上海苏净实业有限公司生物安全柜系列

生物安全柜介绍1. 概述生物安全柜是生物实验室的一级隔离屏障设备。

所谓生物安全柜，实质就是一种负压过滤排风柜（见有关标准：YY0569、JG170、ANSI/NSF49、EN12469对生物安全柜作出的定义），其本身可分为部分隔离和完全隔离。

生物危害的隔离措施通常由一次隔离和二次隔离措施实现。

采用生物安全柜的目的是为了把生物实验室污染区域及污染风险降到最低，以实现一次隔离目的。

为防止生物危害从实验室漏到外部环境，把实验室和外界隔断，即为二次隔离，二次隔离的目的是防止实验室外的人被生物感染。

由于生物危险的事例几乎都发生在实验室内，一次隔离措施越严格、充分，则可降低实验室污染的风险，从源头上抑制生物危害的发生。

由于目前生物实验室以及医院临床医学检验和研究应用最广的是Ⅱ级生物安全柜，本文将着重对Ⅱ级生物安全柜进行阐述。

2. 依据GB 19489—2007《实验室生物安全通用要求》；《实验室生物安全手册》（WHO）；ISO 15190—2003《医学实验室—安全要求》；YY0569-2005 生物安全柜；JG170-2005 生物安全柜；JGxxx-xxxx 洁净工作台（报批稿）。

3. 生物安全柜的特殊防护设计3.1 生物安全柜的级别类型和适用范围生物安全柜分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共三个等级，其中：Ⅱ级生物安全柜又细分为A1、A2、B1、B2四个类型，A1、A2、B1分别为循环气流结构，B2为气流100%直接排放结构。

实验领域对于A1类生物安全柜应用极少，其流入气流流速相对较低，对人员防护隔离能力相对较低，不能满足生物危害的高风险场合应用。

通常，A1类生物安全柜仅用于医学教学或对已知的低风险病原体操作。

B1类生物安全柜的排风气流流量是系统总风量的70%，尚有30%循环气流，这样的特性决定了它仍然不能用于化学毒性场合。

常用的是Ⅱ级生物安全柜中的A2、B2类生物安全柜。

生物安全柜应用气流围场、空气负压、物理过滤、风险预警及联锁控制等综合隔离技术，实现生物危害防护，实现保护人员或保护人员、保护实验对象、保护环境目的。

生物安全柜赛默飞1086s参数生物安全柜是用于在实验室环境中处理有害或易感染人员的生物物质的设备。

赛默飞1086s是一款具有先进技术和高效性能的生物安全柜。

本文将介绍赛默飞1086s的参数和特点。

首先，赛默飞1086s采用了先进的微电脑控制系统，可以实现温度、湿度、风速等参数的精确控制。

这使得在生物实验中能够更加精确地模拟自然环境，为实验提供更加可靠的数据支持。

其次，赛默飞1086s具有三种风速可调节功能，分别是100级、中速和静音模式。

这种设计能够满足不同实验条件下对风速的需求，确保实验环境的稳定性和安全性。

此外，赛默飞1086s还采用了独特的负压设计，可以有效防止生物物质在实验过程中外泄，提高了实验室环境的安全性和可靠性。

赛默飞1086s还具有UV灯杀菌功能，可以有效杀灭实验台面和实验室空气中的细菌和病毒。

这种设计可以有效保护实验人员的安全，降低实验室污染的风险。

此外，赛默飞1086s还具有低噪音设计，实验过程中几乎没有噪音，保障了实验人员的工作环境。

赛默飞1086s采用了先进的风道设计，能够实现高效的空气净化和过滤功能。

这种设计能够有效减少实验室空气中的有害气体和微粒物质，保护实验人员的健康。

赛默飞1086s还具有多种安全报警功能，如漏气报警、电机故障报警、风速不足报警等。

这些设计能够及时发现和处理实验过程中可能出现的安全问题，保障实验人员的安全。

总的来说，赛默飞1086s是一款具有先进技术和高效性能的生物安全柜。

它采用了先进的控制系统、风速调节功能、负压设计、UV灯杀菌功能、低噪音设计、高效的空气净化和过滤功能，多种安全报警功能等。

这些设计能够有效保障实验人员的安全，降低实验室污染的风险，为实验提供更加可靠的数据支持。

BHC-1300IIA/B2生物洁净安全柜生物洁净安全柜是当今微生物实验室之必要品，特别是那些对操作者需要采取保护措施的场合。

如医疗、制药、科研等进行细菌培养时提供既无菌无尘又工作安全的环境。

特点：1 气幕式隔离设计，防止内外交叉污染,气流70%外排30%内循环，负压垂层流。

2 上下移动玻璃门，可任意定位，易于操作，并能完全关闭以便杀菌，定位高度限位报警提示。

3 工作区电源输出插座,配备装用防水插座和排污接口为操作者提供极大方便4 排风处设有专用过滤器，控制排放污染.5 工作环境采用优质304不锈钢，光滑、无缝、无死角，可轻松彻底消毒，可防止腐蚀剂和消毒剂的侵蚀。

6 采用LED液晶面板控制。

7 配备高效过滤器失效报警功能。

8 工作区气流外泻报警。

BHC-1300IIA/B3生物洁净安全柜生物洁净安全柜式当今微生物实验室之必要品，特别是那些对操作者需要采取保护措施的场合。

如医疗、制药、科研等进行细菌培养时提供既无菌无尘又工作安全的环境。

特点：1 恒定的气流100%排放，负压垂层流。

2 上下移动玻璃门，可任意定位，易于操作，并能完全关闭以便杀菌，定位高度限位报警提示。

3 工作区电源输出插座4 高效过滤器适合过滤空气中的微粒、烟雾和微生物等。

两层过滤为99.999%以上的HEPA滤膜。

5 工作环境采用优质304不锈钢，光滑、无缝、无死角，可轻松彻底消毒，可防止腐蚀剂和消毒剂的侵蚀。

6 采用LED液晶面板控制。

7 配备高效过滤器失效报警功能。

最大功耗600W重量350KG工作尺寸1340*650*600mm外形尺寸1540*800*1950mm高效过滤器规格及数量1335×600×38×1mm 荧光灯/紫外灯规格及量16W*2/15W*2。

BHC-1300IIA/B3型生物安全柜验证方案及报告验证方案批准验证小组人员名单目录1.验证概述 (1)2.验证目标 (1)3.验证方案适用范围 (1)4.验证依据、验证标准 (1)5.验证参与部门及责任 (1)6.验证指令 (1)7.8.2、仪器的用途和使用要求 (5)3、安装确认................................................. (5)4、性能确认 (5)5、验证结论及评价 (7)6、验证报告批准书 (8)1.验证概述BHC-1300IIA/B3型生物安全柜由上海苏净实业有限公司制造，本生物安全柜安装于六车间无菌室洁净级别为万级的阳性对照间中。

按照我公司的安排对新购BHC-1300IIA/B3型生物安全柜进行验证，具体验证过程分为安装确认（IQ）、运行确认（OQ）和性能确认（PQ）三个过程。

2.验证目标按确认方案所提供安装、运行和性能确认项目进行检查核对确认，保证BHC-1300IIA/B3型生物安全柜符合规定并且能满足微生物实验的使用要求。

确保其适用于我公司产品的质量检验。

3. 验证方案适用范围本方案适用于我公司BHC-1300IIA/B3型生物安全柜验证。

主要确认范围和内容为：生物安全柜预确认、生物安全柜安装确认所需文件资料确认、生物安全柜验证用仪器仪表的确认、生物安全柜设备工作条件的安装确认、生物安全柜运行确认所需文件资料确认、生物安全柜所需设备仪器确认、生物安全柜控制和显示确认、生物安全柜风速确认、生物安全柜悬浮粒子测试确认、生物安全柜沉降菌测试确认。

4．验证依据、验证标准：《中国药典》（2010年版）。

II 级生物安全柜YY0569-2011。

5．验证参与部门及责任6 验证指令6.1 验证支持文件生物安全柜使用、维护、保养操作规程BHC-1300IIA/B3型生物安全柜说明书《验证管理制度》6.2 验证进度、时间安排：见下表6．2验证内容：本验证共分预确认、安装确认、操作确认、性能确认四部分进行验证。

AC2-4S1生物安全柜和生物安全柜价格AC2-4S1生物安全柜 标题：AC2-4S1生物安全柜Airstream® A2型二级生物安全柜 中国YY 0569和欧盟EN 12469标准独立检测及认证证书 标配两块ULPA 超高效过滤器,针对0.12μm 颗粒系可以达到99.999%截流效率 最新型SentinelTM 微电脑系统，过滤器寿命显示 高品质高风量风机，自动风量风压平衡补偿 背板及侧壁一体成型，圆弧角，操作腔四面负压环绕保护 人体工程学5度倾斜角设计，增加操作舒适性 舒适型宽体搁手架设计，降低工作疲劳强度 柜体外部IsocideTM 抗菌涂层可抑制细菌在表面滋生 前进气孔与操作台面为整块钢板一体成形，无接缝 ESCO 独有的DynamicTM 负压防泄漏设计 负压腔环绕整个可能受污染的正压区域，防止因滤器破损、密封失效等原因造成的泄漏 标配两块长效型微皱褶无间隔ULPA 超级高效过滤器，针对＞0.12微米颗粒具有99.999...厂家：上海政泓 市场价格： 优惠价格：百度搜索联系AC2-5S1生物安全柜 标题：AC2-5S1生物安全柜Airstream® A2型二级生物安全柜 中国YY 0569和欧盟EN 12469标准独立检测及认证证书 标配两块ULPA 超高效过滤器,针对0.12μm 颗粒系可以达到99.999%截流效率 最新型SentinelTM 微电脑系统，过滤器寿命显示 高品质高风量风机，自动风量风压平衡补偿 背板及侧壁一体成型，圆弧角，操作腔四面负压环绕保护 人体工程学5度倾斜角设计，增加操作舒适性 舒适型宽体搁手架设计，降低工作疲劳强度 柜体外部IsocideTM 抗菌涂层可抑制细菌在表面滋生 前进气孔与操作台面为整块钢板一体成形，无接缝 ESCO 独有的DynamicTM 负压防泄漏设计 负压腔环绕整个可能受污染的正压区域，防止因滤器破损、密封失效等原因造成的泄漏 标配两块长效型微皱褶无间隔ULPA 超级高效过滤器，针对＞0.12微米厂家：上海政泓 市场价格： 优惠价格：百度搜索联系。

生物安全柜赛默飞1086s参数（最新版）目录1.生物安全柜的概念和作用2.生物安全柜的分类3.赛默飞 1086s 生物安全柜的参数4.赛默飞 1086s 生物安全柜的特点和优势5.使用生物安全柜的注意事项正文生物安全柜是一种实验室设备，用于保护操作者、环境和实验材料，避免在处理具有感染性的实验材料时产生感染性气溶胶和溅出物。

生物安全柜可分为一级、二级和三级，以满足不同的生物研究和防疫要求。

赛默飞 1086s 是一款生物安全柜，具有以下参数：1.一级生物安全柜：主要用于保护工作人员和环境，其气流原理与实验室通风橱相似，不同之处在于排气口安装有 HEPA 过滤器。

2.二级生物安全柜：是目前应用最广泛的柜型，具有气流流入前窗开口（进气流），用来防止微生物操作时可能生成的气溶胶从前窗逃逸。

同时，未经过滤的进气流会在到达工作区域前被进风格栅俘获，以保护试验品不受外界空气污染。

二级生物安全柜还具有经过 HEPA 过滤器过滤的垂直层流气流（下沉气流），不断吹过安全柜工作区域，保护柜中的试验品不被尘埃或细菌污染。

3.三级生物安全柜：主要用于操作高风险感染性实验材料，其负压环绕污染区域的设计可防止柜内物质泄漏。

赛默飞 1086s 生物安全柜具有以下特点和优势：1.高效过滤：采用 HEPA 过滤器，过滤效率高，可确保实验环境的洁净度。

2.灵活性：可根据实验室需求和实验操作的特性，调整气流速度和循环方式。

3.安全性：具有防止气溶胶泄漏和细菌污染的设计，保障实验过程的安全性。

4.易于操作：采用智能化控制面板，操作简便，便于实验者进行各项设置。

在使用生物安全柜时，需要注意以下几点：1.确保生物安全柜放置在通风良好的环境中，避免阳光直射。

2.根据实验要求选择合适的生物安全柜类型。

3.在操作过程中，遵循实验室安全规程，确保实验材料的正确处理。

生物安全柜工作原理生物安全柜是用于生物实验室中对生物样本进行处理和操作的一种重要设备，它能够提供一个安全的工作环境，防止生物样本对操作者和环境造成污染和危害。

生物安全柜的工作原理主要包括空气过滤、气流控制和生物样本隔离三个方面。

首先，生物安全柜通过空气过滤系统来保证工作区域的空气清洁。

空气过滤系统通常包括初效过滤器、中效过滤器和高效过滤器。

初效过滤器能够过滤掉空气中的大颗粒杂质，中效过滤器可以去除空气中的中等大小的颗粒和微生物，而高效过滤器则能够有效去除空气中的细菌和病毒等微生物。

这些过滤器的作用使得生物安全柜内的空气能够保持清洁，从而防止生物样本对操作者和环境造成污染。

其次，生物安全柜通过气流控制系统来保证工作区域的气流清洁和稳定。

气流控制系统通常采用垂直向下吸排风的方式，即从上向下吸入空气，然后经过过滤器净化后从下方排出。

这种气流方式能够有效地防止生物样本对操作者和环境造成污染，同时也能够保持工作区域内的气流清洁和稳定，提供一个安全的工作环境。

最后，生物安全柜通过生物样本隔离系统来保证操作者和环境不受生物样本污染和危害。

生物样本隔离系统通常采用双层结构，即在工作区域内设置一个隔离层，使得生物样本只能在隔离层内进行操作，从而防止生物样本对操作者和环境造成污染和危害。

同时，生物安全柜还配备有紫外线灯和化学消毒剂等设备，用于对工作区域和生物样本进行消毒和灭菌，进一步确保操作的安全性。

总的来说，生物安全柜通过空气过滤、气流控制和生物样本隔离三个方面的工作原理，能够提供一个安全的工作环境，防止生物样本对操作者和环境造成污染和危害。

在生物实验室中，正确使用和维护生物安全柜，对保障实验的安全性和准确性具有非常重要的意义。

注意：敬请用户在操作使用BSC-ⅡA2系列生物柜之前，必须详细阅读使用说明书！并妥善保存。

BSC-ⅡA2系列生物安全柜执行标准：JG 170-2005使用说明书本企业已通过ISO9001:2000质量体系认证苏州市洁净技术研究所苏州市百神科技有限公司欢迎使用BSC-ⅡA系列生物安全柜！2由衷地感谢您加入本公司的用户队伍！系列生物安全柜是一种提供局部无尘无菌工作环境的空气净化设备，并能BSC-ⅡA2将工作区已被污染的空气通过专门的过滤通道人为地控制排放，避免对人和环境造成危害，是一种安全的微生物专用洁净工作台。

可应用于生物实验室、医疗卫生、生物制药等相关行业，对改善工艺条件，保护操作者的身体健康均有良好效果。

一、产品特点系列生物安全柜整个装置的左右及后部墙体均为负压风道，使工作区1、BSC-ⅡA2与外部环境形成气幕及箱体双层隔离，同时工作区被负压包络，保证样品不发生泄露。

2、箱体采用优质冷轧镀锌钢板（secc）折弯后，运用铆接工艺制作而成，表面烤漆，美观耐用。

3、控制面板采用触摸式开关，使机器外形美观，易于操作。

4、配备数字式压差表和电子报警系统。

5、工作区全不锈钢结构，工作台面及积水盘均为活动式安装，便于清洁。

6、采用浮阀式减振设计，噪音低，噪音级高于《国家环保标准》。

二、适用范围1、A型安全柜适用于无挥发性的有毒化学物质，挥发性放射性核物质的生物危险度等级为1、2、3的样品操作场合。

三、使用环境1、环境温度：5℃～35℃；2、相对湿度：45%～75%；3、大气压力：86kPa～106kPa；4、使用环境洁净度：≤30万级；5、使用电源：工作电压220V±11V、 50Hz±1Hz；四、技术参数注：过滤器厚度规格选配50/69mm。

五、使用前须知A、安全柜启动与关闭1、穿好洁净的实验室工作服，把手洗净。

2、用70%的酒精或其它消毒剂全面擦拭安全柜内的工作平台。

3、打开吹风机和紫外线灯至少运行安全柜30分钟，以保证工作区空气中的污染物被完全清除，然后再将工作中所需的所有材料放入柜中。

二级生物安全实验室要求规范上海苏净按照BSL-2标准建造的实验室，也称为基础生物实验室。

在建筑物中实验室无需与一般区域隔离。

实验室人员需经一般生物专业训练。

其具体标准微生物操作、特殊操作、安全设备、实验室设施要求如下。

2.1标准操作工作一般在桌面上进行,采用微生物的常规操作和特殊操作。

工作区内禁止吃、喝、抽烟、用手接触隐形眼镜和使用化妆品。

食物贮藏在专门设计的工作区外的柜内或冰箱内。

使用移液管吸取液体，禁止用嘴吸取。

操作传染性材料后要洗手，离开实验室前脱掉手套并洗手。

制定对利器的安全操作对策。

所有操作均须小心，以减少实验材料外溢、飞溅、产生气溶胶。

每天完成实验后对工作台面进行消毒。

实验材料溅出时，要用有效的消毒剂消毒。

所有培养物和废弃物在处理前都要用高压蒸汽灭菌器消毒。

消毒后的物品要放入牢固不漏的容器内，按照国家法规进行包装，密闭传出处理。

昆虫和啮齿类动物的控制应参照其它有关规定进行。

妥善保管菌、毒种，使用要经负责人批准并登记使用量。

2.2特殊操作操作传染性材料的人员，由负责人指定。

一般情况下受感染概率增加或受感染后后果严重的人不允许进入实验室。

例如免疫功能低下或缺陷的人受感染危险增加。

负责人要告知工作人员工作中的潜在危险和所需的防护措施（如免疫接种），否则不能进入实验室工作。

操作病原微生物期间，在实验室入口必须标记生物危险信号，其内容包括微生物种类、生物安全水平、是否需要免疫接种、研究者的姓名和电话号码、进入人员必须佩戴的防护器具、遵守退出实验室的程序。

实验室人员需操作某些人畜共患病病原体时应接受相应的疫苗免疫或检测试验（如狂犬病疫苗和TB皮肤试验）。

应收集和保存实验室人员和其他受威胁人的基础血清，进行试验病原微生物抗体水平的测定，以后定期或不定期收取血清样本进行监测。

实验室负责人应制定具体的生物安全规则和标准操作程序,或制定实验室特殊的安全手册。

实验室负责人对实验人员和辅助人员要进行针对性的生物危害防护的专业训练, 定期培训。

苏净生物安全柜苏净生物安全柜是一种用于生物实验室和医疗机构的设备，其主要功能是为操作人员和实验样本提供安全保护。

它可以有效地防止生物材料的污染和泄漏，保护操作人员免受有害物质的侵害。

苏净生物安全柜的设计和使用都需要严格遵循相关规范和标准，以确保其安全性和可靠性。

首先，苏净生物安全柜的设计应符合国家和行业标准，包括但不限于《生物安全柜通用技术条件》（GB 19489-2008）和《生物安全柜使用和维护规范》（YY/T 0606-2016）。

这些标准规定了生物安全柜的设计参数、操作要求、维护保养等方面的要求，确保其在使用过程中能够提供有效的安全保护。

其次，苏净生物安全柜的使用需要严格按照操作手册和相关规程进行。

操作人员在使用生物安全柜时，应了解其工作原理和操作流程，正确使用洁净工作台、生物安全柜等设备，严格遵守操作规程，避免操作失误导致安全事故的发生。

此外，苏净生物安全柜的维护保养也是确保其安全性和可靠性的重要环节。

定期对生物安全柜进行维护保养，包括过滤器更换、风速检测、密封性能检查等，确保其正常运行和安全使用。

总之，苏净生物安全柜在生物实验室和医疗机构中扮演着重要的角色，其安全性和可靠性对操作人员和实验样本的安全至关重要。

只有严格遵循相关标准和规程，正确使用和维护生物安全柜，才能确保其有效地发挥作用，为实验和临床工作提供安全保障。

在使用苏净生物安全柜时，操作人员应严格按照操作手册和规程进行操作，确保生物安全柜的正常运行和安全使用。

同时，定期对生物安全柜进行维护保养，包括过滤器更换、风速检测、密封性能检查等，确保其安全性和可靠性。

综上所述，苏净生物安全柜是一种重要的生物实验室和医疗机构设备，其安全性和可靠性对操作人员和实验样本的安全至关重要。

只有严格遵循相关标准和规程，正确使用和维护生物安全柜，才能确保其有效地发挥作用，为实验和临床工作提供安全保障。

生物安全柜BSC-1000ⅡB2型操作手册/维修手册/服务说明前 言z感谢您选用苏净安泰公司的产品。

我们深信本产品会改善您工作时的工艺环境，对产品质量的提高和保护操作人员的健康和环境安全起到良好的效果。

z为了确保本产品最有效地运行，请仔细阅读本手册和熟悉本产品，并将该手册保存在便利之处，以备在产品使用中随时参考。

z为了确保本产品运行安全可靠，请指定经培训的专业人员作为本产品的运行管理者。

如果您对本产品的使用方法、维修保养、故障处理有任何疑问或建议，请立即向管理者报告或与本公司联系。

我们将竭诚为您提供优质服务。

目 录操作手册一、 安全常识················· 1 1.结构特征1.产品特点和适用范围2.工作原理2.使用环境条件 四、安装调整 (6)3.安全事项 五、使用操作 (6)二、 技术参数................. 3 六、运输、搬运与贮存. (10)三、结构特征与工作原理 ..... 4 七、开箱及检查 (11)维 修 手 册一、注意事项...................12三、维修和保养.. (16)二、故障分析与排除...........13四、灭菌 (18)五．附图 (20)服 务 说 明服务说明 (21)装 箱 清 单装箱清单 (22)操作手册一．安全常识1.产品特点和适用范围BSC-1000ⅡB2生物安全柜（以下简称安全柜）是通过高效过滤器、进（送）排风系统等制造了一个空气屏障，对操作人员、实验样品和操作环境提供保护。

是一种安全的微生物实验和生产的专用设备。

本产品适用于对操作过程中的人员、产品及环境进行的保护。

前窗操作口向内吸入的负压气流用于保护人员的安全；经高效过滤器过滤的垂直下降气流用于保护产品；气流经高效过滤器过滤后排出保护环境不受污染。

基于miR-126-5p/Bcl-2/mPTP通路探究稳心汤对缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞损伤修复的作用机制解紫从1,刘咏梅1,陈恒文1,谭雨晴1,2,李军1摘要目的:观察稳心汤对缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响,并基于miR-126-5p/Bcl-2/心肌细胞线粒体通透性转换孔(mPTP)调控通路明确其作用机制㊂方法:使用5%CO2㊁1%O2㊁94%N2培养箱构建H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型,并通过细胞转染技术达到miR-126-5p的过表达与抑制㊂待干预结束后观察心肌细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)释放水平㊁心肌细胞活性氧(ROS)含量;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡;流式细胞仪检测心肌细胞线粒体mPTP开放水平;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞色素C(Cyt-C)释放水平与Bcl-2㊁Caspase-3㊁Caspase-9蛋白表达水平;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-126-5p及Bcl-2㊁Caspase-3㊁Caspase-9的RNA表达水平㊂结果:与miR-126-5p低表达组比较,miR-126-5p过表达可显著降低LDH释放水平;减少心肌细胞ROS含量;改善心肌细胞凋亡率;提高心肌细胞CalceinAM水平,减少mPTP开放㊂miR-126-5p过表达可以减少H9c2心肌细胞Cyt-C释放水平,miR-126-5p低表达可部分减少H9c2心肌细胞Cyt-C释放水平㊂miR-126-5p过表达可上调Bcl-2蛋白与基因表达,下调Caspase-3与Caspase-9蛋白与基因表达㊂miR-126-5p低表达可部分上调miR-126-5p表达水平与Bcl-2蛋白与基因表达;部分下调Caspase-3与Caspase-9蛋白与基因表达㊂结论:稳心汤改善缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤可能与调控miR-126-5p/Bcl-2/mPTP信号通路有关,从而减轻氧化应激反应,降低线粒体膜通透性,抑制心肌细胞凋亡,延缓心肌损伤㊂关键词稳心汤;H9c2心肌细胞;miR-126-5p/Bcl-2/心肌细胞线粒体通透性转换孔(mPTP);缺氧/复氧;心肌损伤d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2023.15.009The Effect of Wenxin Formula on the Damage and Repair of H9c2Myocardial Cells Induced by Hypoxia/Reoxygenation Based on miR-126-5p/Bcl-2/mPTP Regulatory PathwayXIE Zicong,LIU Yongmei,CHEN Hengwen,TAN Yuqing,LI JunGuang'anmen Hospital,China Academy of Chinese Medicine Science,Beijing100053,ChinaCorresponding Author LI Jun,E-mail:***************Abstract Objective:To observe the effect of Wenxin Formula on H9c2myocardial cell injury induced by hypoxia/reoxygenation,and to clarify its mechanism based on the regulatory pathway of miR-126-5p/Bcl-2/mitochondrial permeability conversion pore(mPTP). Methods:The hypoxia and reoxygenation model of H9c2myocardial cells were constructed in a three-gas incubator,and the overexpression and inhibition of miR-126-5p were achieved by cell transfection.After the intervention,the release level of lactate dehydrogenase(LDH)and the content of reactive oxygen species(ROS)in cardiomyocytes were observed.Myocardial cell apoptosis was detected by TUNEL.The open level of mPTP was detected by flow cytometry.The release level of cytochrome-C(Cyt-C)and the expression levels of Bcl-2,Caspase-3,and Caspase-9were detected by Western Blot.Real-time quantitative fluorescence polymerase reaction(qRT-PCR)was used to detect the expression levels of miR-126-5p,Bcl-2,Caspase-3and,Caspase-9RNA.Results:Compared with miR-126-5p low expression group,miR-126-5p overexpression significantly reduced the LDH release level;reduced ROS content in cardiomyocytes;improved myocardial cell apoptosis rate;calceinam level increased and mPTP opening decreased.Overexpression of miR-126-5p could reduce the Cyt-C release level of H9c2cardiomyocytes,and low expression of miR-126-5p could partially reduce the Cyt-C release level of H9c2cardiomyocytes.Overexpression of miR-126-5p could up-regulate the expression of Bcl-2protein and gene,and down-regulate the expression of Caspase-3and Caspase-9protein and gene.When miR-126-5p expression was low,the expression level of miR-126-5p and Bcl-2could be partially up-regulated.Partially down-regulated the expression levels of Caspase-3 and Caspase-9.Conclusion:The Wenxin Formula could improve H9c2myocardial cells injury induced by hypoxia/reoxygenation which may be related to the regulation of miR-126-5p/Bcl-2/mPTP signaling pathway,so as to reduce oxidative stress response,reduce mitochondrial membrane permeability,inhibit cardiomyocyte apoptosis,and delay myocardial injury.Keywords Wenxin Formula;H9c2myocardial cells;miR-126-5p/Bcl-2/mPTP;hypoxia/reoxygenation;myocardial injury基金项目国家自然科学基金资助项目(No.81973836);中国中医科学院科技创新工程重大攻关项目(No.CI2021A00902);首都卫生发展科研专项(No.2020-1-4151)作者单位 1.中国中医科学院广安门医院(北京100053);2.北京中医药大学(北京100029)通讯作者李军,E-mail:***************引用信息解紫从,刘咏梅,陈恒文,等.基于miR-126-5p/Bcl-2/mPTP通路探究稳心汤对缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞损伤修复的作用机制[J].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(15):2754-2765.冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heartdisease,CHD)已成为重大公共卫生问题㊂据‘中国心血管健康与疾病报告2021“[1]推算,中国心血管病现患人数约3.3亿人,其中冠心病病人1139万人,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患病率与死亡率均呈上升趋势,心血管病死亡率已高于肿瘤及其他疾病,居于首位㊂目前,冠心病可通过经皮冠状动脉支架植入术(percutaneous coronary intervention,PCI)㊁冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting,CABG)及口服常规二级预防药物等治疗,多数病人可从中获益[2]㊂仍有部分病人病情复杂,如存在手术风险㊁冠状动脉病变程度严重㊁PCI术后再狭窄㊁支架内血栓等,均可不同程度影响冠心病病人的疗效㊂中医药运用益气温阳㊁活血通络㊁解毒等方法治疗冠心病,疗效确切,可改善病人临床症状,减轻炎症反应,提高病人生活质量,但作用机制仍待阐明[3-4]㊂稳心汤是本课题组结合多年临床实践与名老中医经验总结出的有效方剂,药物组成有姜黄㊁黄芪㊁党参㊁赤芍㊁川芎㊁莪术㊁肉桂㊁瓜蒌㊁大黄㊁细辛㊁甘草,可益气活血㊁散寒止痛㊁通阳降浊,善治冠心病气虚血瘀证[5]㊂方中以姜黄㊁黄芪为君药,可补气活血,其中黄芪有效成分黄芪甲苷㊁姜黄有效成分姜黄素均已证实在治疗冠心病中具有较好效果,可调节炎症反应,改善血管内皮功能,缓解心肌缺血[6-7]㊂本课题组通过稳心汤干预急性心肌梗死大鼠,观察其作用机制,发现稳心汤可改善大鼠心功能㊁抑制心肌纤维化㊁调节心室重构,其机制可能与上调miR-126-5p,并调控其下游Bcl-2㊁Caspase-9等基因表达相关[8-9]㊂因此,本研究在前期实验基础上,通过缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞损伤模型,模拟冠心病心肌受损,基于miR-126-5p/Bcl-2/心肌细胞线粒体通透性转换孔(mPTP)调控通路观察稳心汤改善心肌损伤的作用机制㊂1材料与方法1.1实验细胞H9c2心肌细胞系购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心㊂1.2实验药物实验用稳心汤购自中国中医科学院广安门医院㊂实验用黄芪甲苷标准品(货号:110781)与姜黄素标准品(货号:110823)均购自中国食品药品鉴定研究院㊂实验用盐酸曲美他嗪片(每片20mg)购自中国中医科学院广安门医院㊂药物用不含胎牛血清(FBS)的DMEM培养基充分溶解(使用DMSO助溶),配制成2mg/mL的母液,分装于冻存管中,-20ħ保存㊂每次实验时需用不含FBS的DMEM培养基根据所需浓度进行稀释㊂1.3实验试剂DMEM高糖培养基(Gibco,C11995500BT);FBS (四季青,11011-8611);青链霉素混合液(P1400)㊁磷酸缓冲液(PBS,P1020)㊁通用细胞冻存液(24800)㊁RIPA 裂解液(R0010)㊁二喹啉甲酸法(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(PC0020)㊁5ˑ蛋白上样缓冲液(含DTT, P1040)㊁10ˑ电泳转移缓冲液(D1060)㊁5ˑTris-甘氨酸电泳缓冲液(T1070)㊁20ˑTBST(T1080)㊁彩虹245plus广谱蛋白Marker(5-245KD)(PR1930-50T)均购自Solarbio公司;Trypsin0.25%胰蛋白酶溶液(HyClone,SH30042.01);细胞增殖毒性检测(CCK-8)试剂盒(日本同仁,CK04);乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物,C0017);纯化线粒体氧化应激活性氧(ROS)鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒(GENMED SCIENTIFICS,GMS10112.2);二甲基亚砜(DMSO,D2650)㊁Tunel(11684795910)㊁DAPi(D9542)购自Sigma公司㊂氯仿㊁异丙醇㊁无水乙醇购自北京化学试剂公司;Trizol试剂(Invitrogen公司,14105); FastQuant RT Kit逆转录试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司,N2625];SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒(美国应用生物公司,1403448);miR-126-5p㊁Bcl-2㊁Caspase-3㊁Caspase-9引物购自赛百盛生物科技有限公司;Lipofectamine TM RNAiMAX转染试剂(Thermo,13778150);Bcl-2Rabbit pAb(A0208)㊁Caspase-9Rabbit pAb(A11451)㊁Caspase-3 (A2156)㊁Cytochrome C Rabbit pAb(A0225)购自Abclonal公司;Omni-Easy TM一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒(10%,PG212)㊁Omni-ECL TM增强型化学发光检测试剂盒(皮克级,SQ101)购自雅酶公司;脱脂奶粉(普利莱,P1622);eBlot L1PVDF膜转膜试剂A (L00791C)㊁eBlot L1PVDF膜转膜试剂B(L00793C)㊁eBlot L1PVDF膜平衡浓缩液(L00734C)购自GenScript;甲醇(天津赛孚瑞);山羊抗兔IgG(H+L), HRP(111035003)㊁山羊抗鼠IgG(H+L),HRP (115035003)购自Jackson公司;β-actin鼠单抗(锐尔康生物,REK0001)㊂1.4实验仪器CO2细胞培养箱(Thermo,3111);CO2细胞培养箱(ESCO,CCL-050T-8-IVF);超净台(上海苏净实业有限公司,SW-CJ-2D);低速离心机(上海安亭科学仪器厂,KA-1000);多功能酶标仪(TECAN,Spark);电热恒温水浴锅[林茂科技(北京)有限公司,DZKW-4];倒置荧光显微镜(OLYMPUS,CKX53);流式细胞仪[碧迪医疗器械(上海)有限公司,Calibur II型];化学发光仪(Molecμlar Devices,SpectraMax L);低温高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,TGL-16); qTower3(Analytikjena,3107A-1368),聚合酶链式反应(PCR)扩增仪(AGS,AGT9601);生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造有限公司,BSC-1360II A2);涡旋震荡仪(宁波市鄞州群安实验仪器有限公司,MIX-28);电泳仪(Thermo scientific,Mini Ge Tank);转膜仪(GenScript eBlot TM L1);摇床(泰州诺米医疗科技有限公司,NYC-80);曝光仪(上海易孛特,eBlot)㊂1.5实验方法1.5.1细胞培养H9c2心肌细胞所用完全培养基由DMEM高糖培养基㊁10%FBS㊁1%青链霉素混合液组成㊂培养环境为37ħ㊁5%CO2细胞培养箱㊂培养过程中需定期观察细胞形态及数量,待细胞融合度达到80%~90%时,使用胰蛋白酶消化,进行细胞传代㊁冻存及相关检测㊂1.5.2缺氧/复氧模型构建取对数生长期的H9c2心肌细胞铺于细胞培养瓶中,待细胞贴壁过夜后,将细胞置于含5%CO2㊁1% O2㊁94%N2的培养箱缺氧24h,再将细胞放于正常培养箱内培养12h,构建H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型㊂1.5.3细胞转染细胞经常规消化终止后调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于6孔细胞培养板内,每孔1500μL,继续常规培养24h,待细胞融合度达到70%以上时,无菌状态下无血清培养基稀释miRNA至200nmol/L,同时加入4μL的lipo2000转染试剂,室温反应15min进行细胞转染㊂转染24h后,根据细胞分组进行实验㊂1.5.4细胞分组及处理将转染后的miR-126-5p过表达细胞和低表达细胞分别进行分组㊂1)miR-126-5p过表达H9c2心肌细胞分组:mim-Control组正常培养;mim-Model组缺氧/复氧培养;mim-WXT-H组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤20μg/mL干预;mim-WXT-M组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤10μg/mL干预;mim-WXT-L 组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤5μg/mL干预;mim-Cur组在缺氧/复氧培养基础上,同时予姜黄素50μg/mL干预;mim-AS-IV组在缺氧/复氧培养基础上,同时予黄芪甲苷50μg/mL干预;mim-QMTQ组在缺氧/复氧培养基础上,同时予盐酸曲美他嗪片10μg/mL 干预㊂2)miR-126-5p低表达H9c2心肌细胞分组: in-Control组正常培养;in-Model组缺氧/复氧培养;in-WXT-H组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤20μg/mL干预;in-WXT-M组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤10μg/mL干预;in-WXT-L组在缺氧/复氧培养基础上,同时予稳心汤5μg/mL干预;in-Cur组在缺氧/复氧培养基础上,同时予姜黄素50μg/mL干预;in-AS-IV组在缺氧/复氧培养基础上,同时予黄芪甲苷50μg/mL干预;in-QMTQ组在缺氧/复氧培养基础上,同时予盐酸曲美他嗪片10μg/mL干预㊂1.5.5检测心肌细胞上清LDH释放水平调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于96孔细胞培养板内,每孔100μL,予不同处理后,按照说明书操作步骤,每孔分别加入60μL的LDH检测工作液,混匀,室温避光孵育30min,然后在490nm处测定吸光度㊂1.5.6检测心肌细胞ROS含量调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于6孔细胞培养板内,每孔1500μL,予不同处理后,弃上清,按照说明书加入试剂,打开化学发光仪,整合测读10s,获得相对发光单位(relative light unit,RLU)㊂1.5.7原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于24孔细胞培养板内,每孔500μL,予不同处理后,弃培养基,使用TUNEL进行检测,荧光显微镜拍照,其中TUNEL为绿荧光,DAPi为蓝色荧光㊂1.5.8心肌细胞线粒体通透性转换孔开放检测调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于6孔细胞培养板内,每孔1500μL,予不同处理后,消化细胞,调整细胞密度为1ˑ106/mL,每个样品体积为1mL;使用流式细胞仪检测Calcein AM水平,Calcein AM染色后经CoCl2处理会导致仅线粒体内呈现Calcein的绿色荧光,当线粒体膜通透性转换孔开放,通透性增加时, Calcein AM荧光强度降低㊂1.5.9蛋白质免疫印记法(Western Blot)检测细胞色素C(Cyt-C)释放水平及Bcl-2㊁Caspase-3㊁Caspase-9的表达水平调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于100mm直径的细胞培养皿内,每培养皿8mL㊂予不同处理后,消化细胞,取细胞上清保存备用㊂使用RIPA蛋白抽提试剂进行蛋白提取,用BCA法检测蛋白浓度,加入4ˑLDS和超纯水使各样品浓度值相同,沸水浴变性5min㊂然后制备PAGE凝胶㊁电泳㊁转膜㊁封闭㊁一抗孵育㊁二抗孵育,然后将ECL加到PVDF膜上后避光反应3~5min,eBlot曝光仪进行曝光,选择合适曝光时间的图片,通过Image J软件进行灰度值分析㊂一抗具体信息见表1㊂表1一抗信息抗体名称大小稀释度种属Caspase-947/37/35kD1ʒ500兔Caspase-332/17kD1ʒ500兔Cyt-C14kD1ʒ500兔Bcl-226kD1ʒ500兔1.5.10实时荧光定量逆转录PCR法(qRT-PCR)检测miR-126-5p及Bcl-2㊁Caspase-3㊁Caspase-9表达水平调整细胞密度为5ˑ104个/mL,铺于6孔细胞培养板内,每孔1500μL,予不同处理后,消化细胞,收集混悬液至离心管中,1000r/min离心5min,弃上清,加入Trizol1mL重悬细胞㊂提取细胞RNA,根据试剂盒进行反转录,在95ħ5min;95ħ30s,55ħ30s,72ħ35s,40个循环;72ħ8min条件下进行PCR扩增㊂引物序列见表2,以2-әәCt计算㊂表2引物序列基因名称正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')miR-126-5p CATTATTACTTTTGGTACGCGA GTGCGTGTCGTGGAGTCG Bcl-2GGGATGCCTTTGTGGAACTA ATTTGTTTGGGGCAGGTCT Caspase-3TGGTTTTGTGACAGTTGACCA ACAAATGCTTGGTGGATCGTAG Caspase-9ATGGTCACGGCTTTGATGGA TCTTTCTGCTCACCACCACA U6CTCGCTTCGGCAGCACA ACGCTTCACGAATTTGCGT1.6统计学处理采用SPSS28.0软件进行数据分析㊂符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,多组间比较采用ANOVA单因素分析;不符合正态分布的定量资料以中位数或四分位间距[M(Q1,Q3)]表示,采用Kruskal-Wallis检验㊂定性资料以例数或百分比(%)表示,采用χ2检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1心肌细胞上清LDH释放水平miR-126-5p过表达各组结果显示,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞上清中LDH含量明显升高(P<0.05);与mim-Model组比较, mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur 组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组LDH含量明显降低(P<0.05)㊂miR-126-5p低表达各组结果显示,与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞上清中LDH含量明显升高(P<0.05);与in-Model组比较, in-WXT-H组㊁in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur 组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组LDH含量均明显降低(P<0.05)㊂详见表3㊂miR-126-5p过表达心肌细胞与低表达心肌细胞不同处理条件下比较,发现两Control组㊁两WXT-H 组㊁两QMTQ组LDH释放水平比较差异无统计学意义(P>0.05),两Model组㊁两WXT-M组㊁两WXT-L 组㊁两Cur组㊁两AS-IV组LDH释放水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂整体说明miR-126-5p高表达可以减少LDH释放水平㊂详见图1㊂表3各组H9c2心肌细胞上清LDH含量比较(xʃs)单位:U/L 组别LDH组别LDH mim-Control组13.67ʃ1.15in-Control组15.67ʃ1.15 mim-Model组32.67ʃ2.52①in-Model组40.33ʃ2.52③mim-WXT-H组26.00ʃ2.64②in-WXT-H组30.33ʃ1.15④mim-WXT-M组17.67ʃ1.15②in-WXT-M组24.00ʃ1.00④mim-WXT-L组24.33ʃ1.15②in-WXT-L组29.33ʃ2.31④mim-Cur组26.67ʃ1.15②in-Cur组23.67ʃ0.58④mim-AS-IV组18.33ʃ0.58②in-AS-IV组20.33ʃ0.58④mim-QMTQ组21.33ʃ1.53②in-QMTQ组23.00ʃ0.00④注:mim-Model组与mim-Control组比较,①P<0.05;与mim-Model组比较,②P<0.05;in-Model组与in-Control组比较,③P<0.05;与in-Model组比较,④P<0.05㊂图1miR-126-5p过表达与低表达各组H9c2心肌细胞上清液LDH含量比较2.2心肌细胞ROS水平miR-126-5p过表达各组结果显示,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞ROS含量明显升高(P<0.05);与mim-Model组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur 组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组的ROS含量均明显降低(P<0.05)㊂miR-126-5p低表达各组结果显示,与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞ROS 含量明显升高(P<0.05);与in-Model组比较, in-WXT-H组㊁in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组的ROS含量均明显降低(P<0.05)㊂详见表4㊂miR-126-5p过表达心肌细胞与低表达心肌细胞不同处理条件下比较,发现两Control组㊁两Model 组㊁两WXT-H组㊁两WXT-M组㊁两WXT-L组㊁两Cur 组㊁两AS-IV组㊁两QMTQ组ROS含量比较,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂miR-126-5p高表达可以减轻心肌受损后氧化应激反应㊂详见图2㊂表4各组H9c2心肌细胞ROS含量(xʃs)单位:RLU 组别ROS组别ROSmim-Control组29.10ʃ27.35in-Control组149.71ʃ74.95 mim-Model组289.40ʃ32.73①in-Model组1428.12ʃ760.34③mim-WXT-H组159.07ʃ22.43②in-WXT-H组376.84ʃ60.23④mim-WXT-M组81.39ʃ37.72②in-WXT-M组286.30ʃ30.96④mim-WXT-L组95.17ʃ50.09②in-WXT-L组441.75ʃ50.95④mim-Cur组151.21ʃ82.20②in-Cur组600.75ʃ73.90④mim-AS-IV组24.65ʃ30.14②in-AS-IV组541.11ʃ22.42④mim-QMTQ组19.26ʃ14.39②in-QMTQ组397.41ʃ17.59④注:mim-Model组与mim-Control组比较,①P<0.05;与mim-Model组比较,②P<0.05;in-Model组与in-Control组比较,③P<0.05;与in-Model组比较,④P<0.05㊂图2miR-126-5p过表达与低表达各组H9c2心肌细胞ROS含量比较2.3心肌细胞凋亡情况miR-126-5p过表达各组结果显示,与mim-Control 组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与mim-Model组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur组㊁mim-QMTQ 组凋亡率均明显降低(P<0.05),mim-AS-IV组凋亡率有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)㊂miR-126-5p低表达各组结果显示,与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞凋亡率明显升高(P< 0.05);与in-Model组比较,in-WXT-H组㊁in-WXT-M 组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组的凋亡率虽有降低趋势,但差异均无统计学意义(P> 0.05)㊂说明miR-126-5p低表达心肌细胞凋亡率较高,且用药后改善效果不佳㊂详见图3㊁图4㊁表5㊂miR-126-5p过表达心肌细胞与低表达心肌细胞不同处理条件下比较,发现两Control组心肌细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.05),两Model组㊁两WXT-H组㊁两WXT-M组㊁两WXT-L组㊁两Cur组㊁两AS-IV组㊁两QMTQ组心肌细胞凋亡率比较,差异均无统计学意义(P>0.05),说明miR-126-5p表达较低时,容易发生心肌细胞凋亡㊂详见图5㊂图3各组mim-H9c2心肌细胞TUNEL染色结果(A1为mim-Control组TUNEL凋亡细胞;A2为mim-Control组DAPi总细胞;B1为mim-Model组TUNEL凋亡细胞;B2为mim-Model组DAPi总细胞;C1为mim-WXT-H组TUNEL凋亡细胞;C2为mim-WXT-H组DAPi总细胞;D1为mim-WXT-M组TUNEL凋亡细胞;D2为mim-WXT-M组DAPi总细胞;E1为mim-WXT-L组TUNEL凋亡细胞;E2为mim-WXT-L组DAPi总细胞;F1为mim-Cur组TUNEL凋亡细胞;F2为mim-Cur组DAPi总细胞;G1为mim-AS-IV组TUNEL凋亡细胞;G2为mim-AS-IV组DAPi总细胞;H1为mim-QMTQ组TUNEL凋亡细胞;H2为mim-QMTQ组DAPi总细胞)图4各组in-H9c2心肌细胞TUNEL染色结果(A1为in-Control组TUNEL凋亡细胞;A2为in-Control组DAPi总细胞;B1为in-Model组TUNEL凋亡细胞;B2为in-Model组DAPi总细胞;C1为in-WXT-H组TUNEL凋亡细胞;C2为in-WXT-H组DAPi总细胞;D1为in-WXT-M组TUNEL凋亡细胞;D2为in-WXT-M组DAPi总细胞;E1为in-WXT-L组TUNEL凋亡细胞;E2为in-WXT-L组DAPi总细胞;F1为in-Cur组TUNEL凋亡细胞;F2为in-Cur组DAPi总细胞;G1为in-AS-IV组TUNEL凋亡细胞;G2为in-AS-IV组DAPi总细胞;H1为in-QMTQ组TUNEL凋亡细胞;H2为in-QMTQ组DAPi总细胞)表5各组H9c2心肌细胞凋亡率(xʃs)单位:%组别细胞凋亡率组别细胞凋亡率mim-Control组0.00ʃ0.00in-Control组8.54ʃ5.18 mim-Model组32.61ʃ22.46①in-Model组33.02ʃ24.29③mim-WXT-H组17.28ʃ11.23②in-WXT-H组10.41ʃ13.87 mim-WXT-M组10.34ʃ6.61②in-WXT-M组22.08ʃ20.38 mim-WXT-L组 4.40ʃ5.15②in-WXT-L组24.32ʃ24.34 mim-Cur组16.41ʃ5.19②in-Cur组32.55ʃ21.47 mim-AS-IV组22.37ʃ12.95in-AS-IV组23.93ʃ16.69 mim-QMTQ组13.10ʃ11.32②in-QMTQ组23.25ʃ23.41注:mim-Model组与mim-Control组比较,①P<0.05;与mim-Model组比较,②P<0.05;in-Model组与in-Control组比较,③P<0.05;与in-Model组比较,④P<0.05㊂图5miR-126-5p过表达与低表达各组H9c2心肌细胞凋亡率比较2.4mPTP开放结果miR-126-5p过表达各组结果显示,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞CalceinAM水平明显降低(P<0.05),mPTP开放程度升高;与mim-Model组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur组㊁mim-AS-IV 组㊁mim-QMTQ组的CalceinAM水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05),mPTP开放程度降低㊂miR-126-5p 低表达各组结果显示,与in-Control组比较,in-Model 组H9c2心肌细胞CalceinAM水平明显降低(P<0.05);与in-Model组比较,in-WXT-H组㊁in-WXT-M组㊁in-WXT-L 组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组的CalceinAM水平明显升高(P<0.05)㊂详见表6㊂miR-126-5p过表达心肌细胞与低表达心肌细胞不同处理条件下比较发现,两Control组㊁两Model组㊁两WXT-H组㊁两WXT-M组㊁两WXT-L组㊁两AS-IV组㊁两QMTQ组CalceinAM水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明miR-126-5p过表达与低表达,可以降低线粒体膜通透性,从而抑制心肌细胞凋亡㊂详见图6㊂表6各组H9c2心肌细胞CalceinAM水平比较(xʃs)组别CalceinAM组别CalceinAM mim-Control组99.67ʃ0.06in-Control组93.10ʃ0.66 mim-Model组66.00ʃ1.10①in-Model组25.60ʃ7.65③mim -WXT-H组88.10ʃ1.57②in-WXT-H组70.20ʃ1.30④mim-WXT-M组98.53ʃ0.06②in-WXT-M组86.93ʃ2.32④mim-WXT-L组97.80ʃ0.20②in-WXT-L组80.53ʃ0.78④mim-Cur组98.73ʃ0.81②in-Cur组79.87ʃ6.15④mim-AS-IV组97.60ʃ0.10②in-AS-IV组71.17ʃ0.25④mim-QMTQ组93.48ʃ0.78②in-QMTQ组88.00ʃ1.18④注:mim-Model组与mim-Control组比较,①P<0.05;与mim-Model组比较,②P<0.05;in-Model组与in-Control组比较,③P<0.05;与in-Model组比较,④P<0.05㊂图6miR-126-5p过表达与低表达各组H9c2心肌细胞Calcein水平比较2.5心肌细胞Cyt-C含量miR-126-5p过表达各组结果显示,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞Cyt-C 释放水平明显升高(P<0.05);与mim-Model组比较, mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组的Cyt-C释放水平明显降低(P<0.05)㊂说明miR-126-5p过表达心肌细胞缺氧后Cyt-C释放增加,经稳心汤及其有效成分干预后可以减少Cyt-C的释放㊂详见图7㊁图8㊂miR-126-5p低表达组结果显示,与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞Cyt-C释放水平明显升高(P<0.05);与in-Model组比较,in-WXT-H组㊁in-WXT-M组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组的Cyt-C释放水平明显降低(P<0.05),in-WXT-L组未见降低趋势㊂说明miR-126-5p低表达心肌细胞缺氧后Cyt-C释放增加,经稳心汤及其有效成分干预后可以减少Cyt-C的释放㊂详见图9㊁图10㊂图7miR-126-5p过表达H9c2细胞不同处理下Cyt-C相对表达结果(mim-Model组与min-Control组比较,*P<0.05;与mim-Model组比较,#P<0.05)图8miR-126-5p过表达H9c2细胞不同处理下Cyt-C相对表达条带图(1为mim-Control组;2为mim-Model组; 3为mim-WXT-H组;4为mim-WXT-M组;5为mim-WXT-L组;6为mim-Cur组;7为mim-AS-IV组;8为mim-QMTQ组)图9miR-126-5p低表达H9c2细胞不同处理下Cyt-C相对表达结果(in-Modec组与in-Control组比较,*P<0.05;与in-Model组比较,#P<0.05)图10miR-126-5p低表达H9c2细胞不同处理下Cyt-C相对表达条带图(1为in-Control组;2为in-Model组;3为in-WXT-H组;4为in-WXT-M组;5为in-WXT-L组;6为in-Cur组;7为in-AS-IV组;8为in-QMTQ组)2.6Western Blot检测Caspase-9㊁Caspase-3㊁Bcl-2蛋白表达miR-126-5p过表达组结果显示:1)就Caspase-9㊁Caspase-3蛋白相对表达而言,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞Caspase-9㊁Caspase-3表达明显升高(P<0.05);与mim-Model 组比较,mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组Caspase-9㊁Caspase-3表达水平明显降低(P<0.05);mim-WXT-H组未见明显降低㊂2)就Bcl-2蛋白相对表达而言,与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞Bcl-2表达明显降低(P<0.05);与mim-Model组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-AS-IV 组㊁mim-QMTQ组的Bcl-2表达水平明显升高(P<0.05); mim-Cur组Bcl-2表达有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)㊂说明miR-126-5p过表达心肌细胞缺氧后Caspase-9㊁Caspase-3蛋白表达水平均呈上升趋势,Bcl-2蛋白表达水平呈下降趋势;经稳心汤及其有效成分干预后可以减少Caspase-9㊁Caspase-3蛋白表达,提高Bcl-2表达水平㊂详见图11㊁图12㊂图11miR-126-5p过表达各组Caspace-9㊁Caspace-3㊁Bcl-2蛋白相对表达条带图(1为mim-Control组;2为mim-Model组;3为mim-WXT-H组;4为mim-WXT-M组;5为mim-WXT-L组;6为mim-Cur组;7为mim-AS-IV组;8为mim-QMTQ组)图12miR-126-5p过表达各组Caspase-9㊁Caspase-3㊁Bcl-2蛋白相对表达比较(A为各组Caspase-9表达;B为各组Caspase-3表达;C为各组Bcl-2表达㊂mim-Model组与mim-Control组比较,*P<0.05;与mim-Model组比较,#P<0.05)miR-126-5p低表达各组结果显示:1)就Caspase-9㊁Caspase-3蛋白相对表达而言,与in-Control组比较, in-Model组H9c2心肌细胞Caspase-9㊁Caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05);与in-Model组比较, in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组的Caspase-9㊁Caspase-3表达水平明显降低(P<0.05);in-WXT-H组Caspase-9有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);in-WXT-H组的Caspase-3表达水平明显降低(P<0.05)㊂2)就Bcl-2蛋白相对表达而言,与in-Control组比较,in-Model 组H9c2心肌细胞Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05);与in-Model组比较,in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-AS-IV 组㊁in-QMTQ组的Bcl-2表达水平明显升高(P<0.05); in-WXT-H组Bcl-2表达无明显变化,in-Cur组Bcl-2表达明显降低(P<0.05)㊂说明miR-126-5p过表达心肌细胞缺氧后Caspase-9㊁Caspase-3蛋白表达水平均呈上升趋势,Bcl-2蛋白表达水平呈下降趋势;经稳心汤及其有效成分干预后可以减少Caspase-9㊁Caspase-3蛋白表达,提高Bcl-2表达水平㊂详见图13㊁图14㊂图13miR-126-5p低表达各组Caspase-9㊁Caspase-3㊁Bcl-2蛋白相对表达结果(A为各组Caspase-9表达;B为各组Caspase-3表达;C为各组Bcl-2表达㊂in-Model组与in-Control组比较,*P<0.05;与in-Model组比较,#P<0.05)图14miR-126-5p低表达各组Caspase-9㊁Caspase-3㊁Bcl-2相对表达条带图(1为in-Control组;2为in-Model组;3为in-WXT-H组;4为in-WXT-M组;5为in-WXT-L组;6为in-Cur组;7为in-AS-IV组;8为in-QMTQ组)2.7miR-126-5p㊁Bcl-2㊁Caspase-9㊁Caspase-3基因表达水平miR-126-5p过表达各组结果显示:与mim-Control组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞miR-126-5p㊁Bcl-2水平明显降低(P<0.05);与mim-Model组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L组㊁mim-Cur 组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组的miR-126-5p㊁Bcl-2基因表达水平明显升高(P<0.05)㊂与mim-Control 组比较,mim-Model组H9c2心肌细胞Caspase-3㊁Caspase-9水平明显升高(P<0.05);与mim-Model 组比较,mim-WXT-H组㊁mim-WXT-M组㊁mim-WXT-L 组㊁mim-Cur组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组的Caspase-3表达水平明显减少(P<0.05),mim-WXT-L 组㊁mim-Cur组㊁mim-AS-IV组㊁mim-QMTQ组的Caspase-9表达水平明显减少(P<0.05),mim-WXT-H 组㊁mim-WXT-M组Caspase-9表达差异无统计学意义(P>0.05)㊂详见表7㊂表7miR-126-5p过表达组H9c2心肌细胞基因表达水平(xʃs)组别miR-126-5p Bcl-2Caspase-3Caspase-9 mim-Control组 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 mim-Model组0.70ʃ0.21①0.44ʃ0.10① 1.97ʃ0.04① 2.02ʃ0.90①mim-WXT-H组 1.35ʃ0.85②0.72ʃ0.12② 1.75ʃ0.17② 2.09ʃ0.38 mim-WXT-M组 1.18ʃ0.07② 1.13ʃ0.11② 1.38ʃ0.07② 1.64ʃ0.05 mim-WXT-L组 1.11ʃ0.09② 1.10ʃ0.11②0.80ʃ0.17② 1.16ʃ0.15②mim-Cur组 1.25ʃ0.86②0.82ʃ0.14② 1.15ʃ0.05② 1.20ʃ0.04②mim-AS-IV组 1.12ʃ0.03② 1.41ʃ0.11② 1.20ʃ0.07② 1.15ʃ0.10②mim-QMTQ组0.95ʃ0.36② 1.18ʃ0.12②0.87ʃ0.10② 1.00ʃ0.02②注:mim-Model组与mim-Control组比较,①P<0.05;与mim-Model组比较,②P<0.05㊂miR-126-5p低表达各组结果显示:与in-Control 组比较,in-Model组H9c2心肌细胞miR-126-5p水平明显降低(P<0.05);与in-Model组比较,in-WXT-H 组㊁in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV 组㊁in-QMTQ组miR-126-5p水平明显升高(P<0.05);与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞Bcl-2水平明显降低(P<0.05);与in-Model组比较, in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组Bcl-2水平明显升高(P<0.05);in-WXT-H组㊁in-Cur 组Bcl-2水平差异无统计学意义(P>0.05);与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞Caspase-3水平明显升高(P<0.05);与in-Model组比较, in-WXT-H组㊁in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组Caspase-3水平明显降低(P<0.05);与in-Control组比较,in-Model组H9c2心肌细胞Caspase-9水平明显升高(P<0.05);与in-Model组比较,in-WXT-M组㊁in-WXT-L组㊁in-Cur 组㊁in-AS-IV组㊁in-QMTQ组Caspase-9水平明显降低(P<0.05),in-WXT-H组Caspase-9水平差异无统计学意义(P>0.05)㊂详见表8㊂表8miR-126-5p低表达组H9c2心肌细胞基因表达水平(xʃs)组别miR-126-5p Bcl-2Caspase-3Caspase-9 in-Control组 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 1.00ʃ0.00 in-Model组0.47ʃ0.06①0.18ʃ0.07① 1.80ʃ0.05① 1.97ʃ0.04①in-WXT-H组 1.11ʃ0.07②0.19ʃ0.02 1.67ʃ0.04② 1.88ʃ0.05 in-WXT-M组 1.00ʃ0.02②0.47ʃ0.04② 1.26ʃ0.05② 1.71ʃ0.06②in-WXT-L组 1.12ʃ0.10②0.42ʃ0.06② 1.11ʃ0.26② 1.16ʃ0.28②in-Cur组0.87ʃ0.09②0.14ʃ0.03 1.08ʃ0.12② 1.13ʃ0.10②in-AS-IV组0.87ʃ0.13②0.38ʃ0.06②0.83ʃ0.04②0.97ʃ0.11②in-QMTQ组0.76ʃ0.10②0.41ʃ0.09② 1.05ʃ0.05② 1.05ʃ0.06②注:in-Model组与in-Control组比较,①P<0.05;与in-Model组比较,②P<0.05㊂3讨论冠心病在中医理论中可归属于 胸痹 心痛 范畴㊂‘金匮要略“曰: 夫脉当取太过不及,阳微阴弦,即胸痹而痛,所以然者,责其极虚也 ㊂说明胸痹心痛的基本病机为 阳微阴弦 ,胸痹病人常虚实夹杂,以虚为主㊂目前,多数学者认为冠心病的发生发展多与 气血 相关㊂史大卓教授认为冠心病的基本病机为 虚在气,留在瘀 ,常用治法为 益气活血法 [10]㊂有学者通过观察冠心病的中医证候分布特点,发现气虚血瘀证居于首位,且男性与女性一致[11]㊂因此,可认为气虚血瘀是冠心病的主要病机㊂益气活血法则是冠心病的主要治法㊂通过观察益气活血法在冠心病方面的应用,发现常用的益气活血剂有补气剂㊁活血化瘀剂㊁稳心汤㊁养心颗粒㊁补阳还五汤㊁益气活血通脉汤等,主要药物包含黄芪㊁党参㊁丹参㊁三七,且作用机制主要集中在炎症反应㊁细胞凋亡等方面[12]㊂微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一种小型非编码RNA,其长度为18~22nt,可以通过识别同源序列干扰㊁转录㊁翻译表观遗传学过程来调节基因的表达[13]㊂已有研究证明,miRNA可以参与诸多生物学过程如细胞生长㊁组织分化㊁细胞增殖㊁胚胎发育与细胞凋亡,与心血管疾病㊁肿瘤和衰老等诊断㊁治疗及预测密切相关[14]㊂冠心病及急性心肌梗死等常伴有心肌损伤[15]㊂近年来,随着科技的进步,研究发现miRNA 可以参与诸多冠心病及心肌梗死的病理改变及治疗,在改善心功能㊁抑制细胞凋亡㊁促进血管新生从而改善心肌损伤等方面具有独特的临床价值[16-18]㊂李娅琳[19]通过观察冠心病病人外周血中miR-126的表达与炎性因子的相关性,发现miR-126与冠心病严重程度呈正相关,当miR-126下调时,可促进机体内血管细胞黏附因子-1(sVCAM-1)及IL-1㊁IL-6㊁TNF-α的释放,从而参与冠心病发生发展㊂已有研究者分析发现,细胞凋亡可通过Beclin-Bcl-2/Bcl-xl复合物㊁mTOR及TNF-α㊁内质网应激等途径激活[20-21]㊂Bcl-2相关蛋白与细胞凋亡密切相关㊂有遗传学表明,Bcl-2对控制细胞程序性死亡至关重要,而Bcl-2蛋白家族则是导致半胱氨酸蛋白酶家族激活的关键调节因子[22]㊂Caspase可参与细胞生长分化与凋亡调节,与真核细胞的凋亡密切相关㊂刘嘉烁等[23]通过观察药物对H2O2诱导的心肌细胞凋亡作用机制,发现橙皮苷可以显著促进抗凋亡基因与Bcl-2蛋白的表达,进而抑制促凋亡基因(Bax)和Caspase蛋白表达,从而阻抑细胞凋亡㊂研究表明,当大鼠脑动脉发生栓塞时,Bcl-2的表达明显降低,Bax与p-p38MAPK的表达明显升高,用药干预后则Bcl-2表达增多,Bax表达减少,说明活化p-p38MAPK通路可调节Bcl-2与Bax的表达进而改善血管缺血再灌注损伤[24]㊂亦有研究发现,当细胞凋亡率明显升高时,Bcl-2蛋白表达显著降低,Caspase-3蛋白表达显著升高,说明细胞凋亡可能与激活Bcl-2/Caspase-3信号通路有关[25]㊂本研究结果显示,当心肌细胞缺氧损伤后,miR-126-5p 表达降低,可以负向调节LDH与ROS的释放,同时增加心肌细胞凋亡率,提高线粒体膜通透性,增加心肌细胞Cyt-C释放水平,减少Bcl-2表达,进而上调Caspase-3及Caspase-9表达㊂用稳心汤及黄芪甲苷与姜黄素干预后,可以上调miR-126-5p表达㊂miR-126-5p 高表达可以明显降低心肌细胞LDH释放水平,减少ROS释放,改善心肌细胞凋亡率,减少mPTP开放,降低线粒体膜通透性,同时减少凋亡因子释放㊂其机制可能与上调Bcl-2表达水平㊁下调Caspase-3和Caspase-9表达水平相关㊂综上所述,本研究通过构建心肌细胞缺氧/复氧模型模拟冠心病心肌损伤过程,证明稳心汤可减轻氧化应激反应,降低线粒体膜通透性,减少Cyt-C等凋亡因子释放,进而抑制心肌细胞凋亡,延缓心肌损伤㊂其作用机制可能与miR-126-5p/Bcl-2/mPTP调控通路有㊃4672㊃C H I N E S EJ O U R N A L O FI N T E G R A T I V E M E D I C I N E O N C A R D I O-C E R E B R O V A S C U L A R D I S E A S E A u g u s t2023 V o l.21 N o.15。