实验一分光光度法测定微量铁的含量
Ⅰ．实验目的
(1)掌握用邻二氮菲显色法测定铁的原理和方法。
(2)了解分光光度计的构造及分光光度计的正确使用。
(3)学会工作曲线的制作和样品的测定。
Ⅱ．实验用品
仪器：721型(或其他型号)分光光度计、50mL容量瓶、吸量管。
药品：(NH4)2 Fe(SO4)2·6H2O（分析纯）、邻二氮菲（分析纯）、盐酸羟胺（分析纯）、NaAc（分析纯）、无水乙醇（分析纯）
溶液配制：（1）. 10.0 μg·mL-1(即0.01 mg·mL-1)铁标准溶液：准确称取１０．０ｍg(NH4)2 Fe(SO4)2·6H2O于烧杯中，用2 mol·L-1盐酸15 mL溶解，移入１０00 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀。再准确稀释10倍成为含铁10 ug·mL-1标准溶液；（2）. 0.15％邻二氮菲溶液(临时配制)：先用少许乙醇溶解，再用水稀释；（3）. 盐酸羟胺溶液10％(临时配制)；（4）. NaAc溶液1mol·L-1。
Ⅲ．实验原理
在测定微量铁时，通常以盐酸羟胺或抗坏血酸还原Fe3+为Fe2+，在pH=2~9范围内，使Fe2+与邻二氮菲反应生成稳定的橙红色配合物[Fe(C12H8N2)3] 2+，其lgK f=21.3，λmax=510nm。反应式如下：
本方法不仅灵敏度高(摩尔吸光系数ε= 1.1×104L·mol·cm-1)，而且选择性好，相当于含铁量40倍的Sn2+，Al3+，Ca2+，Mg2+，Zn2+，SiO32-,20倍的Cr3+，Mn2+，PO43-；，5倍的Co2+，Cu2+等均不干扰测定。在分光光度法中，一般均选用有色物质的最大吸收波长λmax作为入射光波长(除非在该波长下有干扰)，这样，测量的灵敏度和准确度都较高。
λmax通常通过制作吸收曲线得到，方法是：取待测物的1个标准溶液，在不同的波长(λ)下测量其吸光度(A)，以A对λ作图，便得吸收曲线，曲线波峰所对应的波长即为最大吸收波长。
Ⅳ．实验步骤
1．测定波长的确定
(1)显色溶液的配制在序号为1~6的6只25mL容量瓶中，用吸量管分别准确加入10.0 μg·mL-1铁标准溶液0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，再分别加入10％盐酸羟胺溶液1mL，摇匀后放置2min，再各加入1mol·L-1NaAc溶液2.5mL及0.15％邻二氮菲溶液1mL，
每加一种试剂后，均摇匀(不要加盖)容量瓶中的溶液，再加另一种试剂，最后用以水稀释至刻度，加盖摇匀。
(2)吸收曲线的测量在分光光度计上，用1cm吸收池，以不含铁的试剂空白溶液(1＃)为参比，在450~550nm之间，每隔10nm测定4＃铁标准溶液的吸光度A(读数准确至±0.001)。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，从而选择测定铁的最大吸收波长λmax。【注意】每次改变波长之后，都要校准仪器并用参比溶液调节仪器的吸光度值为0 ！
2．标准曲线的绘制
以试剂空白溶液为参比，用1cm吸收池，在选定波长下测定2~6号各显色标准溶液的吸光度。在坐标纸上，以铁的浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。3．试样溶液的测定
吸取未知液2.5 mL，按上述标准曲线相同条件和步骤测定其吸光度。根据未知液吸光度Ax，在标准曲线上查出未知液相对应铁的量，然后计算试样中微量铁的含量，以每升未知液中含铁多少克表示（g·L-1）。
Ⅴ．实验结果
1.测定波长的确定
λ/nm 450460 470 480490500510520530540 550
A
以A为纵坐标，λ为横坐标，在方格坐标纸上绘制光吸收曲线，并确定出最大吸收波长。
2.标准曲线的绘制及样品测定
序号 1 2 3 4 5 6 待测试样铁标准溶液/mL 0.00 2.00 4.00 6.008.0010.00
含铁量/μg 0 20.040.060.080.0100.0 Cx A
Ⅵ. 问题讨论
1.显色时，还原剂、缓冲溶液、显色剂的加入顺序可否颠倒？为什么？
2.制作吸收曲线时，为什么每改变一次入射光波后，都必须用参比溶液调零？
3.根据自己的实验数据，计算邻二氮菲-Fe(Ⅱ)络合物在选定波长下的摩尔吸收系数。是
否达到1.1×104? 若未达到，原因是什么？
4.实验所得的标准曲线中，各点是否完全在直线上？若不是，可能是什么原因引起的？
