HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告
前言
肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的名称有多种多样，如肝贮脂细胞（fat-storing cell，FSC）、脂细胞（1ipocyte）、维生素A贮存细胞（vitamin A-storing cell）、窦周细胞（perisinusoidal cell）、Ito细胞等。HSC位于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells, SEC）和肝细胞。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。此外，HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。HSC胞质内有1～14个直径约1.0～2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴，胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。胞核形态不规则，由于脂滴的挤压，常致细胞核有一个或多个凹陷，核内可见1～2个核仁。正常肝脏中HSC的数目很少，只占肝细胞总体数目的5%～8%及总体体积的1.4%，但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。
正常情况下HSC表现为富含Vitamin A脂滴的静止型，其功能主要有：
（1）代谢和贮存Vitamin A：肝脏储存有体内80%左右的维生素A，对体内维生素A的代谢起着重要作用。视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合，然后转运到邻近的HSC储存。
（2）储存脂肪：正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯，为肝细胞提供能源。
（3）合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。目前的研究认为，HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的主要合成细胞。正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主，其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。HSC 还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。
（4）合成基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase, MMP）及其组织抑制剂（tissue inhibitor of metallo proteinase，TIMP）:正常情况下，HSC能分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2等以降解各种细胞外基质，同时分泌组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1防止胶原过度降解，使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中。
（5）表达细胞因子及受体：正常情况下，HSC可以分泌肝细胞生长因子（HGF），参与肝细胞再生的调控。此外，HSC还能表达少量的转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生的生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）和胰岛素样生长因子（IGF）等，同时HSC能表达TGF-β1的II、III型受体和PDGF受体的α亚单位等。
（6）参与肝窦血流调节：HSC伸出胞突包绕着肝窦，通过其纤长突起的收缩功能调节肝窦内微循环，从而影响着肝脏的血流分布和门静脉压力。
一、材料与方法
1. 实验材料
1.1实验材料
大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自与中国科学院上海细胞所。
1.2主要仪器
CO2细胞培养箱：上海力康仪器有限公司Smart Cell HF-90
生物安全柜：上海力康仪器有限公司HF1200LC
台式高速冷冻离心机：上海力康仪器有限公司Neofuge 15R
台式低速离心机：上海飞鸽仪器有限公司TGL-16GB
荧光倒置显微镜：日本尼康公司Eclipse TS100-F
显微镜：日本尼康公司E200
病理图文分析系统（工作站）：上海千屏公司
恒温水浴锅：上海精宏仪器厂DK-80
液氮罐：成都金凤仪器厂YDS-50-125
-20℃低温冰箱：合肥美菱公司DW-HL388
单子分析天平（0.01mg）：德国梅特勒AB304-S
手动单道移液器：德国Eppendorf公司Research plus
1.3主要试剂
名称货号/批号厂家
PBS磷酸盐缓冲液粉剂PBS0060, Lot#13061706 福州迈新生物技术开发有限公司胎牛血清16000044，Lot#1183723 美国Life technologies公司DMEM培养基C11995599BT，Lot#8113238 美国Life technologies公司
0.25%胰酶25200056，Lot#1268598 美国Life technologies公司
青霉素-链霉素双抗（10000U）SC30010，Lot#J130071 美国Hyclone公司
小鼠抗a-SMA单克隆抗体美国Santa Cruz公司
小鼠两步法免疫组化试剂盒KIT9902，Lot#1301319902 福州迈新生物技术开发有限公司浓缩型DAB试剂盒DAB0031，Lot#1307290031 福州迈新生物技术开发有限公司FITC标记山羊抗小鼠二抗北京中衫金桥有限公司
油红O染色试剂盒D027 南京建成生物工程有限公司
苏木素染液福州迈新生物技术开发有限公司油酸西安化学试剂厂
2.实验方法
2.1试剂配制及抗体稀释
10%血清完全培养基：10ml的胎牛血清加入90ml的DMEM培养基中，添加1ml的青-链霉素双抗溶液。
0.2mM的油酸完全培养基：1ml的20mM的油酸加入99ml的完全培养基中。
a-SMA抗体工作液：a-SMA一抗（200μg/ml）取20μl加入到980μl的PBS中。
FITC标记的山羊抗小鼠二抗工作液：FITC标记的山羊抗小鼠二抗（200μg/ml）取20μl 加入到980μl的PBS中。
20%DMSO细胞冻存液：2ml的DMSO溶液加入8ml的完全培养基中。
油红O染液：油红O储存液与双蒸水以3:2的比例混合，并用滤纸进行过滤，使用前2h内配制。
2.2 HSC-T6细胞培养基本操作方法
细胞传代：观察培养瓶（25cm2）中细胞贴壁融合达90%时，即可进行细胞的传代，操作步骤如下。开启生物安全柜紫外消毒30min，以75%乙醇擦拭台面灭菌，并预先准备3个细胞培养瓶（25cm2）、15ml离心管、无菌过滤的PBS、0.25%胰酶溶液、完全培养基，取出长满细胞的培养瓶，倒空瓶中的培养基，加入2ml过滤灭菌的PBS缓冲液反复冲洗2遍，倒空PBS 缓冲液，每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平铺在细胞层面上，缓缓摇动细胞培养瓶，待细胞70%脱落时加入1ml的完全培养基终止胰酶的消化作用，并用吸头反复冲洗培养瓶底将未脱落的细胞冲洗下来，转移液体至15ml的离心管中，1800r/min离心5min，小心吸弃离心管中的液体，并用1ml的完全培养基重悬沉淀的细胞，倒置显微镜下观察细胞调整合适的细胞密度接种到培养瓶中,37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养，6h后持续观察细胞贴壁状态，待细胞达到50%～70%贴壁融合时倒空瓶中培养基，重新加入5ml的
