流式细胞术样品制备技术(完整)

流式细胞仪的样本制备与数据分析指南
引言：
流式细胞仪（flow cytometer）是一种广泛应用于生物学、医学研究领域的仪器，能够对单个细胞进行快速、准确的分析和排序。为了获得可靠的实验结果，正确的样本制备和数据分析至关重要。本文将为您介绍流式细胞仪的样本制备和数据分析的基本指南。
一、样本制备
1.细胞准备
3.细胞染色
细胞染色是为了标记细胞内特定的分子或结构，以便在流式细胞仪中进行检测和分析。常见的细胞染色方法包括荧光染色、酶标记等。在选择染色方法时，需要考虑染色效果、染色稳定性以及对细胞活力的影响。
4.样本预处理
在进行流式细胞仪分析之前，有时需要对样本进行预处理，以消除背景噪音、增强信号等。常见的样本预处理方法包括细胞排序、细胞分选、细胞富集等。
结语：
流式细胞仪的样本制备和数据分析是流式细胞仪实验中至关重要的环节。正确的样本制备和数据分析方法能够提高实验结果的可靠性和准确性，为后续的研究工作提供有力支持。希望本文所提供的指南能够对您的流式细胞仪实验有所帮助。
二、数据分析
ห้องสมุดไป่ตู้1.数据获取
在流式细胞仪实验完成后，需要将得到的原始数据导出到计算机进行后续的数据分析。通常，流式细胞仪会输出FCS（Flow Cytometry Standard）格式的数据文件，其中包含了细胞的荧光强度、散射信号等信息。
2.数据清洗
在进行数据分析之前，需要对原始数据进行清洗，去除噪音、异常数据等。常见的数据清洗方法包括设置门控条件、排除双重tsne等。
3.数据解读
数据解读是流式细胞仪数据分析的核心环节。通过对数据的统计学分析、聚类分析、细胞子群分析等，可以获得关于细胞表型、细胞数量、细胞状态等信息。在数据解读过程中，需要结合实验设计和研究目的，从中提取有意义的结果。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1.标本制备：2.最小化非特异性结合：二、凋亡1.凋亡的检测方法：网站和其它2.PI染色法3.A nn ex in V 法4.TUNNEL 法三、细胞因子1.激活的细胞因子2.CBA四、血小板1.活化2.活化检测3.网织血小板五、红细胞1.网织红细胞2.PNH3•胎儿红细胞六、肿瘤学1.DNA细胞周期2.蛋白3.多药耐药4.微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备（一直接免疫荧光标记法取一定量细胞（约1X106细胞/ml,在每一管中分别加入50卩的HAB,并充分混匀, 于室温中静置1分钟以上（，再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入，。

孵育20-60分钟后，用PBS（pH7.2—7.4洗1-2次,加入缓冲液重悬上机检测。

本方法操作简便，结果准确, 易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

（二间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液（约1X106细胞/ml,先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原一抗体一抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

、最小化非特异性结合的方法1•荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2.在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白(BSA,脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的剖析检测一定鉴于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。

所以就一定把实体组织制备成单细胞悬液。

在应用FCM 技术中，制备出合格的单分别细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。

它要求这类分别细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特征。

流式细胞术样品制备大概可分为下边五个步骤：①取材：取手术或活检组织一定拥有代表性，如取手术肿瘤组织，一定取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本一定在取材后保持样本的新鲜；一般在室温 1 个小时以内办理好样本或实时用固定剂或低温对组织进行保留；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③依照厂家供给的软件程序对样本进行获取、检测和储存；④ 再依照软件供给的程序对检测结果进行定量剖析；⑤ 检测剖析结果在生物、医学上的意义进行剖析和评论。

第 1 节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM 对单细胞快速进行各样参数剖析一定鉴于单细胞基础上，依据各样组织成分的特点，可选择不一样的分别细胞方法，以期达到单细胞产额高、损害少的目的。

只管标本制备已形成了标准化的程序，但实质操作中总会出现这样或那样的问题。

在实体组织分别为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬时地或长久地影响细胞的性质、形态、构造、功能等。

所以，在对各样不一样组织进行分别选择方法时，应尽量减少对细胞的这类影响。

当前常用的分别组织细胞的方法有以下 3 种。

（一）酶消化法1作用原理：对实体组织分别的作用原理主要有3 方面：① 能够损坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；② 能够水解组织间的粘多糖等物质；③能够水解组织细胞间的密切联络装置的蛋白质物质。

酶消化法是实体瘤、培育细胞分别为单细胞的主要方法之一。

常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。

胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子种类的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连结组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。

样本制备实例:细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining原理:对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。

直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。

荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。

但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。

还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。

现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。

材料:∙被检测细胞∙FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步骤:1. 在 100 µL外周血加入抗体:a. 同型对照:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLb. 单阳管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLc. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+ Isotope APC 5 µLd. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+ Isotope PE 20 µL+CD3 APC 5 µLe. 样品管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+CD3 APC 5 µL2. 避光 15min3. 在每管中加入 2mL 裂解液,室温下避光孵育 10min4. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 2mL 鞘液,混匀6. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液7. 加入 500 µL鞘液,混匀8. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:a. 同型对照(和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记:Isotope*3b. 单阳 CD4 加 Isotope PE & APCc. 单阳 CD8加 Isotope FITC & APCd. 单阳 CD3 加 Isotope FITC & PE细胞周期 (Cell Cycle原理:细胞在有丝分裂的过程中,核内的 DNA 会进行复制,造成 DNA 含量的波动。

一、单层培养细胞分散为单个细胞
㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤： 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。
2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观
察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎 牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液
洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液， 用振荡器使细胞分散。
实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞 成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞 丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不 单独使用，可与其他方法联合使用。 机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的 细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果， 需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。 酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的， 但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根 据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法， 才能获得理想的样品和更好的FCM结果。
3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤：
1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉 上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
注意事项： 一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡 脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇， 如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则 没有脱净。 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。 切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。

流式样本制备
流式样本制备是一种通过流式细胞仪或流式细胞分选仪对细胞或颗粒物进行快速精确的分离和分类的技术。

它可以对样本中的细胞进行筛选、鉴定和排序，并根据细胞的特定性质进行直接分离和收集。

流式样本制备的步骤通常包括样本准备、样本染色、细胞排序和收集等过程。

下面是一个基本的流程：
1. 样本准备：首先需要将待分析的样本制备成单细胞悬浮液。

对于组织样本，可以通过机械或酶解法将组织细胞分离并制备成单细胞悬浮液。

对于细胞悬浮液，需要将其进行稀释，使得细胞以单个细胞的形式存在于悬浮液中。

2. 样本染色：将样本中的细胞或颗粒物经过染色，以便于流式细胞仪对其进行鉴定和分类。

常用的染色方法包括标记细胞表面标志物的流式抗体染色和使用细胞荧光探针的染色等。

3. 细胞排序：将染色后的样本通过流式细胞仪进行分析和鉴定。

流式细胞仪通过检测细胞的大小、形状、荧光染色强度等特性对细胞进行分类和区分。

4. 细胞收集：根据需要，流式细胞分选仪可根据细胞的特定性质（如荧光染色强度）对细胞进行分离和收集。

分选后的细胞可以进一步用于后续实验，如基因分析、细胞培养等。

注意事项：
- 在进行流式样本制备时，需要注意使用无菌的操作条件以避免细胞的污染。

- 样本准备和染色的步骤需要根据具体实验目的和方法进行优化和调整。

- 对于染色步骤，需要选择适当的流式抗体或荧光探针，并根据实验要求对样本进行处理和处理时间的控制。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞操作步骤：
1.制备脾细胞悬液1 107/ml
2.每个流式管（即样品）放入100ul 细胞悬液
3.每个样品中加入2ul CD4及5ul CD5 ，避光孵育30分钟
4.洗涤：每个样品中加入2ml的流式缓冲液，1200rpm下离心7分
钟，弃上清后漩涡混匀，再重复洗涤一次，共两次
5.每个样品中加入1ml Foxp3 固定/渗透液，混匀后4℃过夜
6.每个样品中加入2ml流式缓冲液
7.室温下1200rpm离心（400g×5min），弃上清
8.重复步骤（6），（7）
9.每个样品中加入小鼠血清2ul，室温下孵育15分钟
10.每个样品中加入2.5ul的Foxp3抗体，室温下孵育30分钟，并用
PE Rat IgG2a在平行管中空白对照
11.每个样品中加入2ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心（400g×
5min），弃上清
12.重复步骤（11）
13.每个样品中加400ul流式缓冲液，上机。

氯化铵溶血剂(Ammonium chloride 氯化铵溶血剂 lysing solution,)
贮存液(10′)： 80.2g NH4Cl (1.5M) 8.4g NaHCO3(100mM) 3.7g EDTA Na2(10mM) 蒸馏水900 ml 调节pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH) 加蒸馏水至1升 4oC保存6个月以内 工作液(1′)：蒸馏水1:9稀释, 新鲜配制, 冷藏保存 注: 1) 贮存液不可小于10′, 否则会形成碳酸铵而失效 2) NaHCO3可由10g KHCO3替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代
用氯化铵溶血剂的溶血方法
100ml 全血加2mL氯化铵溶血剂, 混匀 2) 避光孵育10~15分钟 3) 离心, 去上清, PBS洗2次 4) 抗体染色后, PBS洗 5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2oC-直至上机检 测
细胞凋亡 流式检测
固定细胞的染色方法 非固定细胞的染色方法
固定细胞的染色方法
培养细胞
制作细胞悬液 300-400目滤网过滤 免疫荧光标记 上机
流式细胞术检测Hale Waihona Puke 养细胞表面抗原的 样品制备方法探讨
应用EDTA、胰酶、细胞刮、联用EDTA及细胞刮制备 单用EDTA或细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量低,胰酶或联 用EDTA及细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量高(F=263.63,P ＜0.001).胰酶组细胞表面HLA-DR和ICAM-1的荧光强度明显 降低,且以HLA-DR抗原下降比例较多(HLADR:F=3.77,P=0.022;CD54:F=10.33,P＜0.001).EDTA组、 细胞刮组、EDTA联合细胞刮组间HLA-DR和ICAM-1的荧光 强度表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论:EDTA联合细胞 刮法是贴壁培养细胞制备单细胞悬液的一种好方法

流式细胞术的样品制备节概述待测标本的制备是流式细胞术分析的关键，本节分别直接免疫荧光标记、间接免疫荧光标记、微量全血法免疫荧光标记、双标记、培养细胞DNA荧光标记与细胞凋亡检测样品的制备。

知识点导航1.直接免疫荧光标记的样品制备用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。

实验步骤如下：(1)每份取100 μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。

(2)一份加入相应量的异硫氰酸荧光素或者藻红蛋白标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为阴性参照样品。

(3)室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行)，通常在室温下反应15～30min 即可。

(4)加入500 μl磷酸缓冲液重悬成单细胞悬液即可上机检测。

2.间接免疫荧光标记的样品制备(1)取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30 min。

(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数通常为800～1000 r/min，5 min)。

(3)用100 μl PBS重悬细胞，再加入FITC或者PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下反应30 min。

(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500 μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。

注意：以上两种染色方法的抗体加入量与反应时间，没有非常具体的规定，通常应根据试剂使用说明书的要求进行。

若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。

制备好的样品，若不能及时上机检测，用1％～4％的多聚甲醛固定，4℃下可储存5d。

3.微量全血法免疫荧光标记的样品制备目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。

下面要紧介绍与流式细胞仪配套的Q PREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法：(1)微量全血直接荧光染色法：具体方法为①取肝素或者EDTA抗凝全血100 μl置12 mm×75 mm 专用塑料试管中；②每份加入20 μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作阴性参照，室温下避光染色15 min；③置 Q PREP 仪上溶解红细胞、稳固与固定白细胞，静置5 min；④上流式细胞仪检测。

注意事项：
Ⅰ新鲜组织标本应及时进行保存，以免组织在室温下放 置时间过长，造成细胞自溶导致DNA降解，影响FCM 测定结果。
Ⅱ根据实验目的选用最佳的细胞固定方法，以免由于固 定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定。
Ⅲ酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶 剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。
消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。
切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。
二、血液单细胞样品的制备
血液是天然的单细胞分散细胞悬液，血中 的细胞成分在生理状态下呈分散的游离状态， 它是流式细胞分析的最合适的样品，全血中含 有红细胞，白细胞和血小板三种有形成分，但 流式细胞的检测是以某一群细胞为测定对象， 因此在检测前须将所测的某群细胞分离出来， 下面分别介绍几种血细胞的分离制备方法。
新鲜实体组织单细胞悬液制备方法如下：
⒈酶消化法 ⒉机械法
剪碎法 网搓法 研磨法
⒊化学试剂处理法
⒈酶消化法
酶对实体组织分散作用原理主要有三方面：
﹡一是可以破坏组织间的胶原。
﹡二是可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质。
﹡三是可以水解组织间的粘多糖物质。
酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法，常用 的酶类试剂有：
1. 取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1,加入3.0ml生理
盐水将血稀释,均在无菌条件下操作。
2.1640培养液10.0ml,放入培养瓶内,将稀释血加入
培养液中,混匀,与培养瓶接触面要大。
3.放入37℃恒温箱内孵育30-40分钟,取出培养瓶 , 将血倾倒掉,用生理盐水将培养瓶轻轻冲洗一次, 以去掉残留的血液,这时培养瓶壁上贴附了大量 的单核细胞,因为单核细胞具有短时培养期内贴 附快的特点 ,而其他细胞没有这个特性,所以利 用这一特性进行短时培养可获得较纯的单核细 胞。

流式细胞术实验步骤流式细胞术（flow cytometry）是一项非常常用的细胞生物学研究技术，在许多领域都有着广泛的应用。

本文将为您介绍流式细胞术实验步骤，帮助您更好地掌握这一技术。

1. 细胞样品制备首先需要一个合适的细胞样品进行实验。

样品的选取要考虑细胞类型、细胞密度、细胞状态等因素，以保证实验结果的准确性和可靠性。

对于非粘附生长的细胞，先用PBS洗涤一次，离心沉淀，将上清液倒掉，然后用PBS冲洗沉淀细胞一次，离心沉淀，去掉上清液，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的PBS中消化脱落细胞。

之后用PBS洗涤脱落细胞，离心沉淀，去掉上清液，最后加入凝胶化培养基冻存备用。

2. 细胞计数在流式细胞术中，细胞计数非常重要。

可以使用hemocytometer或自动计数器进行计数。

计数完毕后，将细胞密度调整到准确的浓度，以免在后续实验中出现杂质和误差。

3. 细胞标记细胞标记可使用fluorescently-labeled antibodies或其他的探针，标记细胞表面分子或胞内分子。

标记的目的是识别和区分样品中的不同细胞类别。

处理方法：向细胞样品中加入适量标记抗体或荧光素等探针，使其与样品中的目标分子发生特异性结合。

4. 细胞过筛将经过标记的样品通过过滤网口，筛去大于0.22um的细胞碎片等杂质，以获得单个细胞进行后续实验。

5. 流式细胞术分析使用流式细胞仪进行分析，将样品喷入细胞术的流管中，在激光束之下，测量样品中标记细胞的荧光强度、散射度等参数。

通过比较样品与对照组，分析细胞类型、浓度和状态，建立起荧光相关表达式，以判定目标细胞类别。

6. 数据解析在流式细胞术分析的过程中采集了大量的数据，需要使用专业的软件进行数据解析、图形和表格生成。

数据解析的准确性和可靠性，对于实验结果和结论的推导有着至关重要的作用。

流式细胞术是一项详细的实验过程，需要严格遵守操作规范，才能获取可重复的实验结果。

本文简单介绍了流式细胞术实验步骤，希望能够提供实验操作指导，为广大科研工作者开展实验研究提供一定的帮助。

流式细胞术的样本制备方法流式细胞术的样本制备和染色方法是进行流式分析的基础，虽然是基础，但是样本制备可并没有那么容易，比如细胞数目的掌握很难，过于稀释浓度不够，过于稠又会在通过细胞仪时影响分析，做不出结果，这是我们做流式的一大通病，特别是从组织中分离样本时，这样的问题常常遇到。

今天，我们就看看如何从不同组织中分离出优质样本。

与贴壁或者悬浮细胞相比，组织样本的单细胞制备相对有一定的难度和复杂性，也是同学们最容易出现问题的地方，如细胞数量太少，细胞活性不好，细胞碎片太多等。

下面就具体看看组织中的细胞如何制备。

目前，最常用两种方法是物理法和酶解消化法。

一、物理方法：原理：是指利用物理方法(机械法)分散组织，经过滤网过滤获得单细胞悬液。

应用：常用于处理部分软组织例如骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结等，或富含细胞的肿瘤组织----淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及一些软组织肉瘤等，用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞。

优势：操作方便，耗时短，且能获得大量的细胞。

缺点：易造成组织细胞机械损伤，如细胞碎片和细胞团块，所以常与其他方法配合使用;对硬组织或纤维组织效果不好。

操作步骤：1. 吹打：用移液枪或注射器反复吹打组织以获得单个细胞的方法。

应用于：骨髓、腹腔、肺等组织中相对比较游离的细胞(骨髓、巨噬细胞等)。

2. 剪碎研磨法：用锋利的剪刀将组织剪碎后，并研磨以获得单个细胞的方法。

应用于：脾脏、淋巴结、胰腺等新鲜组织。

3. 网搓法：用100-300目的尼龙滤网固定于烧杯口，组织在网上轻搓，可用此法获得单个细胞的方法。

常应用于：正常的组织、瘤组织、淋巴结等标本。

二、酶解消化法：原理：利用酶(主要是胶原酶和蛋白酶)破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等、水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞的方法。

应用：既可用于普通单层的传代细胞也适合致密的组织样本，如上皮、肝、肾等或含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等。

流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。

2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。

4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

(四)注意事项1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

附:1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaNO３终浓度0.2％)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaNO３0.2g (终浓度0.02％)流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合二、凋亡1．凋亡的检测方法：2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞术检测细胞样品
一、培养细胞
二、经0.25%胰酶消化后，PBS缓冲液洗涤，制成细胞悬液，70%乙醇固定。

（1.自己做的时候，细胞多也可以先离心，去掉乙醇。

2.收获细胞时，自己先用计数板数一下细胞，以上样的时候可以根据细胞多少增加或减少上样量）
三、室温下，经PBS（1~2ml）缓冲液洗涤1~2次（加入PBS后注意混匀），用PBS配平（天平）1500r/min，离心5min，去上清夜，留100μl沉淀。

0.2% Triton X-100 100μl处理细胞10min，PBS缓冲液洗涤及离心同上，去上清液，留100μl沉淀。

RNA酶水解5~10min，加5mg/L PI染色剂100μl染色标记细胞内的DNA，20min后，PBS洗涤离心去上清夜同上，留100μl沉淀。

用PBS缓冲液制成1*106的细胞悬液（用100μl沉淀+400μl PBS），待用。