MMFSCNJ出口食品小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法

食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检测技术研究作者：陈学强来源：《现代食品·下》2017年第04期摘要：小肠结肠炎耶尔森氏菌是重要的食源性致病菌，如何有效地检测该菌是预防和减少食品安全问题的关键环节。

本文较为系统地介绍了利用常规分离鉴定、免疫学、分子生物学和生物质谱等技术手段检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，最后对小肠结肠炎耶尔森氏菌检测技术的现状进行分析，并对发展趋势进行了预测。

关键词：耶尔森氏菌；分离鉴定；免疫学技术；分子生物学技术；生物质谱技术Abstract：Yersinia enterocolitica is an important food borne pathogen， how to effectively detect the bacteria is the key to prevent and reduce food safety issues. This paper systematically introduces the method of using conventional isolation and identification， immunology， molecular biology and biological mass spectrometry techniques to detection of Yersinia enterocolitica systematically， analyses the status of Yersinia enterocolitica detection techniques and predicts the development of future finally. enterocolitis Yersinia enterocolitica， the final status of enterocolitis Yersinia enterocolitica detection technology are analyzed， and the development trend.Key words：Yersinia； Isolation and identification； Immunological technique； Molecular biology technology； Biological mass spectrometry中图分类号：TS207.4小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）是一种广泛分布的细菌，可存在于生鲜蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品等食品中。

《食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》编制说明一、标准起草的基本情况2011年原卫生部（现国家卫生计生委）牵头组织开展食品卫生微生物学标准的修订工作，小肠结肠炎耶尔森氏菌的测定方法被列入修订。

本标准起草单位为江苏省疾病预防控制中心，起草人包括袁宝君、唐震、沈赟、庄凌、乔昕、王艳梅、巢国祥、徐勒、郑东宇。

二、标准的重要内容及主要修改情况（一）标准主要修改的内容1. 修改了标准的中文名称；2. 修改了典型菌落的形态描述；3. 删除了生化鉴定中的商品化名称；4. 修改了附录A。

（二）修改依据及说明1．修改了标准的中文名称按照食品安全国家标准编制的规范要求将标准的中文名称进行了修改，将原来的《食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》修改为《食品安全国家标准食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》。

2．修改了典型菌落的形态描述根据征求意见函中专家建议及结合2008版国标近几年的使用情况,在本次修订过程中增加了CIN-1琼脂平板的典型菌落形态描述，形态描述结合FDA BAM( 2007)及GB/T 4789.8-2008的描述方式由原来的“红色牛眼状菌落”修改为“深红色中心，周围具有无色透明圈（红色牛眼状菌落）,菌落大小为1-2mm”，通过对典型菌落形态的详细描述有利于国将“Vitek GNI 全自动微生物生化分析仪”修改为“生化鉴定试剂盒标使用者在分离该菌的过程中能够较易查找并发现目标菌，提高对本菌的检出率。

3. 删除了生化鉴定中的商品化名称或全自动微生物生化鉴定系统删除“4.11 API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK GNI+生化鉴定卡”。

传统的微生物鉴定主要参考《伯杰式细菌鉴定手册》和《真菌鉴定手册》，鉴定过程繁琐耗时长，容易出错，对经验要求非常高。

商品化的自动微生物系统有效地解决了这个问题，目前自动微生物鉴定系统从原理上包括以下几种：1)基于表型的鉴定方法；2)基于基因型的鉴定方法； 3)基于蛋白的鉴定方法；三类方法各有优缺点，理论上不冲突，应该互为补充，基于系统生化仍是国际上微生物鉴定的金标准，所以本标准仍然将基于表型的鉴定方法之一的系统生化鉴定作为微生物鉴定的确证方法。

出口食品小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法1.适用范围本方法适用于出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁中耶氏菌检验，其他食品可参照使用。

2.培养基2.1.改良的磷酸盐缓冲液磷酸氢二钠8.23g；磷酸二氢钠(含1个结晶水) 1.20g；氯化钠 5.00g；山梨醇10.00g；胆盐(3号) 1.50g；蒸馏水1000mL；将前三种成分溶于水中，再加入后两种成分，溶解后调至pH7.6，分装于500mL广口玻璃瓶内，每瓶225mL，高压灭菌121℃15min。

2.2.改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤(modified yeast extract-rose bengal broth)2.2.1.基础液磷酸二氢钾0.508g；磷酸氢二钠11.21g；酵母浸汁 5.00g；氯化钠 1.00g；硫酸镁(含7个结晶水) 0.01g；蒸馏水770mL；将上述各成分溶于蒸馏水中，加热使之完全溶解，调至pH8.0，121℃高压灭菌15min。

2.2.2. 40g/L山梨糖水溶液：100.00mL。

2.2.3. 10g/L丙酮酸钠水溶液：100.00mL。

2.2.4. 4g/L孟加拉红水溶液：10.00mL。

2.2.2，2.2.3溶液流通蒸汽加热0.5h灭菌，2.2.4溶液过滤除菌，将灭菌过的此三种溶液加到灭菌、冷却的基础液中，调至最终pH为8.0，以无菌操作分装于18mm×180mm灭菌的试管中，每管8mL，4℃冰箱保存备用。

2.3.含吐温80的麦康凯琼脂蛋白胨12.00g；月示蛋白胨(proteose peptone) 3.00g；乳糖10.00g；胆盐(3号) 1.50g；氯化钠 5.00g；吐温80(Tween 80) 10.00g；氯化钙(无水) 0.20g；中性红0.03g；结晶紫0.001g；琼脂18.00g；蒸馏水1000mL；将琼脂于800mL蒸馏水中加热溶化，以50mL蒸馏水将吐温80稀释，再将其他各成分(指示剂除外)加入150mL蒸馏水中，加热使之完全溶解。

食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验1 范围本标准规定了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的检验方法。

本标准适用于食品和食源性疾病样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。

2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB／T 4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验3设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 冰箱：2℃～5℃。

3.2 恒温培养箱：26℃±l℃、36℃±l℃。

3.3 显微镜：l0×～l00×。

3.4 均质器或灭菌乳钵。

3.5 天平：感量0.1g。

3.6 灭菌试管：16 mm×160 mm、15 mm×100 mm。

3.7 灭菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。

3.8 灭菌锥形瓶：200 mL、500 mL。

3.9 灭菌培养皿：直径90 mm。

3.10全自动细菌生化鉴定仪，如VITEK。

4培养基和试剂4.1 改良磷酸盐缓冲液：见第A.1章。

4.2 CIN-1培养基：见第A.2章。

4.3 改良Y培养基：见第A.3章。

4.4 改良克氏双糖培养基：见第A.4章。

4.5 糖发酵管：见第A.5章。

4.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基：见第A.6章。

4.7 半固体琼脂：见第A.7章。

4.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V—P试验用]：见第A.8章。

4.9 碱处理液：见第A.9章。

4.10 尿素培养基：见第A.10章。

4.11 API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK GNI+生化鉴定卡。

5 检验程序小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。

⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌检验（⾷品微⽣物学检验）⾷品安全国家标准⾷品微⽣物学检验⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌检验1范围本标准规定了⾷品中⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌(Y e r s i n i a e n t e r o c o l i t i c a)的检验⽅法三本标准适⽤于⾷品中⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌的检验三2设备和材料除微⽣物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1冰箱:0?~4?三2.2恒温培养箱:26??1?⼆36??1?三2.3显微镜:10倍~100倍三2.4均质器三2.5天平:感量0.1g三2.6灭菌试管:16mm?160mm⼆15mm?100mm三2.7灭菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)⼆10m L(具0.1m L刻度)三2.8锥形瓶:200m L⼆500m L三2.9灭菌平⽫:直径90mm三2.10微⽣物⽣化鉴定试剂盒或微⽣物⽣化鉴定系统三3培养基和试剂3.1改良磷酸盐缓冲液:见A.1三3.2 C I N-1培养基(C e p u l o d i n I r g a s a nN o v o b i o c i nA g a r):见A.2三3.3改良Y培养基(A g a rY,M o d i f i e d):见A.3三3.4改良克⽒双糖培养基:见A.4三3.5糖发酵管:见A.5三3.6鸟氨酸脱羧酶试验培养基:见A.6三3.7半固体琼脂:见A.7三3.8缓冲葡萄糖蛋⽩胨⽔[甲基红(M R)和V-P试验⽤]:见A.8三3.9碱处理液:见A.9三3.10尿素培养基:见A.10三3.11营养琼脂:见A.11三3.12⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌诊断⾎清三4检验程序⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌检验程序见图1三图1⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌检验程序5操作步骤5.1增菌以⽆菌操作取25g(或25m L)样品放⼊含有225m L改良磷酸盐缓冲液增菌液的⽆菌均质杯或均质袋内,以8000r/m i n均质1m i n 或拍击式均质器均质1m i n三液体样品或粉末状样品,应振荡混匀三均质后于26??1?增菌48h~72h三增菌时间长短可根据对样品污染程度的估计来确定三5.2碱处理除乳与乳制品外,其他⾷品的增菌液0.5m L与碱处理液4.5m L充分混合15s三5.3分离将乳与乳制品增菌液或经过碱处理的其他⾷品增菌液分别接种于C I N-1琼脂平板和改良Y琼脂平板,26??1?培养48h?2h三典型菌落在C I N-1上为深红⾊中⼼,周围具有⽆⾊透明圈(红⾊⽜眼状菌落),菌落⼤⼩为1mm~2mm,在改良Y琼脂平板上为⽆⾊透明⼆不黏稠的菌落三5.4改良克⽒双糖试验分别挑取5.3中的可疑菌落3个~5个,分别接种于改良克⽒双糖铁琼脂,接种时先在斜⾯划线,再于底层穿刺,26??1?培养24h,将斜⾯和底部皆变黄且不产⽓的培养物做进⼀步的⽣化鉴定三5.5尿素酶试验和动⼒观察⽤接种环挑取⼀满环5.4得到的可疑培养物,接种到尿素培养基中,接种量应⾜够⼤,振摇⼏秒钟, 26??1?培养2h~4h三将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中,于26??1?和36??1?培养24h三将在26?有动⼒⽽36?⽆动⼒的可疑菌培养物划线接种营养琼脂平板,进⾏纯化培养,⽤纯化物进⾏⾰兰⽒染⾊镜检和⽣化试验三5.6⾰兰⽒染⾊镜检将纯化的可疑菌进⾏⾰兰染⾊三⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌呈⾰兰⽒阴性球杆菌,有时呈椭圆或杆状,⼤⼩为(0.8µm~3.0µm)?0.8µm5.7⽣化鉴定5.7.1从5.5中的营养琼脂平板上挑取单个菌落接种⽣化反应管,⽣化反应在26??1?进⾏三⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌的主要⽣化特征以及与其他相似菌的区别见表1三表1⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌与其他相似菌的⽣化性状鉴别表项⽬⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌Y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a中间型耶尔森⽒菌Y e r s i n i ai n t e r m e d i a弗⽒耶尔森⽒菌Y e r s i n i af r e d e r i k s e n i i克⽒耶尔森⽒菌Y e r s i n i ak i r s t e n s e n i i假结核耶尔森⽒菌Y e r s i n i ap s e u d o t u b e r c u l o s i s⿏疫耶尔森⽒菌Y e r s i n i ap e s t i s动⼒(26?)+++++-尿素酶+++++-V-P试验(26?)+++---鸟氨酸脱羧酶++++--蔗糖d++---棉⼦糖-+---d⼭梨醇++++--⽢露醇++++++⿏李糖-++--+注:+阳性;-阴性;d有不同⽣化型三5.7.2如选择微⽣物⽣化鉴定试剂盒或微⽣物⽣化鉴定系统,可根据5.6镜检结果,选择⾰兰阴性球杆菌菌落作为可疑菌落,从5.5所接种的营养琼脂平板上挑取单菌落,使⽤微⽣物⽣化鉴定试剂盒或微⽣物⽣化鉴定系统进⾏鉴定三5.8⾎清型鉴定(选做项⽬)除进⾏⽣化鉴定外,可选择做⾎清型鉴定三在洁净的载玻⽚上加⼀滴O因⼦⾎清,将待试培养物混⼊其内,使成为均⼀性混浊悬液,将玻⽚轻轻摇动0.5m i n~1m i n,在⿊⾊背景下观察反应三如在2m i n内出现⽐较明显的⼩颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另⽤⽣理盐⽔作对照试验,以检查有⽆⾃凝现象;具体操作⽅法可按G B4789.4中沙门⽒菌O因⼦⾎清分型⽅法进⾏三6结果与报告综合以上及⽣化特征报告结果,报告25g(或25m L)样品中检出或未检出⼩肠结肠炎耶尔森⽒菌三附录A培养基和试剂A.1改良磷酸盐缓冲液A.1.1成分磷酸氢⼆钠8.23g磷酸⼆氢钠1.2g氯化钠5.0g三号胆盐1.5g⼭梨醇20.0gA.1.2制法将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏⽔中,再加⼊三号胆盐及⼭梨醇,溶解后校正p H⾄7.6,分装试管,于121?⾼压灭菌15m i n,备⽤三A.2C I N-1培养基A.2.1基础培养基:胰胨20.0g酵母浸膏2.0g⽢露醇20.0g氯化钠1.0g去氧胆酸钠2.0g硫酸镁0.01g琼脂12.0g蒸馏⽔950m L校正p H⾄7.5?0.1,将基础培养基于121?⾼压灭菌15m i n,备⽤三A.2.2I r g a s a n(⼆氯苯氧氯酚):可⽤95%的⼄醇作溶剂,溶解⼆苯醚,配成0.4%的溶液来替代I r g a s a n,待基础培养基冷⾄80?时,加⼊1m L混匀三A.2.3冷⾄50?时,加⼊:中性红(3.0m g/m L)10.0m L结晶紫(0.1m g/m L)10.0m L头孢菌素(1.5m g/m L)10.0m L新⽣霉素(0.25m g/m L)10.0m L最后不断搅拌加⼊10.0m L的10%氯化锶,倾注平⽫三A.3改良Y培养基A.3.1成分蛋⽩胨15.0g氯化钠5.0g乳糖10.0g草酸钠2.0g去氧胆酸钠6.0g三号胆盐5.0g丙酮酸钠2.0g孟加拉红40.0m g⽔解酪蛋⽩5.0g琼脂17.0g蒸馏⽔1000m LA.3.2制法将A.3.1中成分混合,校正p H⾄7.4?0.1三于121?⾼压灭菌15m i n,待冷⾄45?左右时,倾注平⽫三A.4改良克⽒双糖培养基A.4.1成分蛋⽩胨20.0g⽜⾁膏3.0g酵母膏3.0g⼭梨醇20.0g葡萄糖1.0g氯化钠5.0g柠檬酸铁铵0.5g硫代硫酸钠0.5g琼脂12.0g酚红0.025g蒸馏⽔1000m LA.4.2制法将酚红以外的各成分溶解于蒸馏⽔中,校正p H⾄7.4三加⼊0.2%的酚红溶液12.5m L,摇匀,分装试管,装量宜多些,以便得到⽐较⾼的底层三121?⾼压灭菌15m i n,放置⾼层斜⾯备⽤三A.5糖发酵管A.5.1成分⽜⾁膏5.0g。

小肠耶尔森氏菌及其检测方法一、小肠耶尔森氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌，简称小肠耶尔森氏菌，学名Yersinia enterocolitica，是革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为1-3.5×0.5-1.3μm，多单个散在，有时排列成短链或成堆。

该菌是能在冷藏温度下生长的少数几种肠道致病菌之一，在4℃条件下能保存和繁殖。

小肠耶尔森氏菌在自然界分布很广：（1）作为重要的食源性致病菌，该菌在生的蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙拉、牡蛎、蛤和虾等食物中也分布很广，很多国家都已将该菌列为进出口食品的常规检测项目。

（2）该菌也存在于环境中，如湖泊、河流、土壤和植被。

（3）该菌天然寄居在多种动物体内，如鼠、狗、猫、山羊、家畜等，在港湾周围，许多鸟类包括水禽和海鸥可能是带菌者。

小肠耶尔森氏菌通过污染食物（牛奶、猪肉等）和水，经粪—口途径感染或因接触染疫动物而感染，易染人群为婴幼儿。

典型症状常为发热、腹痛、腹泻和呕吐。

有的引起反应性关节炎，还有少数患者可表现为脑膜炎、肺炎、败血症即血液系统感染，尽管少见，但死亡率较高。

二、小肠耶尔森氏菌检测方法1.细菌培养法本菌生长温度为30-37℃，但在22-29℃才能使本菌的某些特性出现。

4℃时能保存和繁殖。

本菌世代时间长，最短亦需40分钟左右。

在SS或麦康凯琼脂上于25℃经24小时培养，菌落细小，至48小时直径才增大成0.5-3.0mm。

菌落圆整、光滑、湿润、扁平或稍隆起，透明或半透明；在麦康凯琼脂上菌落淡黄色，如若微带红色，则菌落中心的红色常稍深。

本菌在肉汤中生长呈均匀混浊，一般不形成菌膜。

2.生化鉴定法从营养琼脂平板上挑取单个菌落做生化实验，所有的反应皆在26℃±1℃培养。

主要生化特性如下：①动力（26℃）阳性；②素酶阳性；③VP试验（26℃）阳性；④鸟氨酸脱羧酶阳性；⑤蔗糖有不同生化型；⑥棉子糖阴性；⑦山梨醇阳性；⑧甘露醇阳性；⑨鼠李糖阴性。

3.血清凝集法小肠结肠炎耶尔森氏菌的抗原结构较为复杂，现已知有84个O抗原因子和19个Ｈ抗原因子，在同一血清型的菌株中，可含两种或更多的O抗原。

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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。