DNA疫苗在动物医学中的研究进展

DNA疫苗在动物医学中的研究进展

摘要：本文从DNA疫苗的研究历史，构建，优缺点，临床应用与安全性以及前景展望综述了DNA疫苗在动物医学中的研究进展。

关键词：DNA疫苗， 应用 研究进展

DNA疫苗也称核酸疫苗(Nucleic Acid Vaccine)，是利用基因重组技术直接将编码某种抗原蛋白的外源基因导入动物体细胞内，在宿主细胞中表达外源抗原基因，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。

DNA疫苗是继传统疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第三代新型疫苗。这种疫苗不但具有灭活疫苗的优点，而且尚未发现有逆转录的危险，因此在实践应用中越来越受到人们的重视，被誉为疫苗研究的第三次革命。就其研究进展而言，该疫苗具有很好的前景，如疟疾、乙型肝炎和人类免疫缺陷病毒HIV疫苗等已进入了临床试验。

一．DNA疫苗的发展过程

1.1DNA疫苗的面世 Wloff 等( 1990) 在研究体内基因转染，给小鼠的肌细胞注射未加任何化学试剂的裸露质粒DNA时，意外发现肌细胞吸收了质粒 DNA,

并高水平表达了外源基因( Wloff 等, 1992) 。Tang 等( 1992) 将表达人生长激素的基因质粒DNA 导入小鼠表皮细胞, 在小鼠血清中检测到了特异的抗生长激素抗体, 并且在给予加强剂量的质粒后可使免疫反应增强。1992 年, UImer 等将含流感病毒核心蛋 白( NP) 基因序列的重组质粒注射小鼠股四头肌, 发现的确刺激产生了特异性的CTL, 能保护小鼠抵抗不同流感病毒株感染。此后, 在其他许多动物中都陆续观察到了外源基因的表达并被机体的免疫系统 识别从而激发了免疫应答, 说明直接给动物接种编码抗原的基因可使动物获得对该抗原的免疫力。从此宣告了基因疫苗的诞生, 为疫苗的发展开辟了一条新的思路, 被誉为开创了疫苗学的新纪元.

1.2DNA疫苗的优点 A .DNA疫苗接种后，保护性抗原基因在宿主细胞内表达抗原蛋白后，其加工处理过程与病原的自然感染过程相似，两者的抗原递呈过程亦相同，因而诱导接种动物既产生细胞免疫又产生体液免疫。B免疫应答持久，由于外源基因可以在体内存在较长时

间，并不断表达外源蛋白，可以持续地刺激免疫系统，因而微量.C.DNA疫苗具有共同的理化特性，可以将含不同病原底质粒混合起来进行联合免疫，或是将不同病原的保护性Ag位点组装入一个质粒，构建成多价疫苗.D.质粒载体不存在免疫原性，可以反复使用，避免了重组活疫苗的弊病。E质粒DNA性质稳定，保存和运输方便，可避免因保存和运输不当而造成的免疫失败.F)直接接种 目的基因DNA，避免了疫苗制备所需要的繁琐过程，也有利于控制和保证质量。G作为一种重组质粒DNA疫苗，能在工程菌内快速增殖.

1.3DNA疫苗的不足 DNA 疫苗有可能与宿主细胞基因组发生整合, 从而引起宿主细胞的转化, 外源基因的表达水平低, 达不到所需要的免疫效果 。由于DNA

免疫接种的实质是将外源DNA 或RNA 引入宿主细胞内, 其安全性问题不容忽视。基因长期在机体内表达, 有可能产生免疫耐受、自身免疫疾病和过敏反应等一些不良后果。核酸疫苗潜在的危险性主要是在安全性方面尚有许多需要探讨的问题。

二.DNA疫苗的应用

1、猪 1.1、伪狂犬病病毒(PRV) 将编码PRVgC或gD基因的质粒DNA免疫猪，能诱导保护性抗体的生成和细胞免疫的产生；将编码gB、gC、gD的多种质粒DNA混合使用，对引导免疫反应更有效(Gerdts V等，1997；Rooij E M等，1998)。

1.2、猪流感病毒(HIV) Mackling等(1998)的试验结果表明，编码HIV1株的血凝素(HA)和核衣壳蛋白(NP)质粒DNA用金颗粒包裹，以基因枪轰击猪的表皮进行免疫后，HA质粒DNA能使猪产生粘膜免疫反应而对流感病毒的攻击具有抵抗力，DNA疫苗引起的免疫反应与灭活疫苗相当。

1.3、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRS) PRRS基因片段ORF5编码的主要囊膜糖蛋白GP5是该病毒的3个主要结构蛋白之一。含有ORF5基因质粒DNA能诱导猪抗GP5特异性中和抗体的产生；且免疫猪的外周血单核细胞在GP5重组蛋白存在时能够发生转化反应，显示了GP5特异性细胞免疫的产生(Pirzadeh B等，1998)。Meng(2000)将GP5基因克隆入巨细胞病毒(CMV)早期启动子的控制之下构建成真核表达质粒而制备出DNA疫苗，用其免疫仔猪后可诱导抗体的产生，实验室攻毒后显示出良好的保护效果。

1.4、口蹄疫病毒(FMDV) 将FMDV全长基因组的cDNA克隆到质粒，并去除其编码核衣壳蛋白VP1的细胞结合部位的DNA序列，构建成质粒DNA以肌肉或皮内注射，初次免疫后2～4周，可使所有的猪都产生特异的病毒中和抗体，攻毒试验中呈现部分保护作用(Ward G等，1997)。

1.5、猪瘟病毒(CSFV) 余兴龙等(2000)构建了CSFV主要保护性抗原E2基因4种不同的真核表达质粒。小鼠免疫试验结果表明，E2基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响，有信号肽序列的E2基因可诱导特异性的免疫反应，且无跨膜区序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强，而无信号肽序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强，而无信号肽序列的E2基因则不能诱导产生CFSV特异性的免疫反应。攻毒保护试验结果表明，免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量(MID)的猪瘟兔化弱毒苗(HCIV)的攻击；免疫猪可抵抗致死剂量的CFSV石门株强毒的攻击。

2、牛

2.1、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV) 用BRSV G基因构建的DNA疫苗，以无针方式免疫小牛时比皮内或肌肉注射引起的免疫反应强烈。

2.2牛疱疹病毒(BHV) 用表达BHV1 gD基因的质粒DNA疫苗免疫牛，能产生很高的中和抗体；攻毒试验后发现，免疫组比非免疫组的病毒排放量明显减少(schrijver R S等，1997)。此疫苗通过肌肉或皮内注射均可引导免疫反应的产生。但皮内注射引起的免疫反应更强(孟松树等，2000)。

2.3牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 以表达BVDV1型主要糖蛋白E2的质粒DNA肌肉注射小牛，可产生病毒中和抗体和抗原特异的细胞增殖反应；免疫后16周进行攻毒试验，发现免疫牛能产生针对BVDV1型和2型的血清中和抗体强烈的记忆抗体反应，对牛有部分免疫保护作用(Cox G J等，1993)。

3、鸡

3.1、新城疫病毒(DNV) Sakaguchi等(1996)将NDV F基因插入质粒载体，F基因的表达受巨细胞病毒早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子控制。1周龄试验鸡肌肉内注射重组质粒后，有2/5注射线性质粒的鸡和4/5注射线性质粒与脂质体转染剂混合物的鸡产生了高水平针对F蛋白的抗体，而注射闭环状质粒的鸡不能产生抗体。免疫9周后，体内有抗体的试验鸡都能抵抗致死剂量NDV强毒的攻击。

3.2、鸡传染性喉气管炎病毒(ILT) 将分别构建的含有鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gB、gC和gD基因的重组真核表达质粒及空载体质粒分组注射雏鸡，攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，重组质粒诱导了免疫应答，免疫保护率达到79%，该基因疫苗可以作为预防ILV的1个补充。

3.3、禽流感病毒 Robinson等(1993)最先将DNA疫苗用于鸡，以编码禽流感病毒H7N7株血凝素(HA)基因的质粒(DNA)由不同途径(静脉、腹腔、皮下注射)免疫3周龄鸡，可对致死剂量的H7N7株病毒鼻内攻击产生50%的保护。Fyna等(1993)为了研究DNA疫苗对鸡最有效的免疫途径，将100～200 μg编码H7HA的质粒DNA通过静脉、肌肉、皮下注射、点眼、囊内、滴鼻等方式免疫3周龄鸡。4周后进行第2次免疫。第6周，用致死剂量的H7N7攻击，免疫鸡的存活率达10%～63%，而对照组的存活率只有2%。其中，多种途径如静脉和肌肉注射共同免疫的效果，比单一途径如肌肉注射、点眼、法氏囊内、滴鼻免疫效果好。Kodihalli等(1997)将编码H5HA的质粒DNA以0.25、0.5、1.5或10 μg用基因枪免疫鸡，4周后以100LD50的Ty/lre/83株鼻内免疫进行攻击，低至0.25 μg剂量的DNA可使50%的免疫鸡存活。而1、5、10 μg的剂量可完全抵抗致死剂量病毒的攻击。DNA疫苗对致死剂量的抗原变异株也可提供95%的保护，证实DNA流感疫苗具有广阔的发展前景。

国内研制的H7亚型血凝素基因DNA疫苗，在极小的使用剂量下即可成功诱导免疫保护反应，并有效阻断同源低致病力禽流感病毒在机体内的感染和排毒；研制的H5亚型血凝素DNA疫苗，具有良好的免疫原性，肌肉注射途径即可获得对同源强毒攻击的免疫保护，并能有效阻断免疫保护存活鸡机体的排毒。

三．DNA疫苗的安全性

像其他疫苗一样，DNA疫苗的安全性问题也是必须考虑的重要问题。目前主要反映在两个方面：一是外源基因染色体整合问题。人们十分担心外源基因导入体内后，是否会与细胞染色体基因组发生整合，从而导致细胞转化、癌变等负面后果。对此安全问题，许多实验室采用现代分子生物学技术和手段，研究和分析了这种整合可能性。至少到目前为止都未有表明疫苗DNA能整合进染色体基因的现象或证据，且有一点得到共识，即作为病毒DNA疫苗方面的危险性不会高于各病毒的自然感染。二是可能引发的自身免疫反应问题。质粒DNA和其他疫苗一样也是一种外源性物质，对此问题，学术理论上已经探索了多年，不过到目前为止，无论是大量的实验研究或理论分析，都基本肯定了DNA疫苗使用的安全性。总的来说，DNA疫苗的安全性研究所积累的资料和大量的动物及人群临床试验，可以初步认为DNA疫苗是一种相对安全的疫苗形式。

四．DNA疫苗的前景展望

预计DNA疫苗将会给人类带来巨大的利益，但目前这一技术正处于发展的过程中。随着DNA疫苗基础研究的纵深发展，探索多种传染疾病防治的DNA疫苗将成为可能。我们相信DNA疫苗在病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫免疫、抗肿瘤免疫中研究和探索必将发挥了巨大的作用；DNA疫苗的多价、高效、廉价等优点使其潜在的应用价值不可估量。DNA疫苗的探索可能对人类疾病的防治以及畜牧业的发展带来划时代的影响。

参考文献

1.Wolff JA.Malone RW.Williams P Direct gene transfer into mouse muscle in vivo

1990

.2.Tang DC.DeVit M.Johnston SA Genetic immunization is a simple method for

eliciting an immuneresponse 1992

3.Ulmer JB.Donnelly JJ.Parker SE Heterologous protection against influenza by

injection of DNA encoding a viral protein 1993