大鼠肾上腺嗜铬细胞原代培养

SRB法检测没食子酸乙酯对PC12细胞的毒性作用【摘要】目的：研究没食子酸乙酯对PC12细胞的毒性作用。

方法：SRB法体外检测没食子酸乙酯对PC12细胞的毒性。

结果：不同浓度的没食子酸乙酯对PC12细胞的增值均有不同程度的抑制作用，且呈剂量依赖性。

结论：1.25μg/mL～5μg/mL浓度范围没食子酸乙酯对PC12细胞的毒害最小。

【关键词】没食子酸乙酯；PC12；毒性在阿尔茨海默病（AD）患者脑组织中普遍存在着神经氧化损伤，AD病人脑中表现出异常高的氧化修饰蛋白、脂类和DNA水平，保护神经元免受氧化胁迫并在寻找合适的抗氧化剂，是防治AD的有效手段。

没食子酸乙酯是一种用于油脂的抗氧化剂、食品添加剂及某些药品的中间体，据报道，没食子酸乙酯具有对神经细胞的氧化应激损伤具有一定保护作用，但同时在一定浓度范围内对神经细胞SH-SY5Y也有一定的毒性[1]，本研究拟以没食子酸乙酯为研究对象，体外评价其对小鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株PC12的毒性作用。

1 材料1.1 药物、细胞株与主要试剂没食子酸乙酯（购自阿拉丁，E119029）；小鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株PC12（上海细胞生物研究所细胞库）；Sulforhodamine B（Sigma，批号230162），胚胎牛血清（FBS，Thermo，批号SV30087.02）；DMEM（Life，12800-017）。

1.2 主要仪器CO2培养箱（Thermo，型号：3111），倒置显微镜（Olympus，型号：IX53），酶标仪（Bio Tek，型号：Elx808）2 方法2.1 细胞培养PC12细胞置37℃、5%CO2的培养箱中，用含10% FBS的高糖DMEM培养液培养。

倒置显微镜观察细胞生长情况，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 SRB法检测没食子酸乙酯对PC12细胞的毒性取对数生长期PC12细胞，胰酶消化，调整浓度为10000个/mL的单细胞悬液并接种于96孔培养板，100μL/孔，24h 后加入含不同浓度没食子酸乙酯培养液，对照组加入等体积溶剂培养液，每组设6个复孔（重复3次），置培养箱中培养72h，终止时弃培养液，加入100μL预冷的10%TCA固定，4℃冰箱置1h。

红景天苷药理作用及其作用机理研究进展韩雪娇;郭娜;朱美宣;于涛【摘要】红景天苷是红景天属植物中广泛存在的一种天然酚类次生代谢产物,具有多种药理作用,应用前景广泛,其药理作用及其作用机理方面的研究备受关注.本文从红景天苷对心脏、脑、神经、肝、肾、肺、皮肤的保护作用以及抗细胞凋亡、抗癌、抗炎、抗衰老、抗疲劳、抗缺氧、抗病毒、抗骨质疏松和糖尿病等方面综述了2009年以来国内外红景天苷药理作用及其作用机理的研究进展,旨在为红景天苷进一步开发和利用提供参考依据.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P171-175)【关键词】红景天苷;药理作用;作用机理;研究进展【作者】韩雪娇;郭娜;朱美宣;于涛【作者单位】东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】R285.5红景天苷[(4-羟基-苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷]，红景天属(Rhodiola)植物中广泛存在的酚苷类化合物，可从植物根、茎提取，亦可通过生物合成途径、化学合成途径、生物催化合成途径等其他途径合成[1]。

随着红景天苷类物质需求量的逐渐增大，其药理作用及其作用机理方面的研究备受关注。

红景天苷药理作用的早期研究进展有肖妤、李昱柳、李妍、佟力、宋月英等人对于红景天苷的抗衰老、抗疲劳、心脑血管保护等方面的药理作用进行了综述[2-6]。

近年来，张丽楠等[7]综述了红景天苷保护心脑血管系统、调节免疫系统、防辐射、抗疲劳、抗肿瘤等药理作用，李凤林[8]综述了从红景天苷抗肿瘤及增强免疫功能以及对心血管系统、中枢神经系统、肝肾等的保护作用，张雪松等[9]综述了红景天苷对肾脏、心血管等器官及系统的保护作用。

1．开天眼觑红尘可怜身是眼中人——从宝、黛形象看《红楼梦》两重世界下的悲剧意义………………………………………………………新闻传播学院汉语言文学专业王雪花指导教师战立忠2．《基督山伯爵》在中国………………………………………………………新闻传播学院汉语言文学专业程广指导教师管恩森3．德占青岛殖民统治时期德文报纸研究……………………………………………………………新闻传播学院新闻学专业徐昊天指导教师周怡4．审计师的法律责任—在我国经济环境的现状下对审计师应该承担的法律责任轻重趋势的研究……………………………………………………………………商学院会计学专业孟凡美指导教师卢书泉5．我国证券投资基金的风险与防范……………………………………………………………………商学院会计学专业徐增辉指导教师曲国霞6．山东省钢铁业上市公司财务指标的主成分分析……………………………………………………………………商学院会计学专业杨正指导教师张志平7．城市文化在城市雕塑设计中的应用——威海海滨城市雕塑考察与再思考…………………………………………………………………商学院旅游管理专业赵佳军指导教师韩国圣8．旅游纪念品开发及销售策划…………………………………………………………………商学院旅游管理专业焦晓琳指导教师于静静9．我国第四方物流形式的物流基地的探讨…………………………………………………………………商学院物流管理专业吴佳指导教师王丽荣10．山东省中小企业国际市场进入模式研究…………………………………………………………………商学院工商管理专业苏阳指导教师宋谊品11．产品模块化的开放式创新管理…………………………………………………………………商学院工商管理专业姜东晓指导教师梁军12．中国民营钢铁竞争战略研究——以河北津西钢铁股份有限公司为例…………………………………………………………………商学院工商管理专业高蕊指导教师刘永仁13．原产地效应对消费者购买意向影响实证研究………………………………………………………………商学院市场营销专业韩杰指导教师魏文忠14．基于人力资源测评的高考志愿填报服务系统研究………………………………………………………………商学院市场营销专业王嘉慧指导教师董昭江15．济南市吸引FDI的区位因素分析及对策研究………………………………………………………商学院国际经济与贸易专业任萌指导教师程昶誌16．山东省承接服务业国际转移的现状及战略对策………………………………………………………商学院国际经济与贸易专业李珊指导教师马卫红17．广东省利用外资和对外贸易关系的实证分析………………………………………………………商学院国际经济与贸易专业李小贤指导教师刘文18．中国境内国际投机资本流动规模、影响因素的实证分析…………………………………………………………………商学院金融学专业李肖健指导教师杨慧19．造船业外汇风险规避技术的应用——黄海造船有限公司实证分析…………………………………………………………………商学院金融学专业杜佳瑛指导教师杨慧20．威海商业银行中间业务发展探析…………………………………………………………………商学院金融学专业孙宗辉指导教师樊敏21．关于完善我国农村养老保险制度的探讨…………………………………………………………………商学院保险学专业潘艳指导教师王春平22．含杂环的化合物的合成及活性测定——α，β不饱和酮的合成…………………………………………………………………海洋学院药学专业杨新美指导教师赵桂森23．冬凌草甲素纳米结晶体内外抗肿瘤作用研究…………………………………………………………………海洋学院药学专业冯飞飞指导教师张典瑞24．利用Cyt b基因对未知鲸骨进行物种的鉴定……………………………………………………………海洋学院生物技术专业姚青指导教师祝茜25．Cytotoxicity, apoptosis induction and downregulation of P-gp expressionby solamargine, in multidrug-resistant tumor K562/A02 cells……………………………………………………………海洋学院生物技术专业张海生指导教师李霞26．大鼠肾上腺嗜铬细胞的原代培养及其基本生理特性：一点电生理记录……………………………………………………………海洋学院生物技术专业王黎指导教师周专27．试论人权内涵的扩大与自由的悖论………………………………………………………………法学院行政管理专业成城城指导教师张铭28．闽南婚宴………………………………………………………………法学院社会工作专业洪秋燕指导教师张景昐29．多线路技术在网络通信程序中的应用………………………………………机电工程学院电子信息科学与技术专业王俊乐指导老师梁成辉30．单片机电子秒表设计…………………………………………信息工程学院电子信息科学与技术专业李建鹏指导老师曹立军31．音频信号分析的方法与验证…………………………………………信息工程学院电子信息科学与技术专业刘林指导老师郑亚民32．工业机器人控制系统的软件开发……………………………………机电工程学院机械设计制造及其自动化专业温海营指导老师王世寰33．无源滤波器与无功补偿设计研究………………………………………………………机电工程学院自动化专业宋宁宁指导教师王松34．景观设计在虚拟世界中的应用——网络游戏中的景观设计……………………………………………………………艺术学院美术学专业张振宇指导教师王友斌35．跳动在丝绸之路上的音符——试读刘德海人生篇《春蚕》……………………………………………………………艺术学院音乐学专业高晋娅指导教师侯新茹36．截断Painlevé展开法推导变系数KdV方程的Lax对………………………………………数学与统计学院信息与计算科学专业李敏指导教师董莹37．Several issues of bioinformatics—Protein sequences analysis………………………………………数学与统计学院数学与应用数学专业于祥田指导教师张玉森38．『今昔物語集』巻十の孔子像について………………………………………………………………翻译学院日语专业卜瑞晓指导教师康振国39．中日古代創世神話の比較研究………………………………………………………………翻译学院日语专业庄恒指导教师康振国40．汉英翻译中的中国英语………………………………………………………………翻译学院英语专业申肖肖指导教师任怀平41．浅谈中学英语教学改革………………………………………………………………翻译学院英语专业许琪指导教师郑长春42．外部环境对英语学习动机的影响--基于山东大学威海分校的个案分析………………………………………………………………翻译学院英语专业郑霞指导教师常晓梅43．CaSO4.2H2O、CaSO4.1/2H2O和CaSO4晶体的多光谱分析………………………………………空间科学与应用物理学院应用物理学专业刘洋指导教师王阿莲武中臣44．氮化锌薄膜的结构、光学性质和稳定性研究…………………………………空间科学与应用物理学院应用物理学专业闫金承指导教师杨田林45．威海市非正规机关韩国语教育现状及展望………………………………………………………………韩国学院朝鲜语专业李丛丛指导教师金哲。

天麻活性成分减轻大鼠神经元氧糖剥夺/复糖复氧损伤的作用机制Δ王锦1＊，夏霜莉1，杨媛2，代蓉1 #（1.云南中医药大学中药学院，昆明　650500；2.昆明医科大学第一附属医院临床药学中心，昆明　650032）中图分类号 R 965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2023）23-2886-05DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.12摘要 目的 研究天麻活性成分3，4-二羟基苯甲醛（3，4-DD ）对大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs ）-大鼠肾上腺嗜铬细胞PC 12共培养体系氧糖剥夺/复糖复氧（OGD/R ）损伤的改善作用机制。

方法 采用Transwell 小室共培养BMECs 与PC 12细胞，然后分为对照组、模型组、丁苯酞组（阳性对照组，0.1 mmol/L ）、3，4-DD 组（0.1 μmol/L ），除对照组外，其余各组共培养体系均复制OGD/R 损伤模型。

同时，共培养体系以相应药物或培养基干预BMECs 24 h ，然后检测体系跨膜电阻（TEER ）以及PC 12细胞中乳酸脱氢酶（LDH ）活性、脑源性神经营养因子（BDNF ）水平以及TrkB 、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA 表达水平。

结果 与对照组比较，模型组共培养体系TEER 以及PC 12细胞中LDH 活性、BDNF 水平均显著降低（P ＜0.01），PC 12细胞中TrkB 、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA 表达水平均显著升高（P ＜0.01）；与模型组比较，3，4-DD 组、丁苯酞组共培养体系TEER 以及PC 12细胞中LDH 活性、BDNF 水平和TrkB 、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA 表达水平均显著升高（P ＜0.05或P ＜0.01）。

结论 3，4-DD 可通过作用于BMECs 减轻神经元OGD/R 损伤，其作用机制可能与激活BDNF/TrkB 信号通路有关。

中风醒脑液SD 大鼠含药血清对体外培养神经细胞缺血再灌注损伤保护作用的实验研究李艳青1，张晓云2（1.成都中医药大学，四川成都610075；2.成都中医药大学附属医院，四川成都610072）摘要：目的：探讨中药复方中风醒脑液SD 大鼠含药血清对体外培养的神经细胞缺血再灌注损伤的保护作用，为进一步开展临床研究提供依据。

方法：采用血清药理学和原代神经细胞培养的方法，用SD 大鼠的含中风醒脑液血清体外培养PC －12神经细胞，用连二亚硫酸钠造成细胞缺氧损伤模型，用H 2O 2造成细胞氧化损伤模型，建立缺血再灌注的体外细胞模型，分别在造模后2h 、4h 用alamarBlue 染色，用酶标仪测定吸光度，检测PC －12细胞的生长活力及应用流式细胞技术检测细胞的凋亡率。

结果：中药复方中风醒脑液SD 大鼠含药血清对体外培养的神经细胞缺血再灌注损伤具有保护作用。

结论：中风醒脑液是一种神经细胞保护剂，可以增加神经细胞存活率与活力，抑制其凋亡率。

关键词：中风醒脑液；缺血再灌注；实验研究中图分类号：R255．2文献标识码：B 文章编号：1000－1719（2011）10－2089－03收稿日期：2011－02－16基金项目：国家自然科学基金项目（30973747）作者简介：李艳青（1980－），女，山东潍坊人，博士研究生，研究方向：中西医结合内科学。

通讯作者：张晓云（1953－），女，四川乐山人，教授、主任医师，博士研究生导师，研究方向：中西医结合内科学。

缺血性脑血管病（Ischemic Cerebral Vesscular Dis-ease ，ICVD ）是威胁人类健康与生存的主要疾病之一，致残率极高，是目前重点防治的疾病之一。

在ICVD 的治疗中重建血流或增强缺血区的血流供应是缺血脑组织修复损伤的必需条件，但同时带来的再灌注损伤也是目前最受关注的问题。

全国重点专病“中风病”建设单位、成都中医药大学附属医院急诊科陈绍宏教授是我国著名中医急症专家，他经过多年潜心观察和临床验证，提出了“中风核心病机”理论［1］，认为中风病的核心病机是：元气亏虚、痰瘀互阻、风火相煽；其中以元气虚为本，痰、瘀、风、火都是继发于元气虚的内生之邪。

大鼠肾脏原代细胞分离方法在生物医学研究领域，大鼠肾脏原代细胞的分离对于探讨肾脏生理、病理过程及疾病治疗具有重要意义。

本文将详细介绍大鼠肾脏原代细胞的分离方法，以供相关研究人员参考。

一、实验材料1.实验动物：健康成年SD大鼠。

2.主要试剂：D-Hank"s溶液、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、EDTA、胎牛血清、DMEM/F12培养基、抗生素（青霉素和链霉素）。

3.主要仪器：手术器械、显微镜、细胞计数仪、离心机、培养箱等。

二、实验步骤1.动物处理（1）将大鼠用CO2吸入法处死，取出肾脏。

（2）将肾脏放入预冷的D-Hank"s溶液中，清洗表面的血迹。

（3）去除肾脏周围的脂肪组织和包膜，分离出肾皮质。

2.细胞分离（1）将肾皮质剪成1mm的小块，放入含有胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶和EDTA的消化液中。

（2）在37℃、5% CO2的培养箱中消化30-60分钟。

（3）用细胞筛过滤消化液，收集细胞悬液。

（4）用D-Hank"s溶液洗涤细胞悬液，去除未消化的组织碎片。

（5）离心（1000r/min，5分钟），弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞。

3.细胞计数与培养（1）使用细胞计数仪对细胞进行计数。

（2）将细胞以适当的密度接种到培养瓶中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

（3）定期观察细胞生长情况，更换新鲜培养基。

三、注意事项1.在实验过程中，要确保细胞活力，减少细胞损伤。

2.消化时间需根据大鼠年龄、体重及消化酶的活性进行调整。

3.严格无菌操作，避免细胞污染。

4.细胞培养过程中，要定期观察细胞生长状态，及时更换新鲜培养基。

通过以上方法，可以成功分离出大鼠肾脏原代细胞，为后续研究提供可靠的实验材料。

PC12细胞转化为神经元样细胞的培养、鉴定及氧糖剥夺模型的制备何金婷;莽靖;郭洪亮;梅春丽;胥桂华;陈罕;徐忠信【摘要】@@ 本实验采用PC12细胞是由大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤分离并建立起的细胞系,其在体外经NGF刺激诱导后可向交感神经元分化,最终导致PC12细胞在生理、生化方面具有神经元样的功能,同时应用体外氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)来模拟体内脑缺血过程,为探讨缺血缺氧状态下对神经元的活力、凋亡、信号通路机制的研究定物质基础.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)005【总页数】3页(P769-771)【作者】何金婷;莽靖;郭洪亮;梅春丽;胥桂华;陈罕;徐忠信【作者单位】吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033【正文语种】中文本实验采用PC12细胞是由大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤分离并建立起的细胞系，其在体外经NGF刺激诱导后可向交感神经元分化，最终导致PC12细胞在生理、生化方面具有神经元样的功能，同时应用体外氧糖剥夺（oxygen－glucose deprivation，OGD）来模拟体内脑缺血过程，为探讨缺血缺氧状态下对神经元的活力、凋亡、信号通路机制的研究定物质基础。

1 材料和方法1.1 实验细胞大鼠PC12细胞株购自北京金紫晶生物医药技术有限公司（中国医学科学院肿瘤细胞库）。

鼠神经生长因子（NGF）（Sigma公司，美国）。

1.2 实验方法1.2.1 PC12细胞的培养、传代将细胞悬液加入含有DMEM完全培养基，培养液2－3天更换一次。

收稿日期:1998206205.曾旭辉,男,1969年生,博士研究生;武汉,华中理工大学生物物理与生物化学研究所(430074).3国家杰出青年基金(39525009)和国家自然科学基金(69571014)资助项目.咖啡因对大鼠肾上腺嗜铬细胞钙信号调节作用3曾旭辉　娄雪林　周　专　瞿安连(华中理工大学生物物理与生物化学研究所)摘　要　在单个大鼠肾上腺嗜铬细胞上,采用钙显微荧光测量方法,测量了咖啡因对胞内游离钙浓度的影响.实验结果表明,在2Ca 2+外液中,咖啡因(1mmo l L ,10mmo l L ,40mmo l L )对细胞的自发振荡表现出明显的抑制作用;对不表现自发振荡的细胞,咖啡因能引起钙浓度的升高或钙振荡.在无外钙条件下研究连续咖啡因刺激引起的钙浓度变化,发现胞内钙库易排空,但随后的含钙咖啡因刺激仍可引起钙升高.同时,在无外钙条件下施加咖啡因可检测到激素的分泌,表明由咖啡因导致的钙库释放可以独立地触发分泌.关键词　嗜铬细胞;咖啡因;钙信号;胞内钙库分类号　Q 455 肾上腺嗜铬细胞是研究细胞分泌机制的经典细胞模型,钙信号在其分泌中起了非常重要的作用[1].外钙内流在细胞分泌中的重要地位较明确,而钙库释放的作用则表现出明显的种间差异性.咖啡因是R yanodine 敏感钙库激动剂,然而它对钙信号和分泌的影响显得很复杂,尤其在胞外无钙条件下的意义不很清楚.本文在单个大鼠肾上腺嗜铬细胞上,系统探讨了咖啡因对胞内钙信号的调节作用.1　材料和方法1.1　试剂胶原酶I 、透明质酸酶、DN ase I、多聚赖氨酸、caffeine 、H EPES 和EGTA 为Sigm a 产品,DM E M 、胎牛血清为Gibco 产品,其他试剂为国产分析纯.1.2　细胞制备、培养体重150～250g 的雄性W istar 大鼠以乙醚麻醉后颈椎脱臼处死,取肾上腺剪除被膜及皮质,将髓质剪成小块,在0.3%胶原酶I 、0.24%透明质酸酶、0.2%DN ase I 的混合酶液中37℃下消化约50m in .细胞经离心收集,滴加在预涂有多聚赖氨酸的盖玻片上,加90%DM E M 与10%胎牛血清培养基在37℃进行培养[2].1.3　显微荧光测量方法将培养2～10d 的细胞置换到标准胞外液(单位mm o l L :140N aC l ,2.8KC l ,1M gC l 2,2CaC l 2,10H EPES ,10葡萄糖.pH 7.2)中,加入酯化的钙荧光探针Fu ra 22 AM 至终浓度4Λm o l L ,在37℃孵育30m in ,再以胞外液冲洗2～3次,装入内盛1mL 胞外液的测量皿(直径35mm )中,避光放置约5m in 后在Zeiss A x 2i overt 100荧光显微镜上以345380nm 的双波长法测量单个嗜铬细胞的胞内游离钙浓度([Ca 2+]i ).采样速率为1H z .如在无外钙条件下实验,则测量皿中胞外液去除Ca 2+,而加入0.5mm o l L 的EGTA ,并将M gC l 2增至2.5mm o lL ,以保持溶液渗透压不变.实验在(25±2)℃下进行.在全细胞膜片钳实验方式下对[Ca 2+]i 计算公式中的参数作校准[3].由于实验中采用酯化的Fu ra 22 AM ,进入胞内的部分Fu ra 22将因隔室效应(Com p artm en t )而对胞浆内Ca 2+不敏感.所以本研究所测的[Ca 2+]i 在绝对数值上不一定精确,仅作参考,但不影响对[Ca 2+]i 变化的观测.1.4　咖啡因的施加在PP 283电极拉制器(N arish ige ,日本)上拉制出孔径5Λm 的玻璃微管,以标准胞外液或无钙胞外液配制的咖啡因溶液充灌.刺激时,以M X 21微操纵器(N arish ige ,日本)将此加药微管迅速移入溶液,其孔口移至相距约20Λm 而朝向所测细胞处,对微管内施加正向气压,向细胞加药10s 左右,立即将加药管撤出,以下各图中的箭头第27卷第1期 华　中　理　工　大　学　学　报 V o l .27　N o.11999年　1月 J.H uazhong U n iv .of Sci .&T ech . Jan .　1999指示为加药起始时刻.2　结果与分析2.1　标准胞外液中咖啡因的钙信号调节作用标准胞外液中,对表现自发钙振荡的细胞,以1mm o l L ,10mm o l L 或40mm o l L 含钙咖啡因刺激时,除可见咖啡因导致的钙变化外,21例细胞中有5例表现出振荡频率的减慢(图1(a )),10例振荡完全停止(图1(b )),4例影响不大,表现出振荡频率增快或振幅增高的各有一例(图未示出).除40mm o l L 下咖啡因导致的钙升高维持较长外,各浓度对自发振荡的影响无显著差别.当改用无钙10mm o l L 咖啡因刺激时,基本类似有钙咖啡因的作用,但9例中有2例表现为刺激后先静止一段时间再开始振荡(图1(c )).图1　咖啡因对自发钙振荡的影响 (a )降低了振荡频率;(b )完全阻碍振荡;(c )无钙咖啡因刺激下振荡停止一段时间后又恢复对不表现自发钙振荡的细胞,各种浓度含钙咖啡因的刺激亦可引起[Ca 2+]i 的升高(图2(a )),产生反应的细胞比例依次为3 4(1mm o lL ),2 3(10mm o l L )和4 5(40mm o l L ),40mm o l L 浓度下钙升高后维持的时间明显较长.不含钙咖啡因的刺激也引起[Ca 2+]i 的升高(图2(b )),细胞响应比例为3 5(1mm o l L ),4 5(10mm o l L )和4 6(40mm o l L ),1mm o l对不表现自发振荡的细胞,咖啡因刺激有反应的22例细胞中有2例表现出刺激后的钙振荡(图2(c )).图2　标准胞外液中,咖啡因对不表现钙自振的细胞[Ca 2+]i 的影响　(a )含钙咖啡因刺激;(b )无钙咖啡因刺激;(c )咖啡因刺激引发的钙振荡2.2　无钙胞外液中连续咖啡因刺激的钙信号调节作用胞外有钙条件下钙库释放后会重新填充,故胞外无钙条件下更易于说明咖啡因连续刺激对钙库释放的影响.无钙胞外液中,用有钙10mm o l L 咖啡因连续刺激细胞,发现细胞基钙可被逐步抬高(图3(a ),3例).而用无钙10mm o l L 咖啡因连续刺激时,第一次刺激有反应的细胞大多数在随后的刺激中不再表现钙升高,这说明第一次的不含钙咖啡因刺激使钙库内Ca 2+迅速释放至胞浆后,又被交换出胞外由EGTA 螯合,钙库未能重新装载游离钙离子,因而在再次受到无钙咖啡因刺激时,钙库不能再释放Ca 2+,而含钙咖啡因刺激时则由于胞外Ca 2+内流至胞浆,又可引起[Ca 2+]i 升高(图3(b ),5例).但少数细胞却可继续表现出对无钙咖啡因的反应性(图3(c ),2例).3　讨论Pao la 等曾观察到,在鼠嗜铬细胞上存在着较大比例的自发振荡,然而其产生的机理不太清楚[4].在我们的实验中也发现一半以上的细胞表现出自发振荡,然而随着实验时间的延长,自发振19第1期 曾旭辉等:咖啡因对大鼠肾上腺嗜铬细胞钙信号调节作用 图3　无钙胞外液中咖啡因连续刺激对鼠嗜铬细胞[Ca2+]i的影响 (a)含钙咖啡因连续刺激;(b)前三次刺激不含钙,第四次刺激含钙;(c)不含钙咖啡因连续刺激下也可出现连续反应荡细胞的比例则减小了,也许培养或实验中外环境的改变是自发振荡产生的部分原因.在无钙胞外液中未发现自发振荡,提示其与胞外钙内流有关.如上述实验结果所表明的那样,咖啡因对自发振荡的影响较复杂,但总体上趋于抑制振荡,这与Pao la的报道有所不同,该文中有较大比例的细胞改变了振荡形式.在有钙胞外液中,对不表现自发振荡的细胞含钙或不含钙咖啡因均能引起钙升高.文献[5]曾报道40mm o l L咖啡因对鼠嗜铬细胞毒性显著[5],在我们的实验中虽发现此浓度下钙峰衰减较慢,有的甚至达5m in以上,但没有观察到细胞明显的死亡.对此类细胞,能被咖啡因诱导而出现振荡的细胞比例较小,明显低于三磷酸肌醇敏感钙库激动剂引发振荡的比例.无钙胞外液中,含钙不含钙咖啡因的刺激也均能引起鼠嗜铬细胞钙升高.为考察内源性[Ca2+]i升高对嗜铬细胞分泌的意义,文献[5]曾应用碳纤电极方法记录到了此情况下嗜铬细胞的分泌信号,这表明咖啡因激活的胞内钙库的释放可以独立地导致分泌,而不依赖于外钙内流.牛嗜铬细胞则对咖啡因不敏感,此种种间差异的原因还不明确.无钙胞外液中,无钙咖啡因连续刺激的结果提示此种刺激能迅速(10s内)使钙库排空,当无法使钙库重新填充时,细胞对随后的刺激不反应.但少数细胞却能继续响应无钙咖啡因刺激,这可能有两种原因,一是钙库的容量非常大,一次刺激不足以完全排空,故随后的刺激也有反应;另一种可能是细胞膜泵出胞内钙的机制受到了损伤,使钙库有时间重摄取其自身释放的钙,有钙咖啡因刺激下基线的抬高也可能是这种原因引起的.一些研究者曾观察到嗜铬细胞处于无钙胞外液中即剥夺外钙约15m in后,钙库被排空,从而对咖啡因不敏感[6].在我们的实验中发现,培养早期的细胞(4d以内),2h后仍能表现出对咖啡因的反应,而培养时间较长的细胞(7d以上)易表现出钙库排空现象,推测无钙胞外液中钙库的排空情况可能与细胞的生理状况有关.参考文献1　N eher E,Zucker R S.M u lti p le Calcium2D ependen t P rocess R elated to Secreti on in Bovine Ch rom affin Cells.N eu ron,1993,10:21～302　叶　琴,瞿安连,康华光等.大鼠肾上腺嗜铬细胞原代培养的一种实用方法.华中理工大学学报,1997,25(6):1～33　徐　涛,刘乃江,瞿安连等.SH2SY5Y细胞胞内钙库特性研究.生物物理学报,1996,12(2):234～2384　Pao la D A,D an iele Z.M echan is m s of[Ca2+]i O scil2 lati on in R at Ch rom affin Cells.T he Jou rnal of B i o2 logical Chem istry,1993,268(20):15213～15220 5　F i m negan J M,Bo rges pari on of Cyto so lic Ca2+and Exocyto sis R espon ses from Single R at and Bovine Ch rom affin Cells.N eu ro science,1996,71(3):833～8436　Guo X,P rzyw ara D A,W akade T D,et al.Exocyto2 sis Coup led to M ob ilizati on of In tracellu lar Calcium by M u scarine and Caffeine in R at Ch rom affin Cells.J.N eu rochem.,1996,67(1):155～162(下转第96页)On the M ethod of Pla ti ng Cell Culture from Taxus Ch i nen sisL u M ing bo　L in L an　Y u F ei　H ong Q iAbstract　In callu s p late of taxu s,the m o st su itab le m edium w as the m odified M S m edium added0.5 m g L NAA and0.5m g L6BA.T he grow th cu rve of cell exh ib ited that the op ti m um p eri od fo r callu s subcu ltu re w as40days;T he best com b inati on of sucro se and gluco se w as30g L and10g L resp ec2 tively.T he fittest concen trati on of N H+4,NO-3and PO3-4w ere10mm o l L,40mm o l L and1.25mm o l L resp ectively.T he op ti m um pH w as5.8fo r cell p lating cu ltu re.T he p lating efficiency cou ld also be effectively increased w hen the p lating m edium w as su itab lely supp lem en ted w ith glycine and p an2 to thenate calcium.Conditi oned m edium(C M)stemm ing from cell su sp en si on cu ltu re cou ld rem ark2 ab ly p rom o te the fo rm ati on of single cell clone from cu ltu re cells of taxu s below a critical cell p lating den sity.Keywords　taxu s;single cell clone;p late cu ltu reL u M i ngbo　A sso.P rof.,D ep t.of B i o logical Eng.,HU ST,w uhan430074,Ch ina.(上接第92页)On Caffe i ne Con troll i ng over the Ca lc iu m Signa l i n Si ngleRa t Adrena l Chromaff i n CellsZ eng X uhu i　L ou X uelin　Z hou Z huan　Q u A n lianAbstract　U sing m icroflu rescen t calcium m easu rem en t techn iques,the effects of caffeine on the [Ca2+]i of single rat ch rom affin cells are studied.In2Ca2+2con tain ing ex tracellu lar so lu ti on,the app li2 cati on s of caffeine(1mm o l L,10mm o l L,o r40mm o l L)al w ays b lock their spon taneou s o scilla2 ti on.To silen t cells,caffeine often leads to calcium tran sien ts o r calcium o scillati on.W hen the cells sti m u lated by caffeine successively in Ca2+2free conditi on s,the calcium sto res w ere em p tied easily, bu t the sub sequen t app licati on of caffeine con tain ing Ca2+still can elevate[Ca2+]i.U nder Ca2+2free conditi on s,the app licati on s of caffeine also can resu lt in the secreti on of ho rm ones.It is verified that the release of calcium sto res induced by caffeine can lead to secreti on indep enden tly of ex tracellu lar calcium.Keywords　ch rom affin cell;caffeine;calcium signal;calcium sto resZeng Xuhu i　Docto ral Candidate;In stitu te of B i op hysics&B i ochem istry,HU ST,W uhan430074, Ch ina.。

原代huvec细胞培养注意事项
原代HUVEC细胞是一种常用的血管内皮细胞模型，主要用于研究血管生物学和心血管疾病的发生机制。

在进行HUVEC细胞的培养时，需要注意以下几点。

选择适当的培养基。

常用的HUVEC细胞培养基包括EGM-2和M199等，可以根据实验需要选择合适的培养基。

在培养基中添加适量的胎牛血清或人血清，可以提供细胞所需的营养物质和生长因子。

维持适宜的培养条件。

HUVEC细胞对温度和CO2浓度较为敏感，一般在37摄氏度、5% CO2下培养。

此外，保持培养皿内的湿度也很重要，可以在培养皿内加入一些水或PBS来增加湿度。

注意细胞的传代和增殖。

HUVEC细胞在培养过程中会不断增殖，当细胞密度达到80%到90%时，应及时进行传代。

传代前要用PBS 洗涤细胞，然后使用胰酶将细胞从培养皿上剥离下来，最后用新的培养基重新培养。

注意细胞的纯度和鉴定。

HUVEC细胞的纯度对实验结果的准确性有重要影响，因此需要对细胞进行鉴定。

常用的方法包括免疫细胞化学染色和流式细胞术等。

注意细胞的保存和储存。

HUVEC细胞可以冷冻保存，使用液氮保存细胞可以延长细胞的保存时间，并且可以避免细胞的突变。

在冷冻
保存之前，需要将细胞用含10% DMSO的培养基悬浮，并分装到冻存管中，再放入液氮中保存。

HUVEC细胞的培养需要严格控制培养条件，注意细胞的传代和纯度鉴定，以及细胞的保存和储存。

只有做好这些注意事项，才能保证细胞的正常生长和实验结果的准确性。

1、大鼠骨髓来源肥大细胞原代培养并鉴定：脱颈法处死SD大鼠（体重约200g），75%酒精浸泡消毒3min。

转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，尽可能将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨。

剪去股骨两端的股骨头，使用5ml注射器吸取RPMI 1640基础培养基后将骨髓吹打出来，吹打过程中尽可能将骨髓冲洗干净。

使用巴氏吸管将骨髓吹打成单细胞悬液，1000rmp/min离心5min收集细胞如发现收集的细胞中有大量红细胞时需使用红细胞裂解液处理。

使用肥大细胞专用培养基重悬细胞，接种至T25瓶内培养。

培养过程中每2-3天换液一次，当发现有细胞变圆脱落时，收集脱落细胞至新的T25瓶内诱导培养，培养四周时肥大细胞诱导成熟，取成熟的肥大细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定；取脱落细胞培养一周、二周、三周、四周的细胞培养上清进行组胺含量检测。

2、小鼠骨髓来源肥大细胞原代培养与鉴定：小鼠经脱颈椎处死，75%酒精消毒后，取完整股骨，用1mL注射器吸取无菌PBS从股骨一端刺入，将骨髓细胞洗出，直到骨髓腔变白。

离心收集细胞，加入3mL红细胞裂解液，室温裂解3min之后，用PBS漂洗2次。

采用现配的原代细胞培养工作液（含青、链霉素各1000U/mL，10% FBS，IL-3 10 ng/mL，SCF 10ng/mL的RPMI-1640培养基培养液）将细胞重悬，按照106个/mL接种于六孔板中，每孔加3mL培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养，每7d 将悬浮细胞按照106个/mL转移到新的培养板中，继续培养，4-6周细胞分化成熟。

四周后收集悬浮细胞，部分细胞用于流式检测纯度，部分用含10% FBS的RPMI-1640培养基重新接板。

纯度检测：向诱导分化细胞中按1：200加入肥大细胞表面标志物APC-CD117 ，FITC- FcεRIα，4℃孵育60min ，无菌PBS 漂洗3次，流式检测肥大细胞纯度。

（SCF：Stem cell factor，干细胞因子；又称肥大细胞生长因子MGF）3、大鼠腹腔肥大细胞的分离与培养：选用体重220-250g的SD大鼠。