流式细胞术样品制备技术(完整)

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1.标本制备：2.最小化非特异性结合：二、凋亡1.凋亡的检测方法：网站和其它2.PI染色法3.A nn ex in V 法4.TUNNEL 法三、细胞因子1.激活的细胞因子2.CBA四、血小板1.活化2.活化检测3.网织血小板五、红细胞1.网织红细胞2.PNH3•胎儿红细胞六、肿瘤学1.DNA细胞周期2.蛋白3.多药耐药4.微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备（一直接免疫荧光标记法取一定量细胞（约1X106细胞/ml,在每一管中分别加入50卩的HAB,并充分混匀, 于室温中静置1分钟以上（，再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入，。

孵育20-60分钟后，用PBS（pH7.2—7.4洗1-2次,加入缓冲液重悬上机检测。

本方法操作简便，结果准确, 易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

（二间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液（约1X106细胞/ml,先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原一抗体一抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

、最小化非特异性结合的方法1•荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2.在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白(BSA,脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的剖析检测一定鉴于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。

所以就一定把实体组织制备成单细胞悬液。

在应用FCM 技术中，制备出合格的单分别细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。

它要求这类分别细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特征。

流式细胞术样品制备大概可分为下边五个步骤：①取材：取手术或活检组织一定拥有代表性，如取手术肿瘤组织，一定取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本一定在取材后保持样本的新鲜；一般在室温 1 个小时以内办理好样本或实时用固定剂或低温对组织进行保留；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③依照厂家供给的软件程序对样本进行获取、检测和储存；④ 再依照软件供给的程序对检测结果进行定量剖析；⑤ 检测剖析结果在生物、医学上的意义进行剖析和评论。

第 1 节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM 对单细胞快速进行各样参数剖析一定鉴于单细胞基础上，依据各样组织成分的特点，可选择不一样的分别细胞方法，以期达到单细胞产额高、损害少的目的。

只管标本制备已形成了标准化的程序，但实质操作中总会出现这样或那样的问题。

在实体组织分别为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬时地或长久地影响细胞的性质、形态、构造、功能等。

所以，在对各样不一样组织进行分别选择方法时，应尽量减少对细胞的这类影响。

当前常用的分别组织细胞的方法有以下 3 种。

（一）酶消化法1作用原理：对实体组织分别的作用原理主要有3 方面：① 能够损坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；② 能够水解组织间的粘多糖等物质；③能够水解组织细胞间的密切联络装置的蛋白质物质。

酶消化法是实体瘤、培育细胞分别为单细胞的主要方法之一。

常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。

胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子种类的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连结组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。

样本制备实例:细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining原理:对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。

直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。

荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。

但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。

还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。

现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。

材料:∙被检测细胞∙FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步骤:1. 在 100 µL外周血加入抗体:a. 同型对照:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLb. 单阳管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLc. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+ Isotope APC 5 µLd. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+ Isotope PE 20 µL+CD3 APC 5 µLe. 样品管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+CD3 APC 5 µL2. 避光 15min3. 在每管中加入 2mL 裂解液,室温下避光孵育 10min4. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 2mL 鞘液,混匀6. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液7. 加入 500 µL鞘液,混匀8. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:a. 同型对照(和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记:Isotope*3b. 单阳 CD4 加 Isotope PE & APCc. 单阳 CD8加 Isotope FITC & APCd. 单阳 CD3 加 Isotope FITC & PE细胞周期 (Cell Cycle原理:细胞在有丝分裂的过程中,核内的 DNA 会进行复制,造成 DNA 含量的波动。

流式样本制备
流式样本制备是一种通过流式细胞仪或流式细胞分选仪对细胞或颗粒物进行快速精确的分离和分类的技术。

它可以对样本中的细胞进行筛选、鉴定和排序，并根据细胞的特定性质进行直接分离和收集。

流式样本制备的步骤通常包括样本准备、样本染色、细胞排序和收集等过程。

下面是一个基本的流程：
1. 样本准备：首先需要将待分析的样本制备成单细胞悬浮液。

对于组织样本，可以通过机械或酶解法将组织细胞分离并制备成单细胞悬浮液。

对于细胞悬浮液，需要将其进行稀释，使得细胞以单个细胞的形式存在于悬浮液中。

2. 样本染色：将样本中的细胞或颗粒物经过染色，以便于流式细胞仪对其进行鉴定和分类。

常用的染色方法包括标记细胞表面标志物的流式抗体染色和使用细胞荧光探针的染色等。

3. 细胞排序：将染色后的样本通过流式细胞仪进行分析和鉴定。

流式细胞仪通过检测细胞的大小、形状、荧光染色强度等特性对细胞进行分类和区分。

4. 细胞收集：根据需要，流式细胞分选仪可根据细胞的特定性质（如荧光染色强度）对细胞进行分离和收集。

分选后的细胞可以进一步用于后续实验，如基因分析、细胞培养等。

注意事项：
- 在进行流式样本制备时，需要注意使用无菌的操作条件以避免细胞的污染。

- 样本准备和染色的步骤需要根据具体实验目的和方法进行优化和调整。

- 对于染色步骤，需要选择适当的流式抗体或荧光探针，并根据实验要求对样本进行处理和处理时间的控制。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞操作步骤：
1.制备脾细胞悬液1 107/ml
2.每个流式管（即样品）放入100ul 细胞悬液
3.每个样品中加入2ul CD4及5ul CD5 ，避光孵育30分钟
4.洗涤：每个样品中加入2ml的流式缓冲液，1200rpm下离心7分
钟，弃上清后漩涡混匀，再重复洗涤一次，共两次
5.每个样品中加入1ml Foxp3 固定/渗透液，混匀后4℃过夜
6.每个样品中加入2ml流式缓冲液
7.室温下1200rpm离心（400g×5min），弃上清
8.重复步骤（6），（7）
9.每个样品中加入小鼠血清2ul，室温下孵育15分钟
10.每个样品中加入2.5ul的Foxp3抗体，室温下孵育30分钟，并用
PE Rat IgG2a在平行管中空白对照
11.每个样品中加入2ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心（400g×
5min），弃上清
12.重复步骤（11）
13.每个样品中加400ul流式缓冲液，上机。