致滤液中色素含量低。对策是将稀提取液和
新添碎叶放入研钵再研。此法也是上述的补救措施。
2 滤液不纯
提取液含有过多的杂质或变质，会严重影响实验结果。
2.1 叶片表面含有水珠或叶片内含水量过高，降低提取液对色素的抽
提效率，且影响层析。对策是用吸水纸或脱脂棉擦去叶片表面水珠，不
用过嫩的叶，必要时加少许脱水剂硫酸钠。
2.2 加入过多的二氧化硅和碳酸钙，这样既影响过滤，又使滤液中有
颗粒物，降低滤液浓度。对策是控制用量，一般各加0.1g。(SiO2起研磨
粉作用，破坏细胞结构。CaCO3与有机酸反应，是叶绿素的保护剂)。
2.3 滤液存放时间过长，光线和空气的作用，缓慢的有机反应，将溶
解的色素破坏，溶液变为褐色，即叶绿素卟啉环中的镁可被H+或Cu2+
所取代。液泡膜破裂流出的鞣酸、草酸等有机酸产生的H+置换了叶绿素
中的镁后，可以形成褐色的去镁叶绿素。
3 定性滤纸不合要求
3.1定性滤纸久露空气中，已吸湿。简便易行的做法是放在酒精灯火
焰上方快速烘干。平时注意用塑料袋封存，随用随取。
3.2定性滤纸有皱折，或被手弄脏，影响层析。须换新滤纸。
4 滤液线画得过细
画好滤液线既是实验的难点，又是实验的关键，否则现象不明显。
4.1滤液线画得不匀实。原人教版教材上讲越细越齐效果越好，新老
教材上都讲画滤液细线，极易产生误导。导致学生画的滤液线过浅，线
上色素量太少，其实最关键的是画线后绿色较深。实际操作中，每画一
次、用电吹风吹干，可重复几次，便于积累色素成分，力求深、齐、匀，
线粗1～2mm，可用医院验血时用来吸血的毛细吸管画。
4.2 滤液线画得距滤纸剪角端太近，易使色素溶解于层析液中，不能
在滤纸条上向上扩散，距剪角端1.5cm处画线，层析速度适中，效果最
佳。
5 层析液欠佳，层析操作欠妥
层析液的配制是实验成败的又一关键，层析操作是实验的另一难点。
5.1 有关资料上介绍的层析液配方，效果远远不及教材上提供的以石
油醚为主的配方。
5.2 层析时，滤纸条与沾有层析液的烧杯内壁紧贴，造成色素部分溶
解。可将滤纸条画线端朝下，轻轻地插入到层析液中，滤纸条斜靠着烧
杯内壁。此外，烧杯中层析液的量以约1cm高为好。分组实验时，层析
液可重复使用，前一组学生实验结束后不可洗烧杯，否则烧杯内壁有水，
会影响后一组学生实验效果。
6冬季气温低等
冬季气温低，分子扩散速度慢，可用酒精灯微微加热加快层析速度。
总之，在进行该实验时，应规范实验操作程序，培养学生严谨作风，
严格挑选配制层析液的配方，抓住实验的难点画滤液线和层析操作，仔
细观察，深刻理解色素分离的内涵，才能走出实验的误区，获得滤纸条
上出色的展现四条不同色素带的明显实验效果。
1．提取液的改进
除丙酮外，也可用酒精替代，结果大致相同。和酒精相比，丙酮有一定毒性，因而不
妨换一下；另外一种提取液是：在加入丙酮2～3ml后，再加入2ml石油醚，可以提
高胡萝卜素提取效果，色素带分离现象更明显。
2．层析液的改进
层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂，教材上给出了两种层析液配方：一种是93号
汽油，另外一种为20份石油醚，2份丙酮，l份苯混合而成。采用下列配方实验效果
也不错：
（1）四氯化碳加少许无水硫酸钠；
（2）95％的酒精；
（3）9份95％酒精加1份苯；
（4）20份汽油，2份丙酮，2份石油醚，1份苯。
其中，采用配方（4）效果最好，配方（2）经济而且简便一些，但效果有一定折扣。
3．设立对照实验
设立一个空白对照组，在其他条件完全相同的情况下，一个画滤液细线，而另外
一个不画，结果进行对照，消除“不同色带是层析液在滤纸上扩散后留下的颜色”的
怀疑。这样同时也培养严谨的实验作风，体现生物学科研的基本原则。
为了强调不要使层析液浸没滤液细线的意义，也可以设立这样一个浸没滤液细线
的对照组，结果会发现色素被溶解下来，而无法分离。
4．实验方法探索
本实验不仅可用条形滤纸进行层析，还可以采用圆形滤纸层析办法：取平面培养
皿1只，铺一层细纱(厚约0．5cm)，将滤纸剪为圆形放人培养皿中，在圆形滤纸中央
点上滴2滴色素提取液，静置约1min，然后依次滴35滴层析液，每滴中间间隔30s，
然后盖上培养皿盖，几分钟后，可以观察结果会得到近似同心圆的4个色素环，由内
而外分别是黄绿色、蓝绿色、黄色、橙黄色。此实验关键有两点：一是几次滴液体要
在同一点上，否则不能形成圆环；二是滴层析液的量和时间要掌握好，否则会影响效
果，甚至失败。
