时间：二O二一年七月二十九日
时间：二O二一年七月二十九日 之巴公井开创作
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Western实验步伐 Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测卵白的重要方法之一.Western可以参考如下步伐进行把持. 1. 收集卵白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液,例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品.对某些特定的亚细胞组份卵白,例如细胞核卵白、细胞浆卵白、线粒体卵白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份卵白,也可以使用试剂盒进行抽提,例如碧云天生产的细胞核卵白与细胞浆卵白抽提试剂盒(P0028). 收集完卵白样品后,为确保每个卵白样品的上样量一致,需要测定每个卵白样品的卵白浓度.根据所使用的裂解液的分歧,需要采纳适当的卵白浓度测定方法.因为分歧的卵白浓度测定方法对一些去垢剂和还原剂等的兼容性分歧很年夜.如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液,可以使用BCA卵白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012). 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A).该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方. (2)
样品处置 在收集的卵白样品中加入适量浓缩的SDS-时间：二O二一年七月二十九日
时间：二O二一年七月二十九日 PAGE卵白上样缓冲液.例如2X或5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液.使用5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的卵白样品.5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE卵白上样缓冲液(5X)(P0015). 100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充沛变性卵白. (3) 上样与电泳 冷却到室温后,把卵白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可. 为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断卵白分子量年夜小,最好使用预染卵白质分子量标准(P0066). 电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B). 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳.对Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右.SDS-PAGE可以采纳普通的电泳仪就可以满足要求,也可以采纳碧云天的多功能电泳仪(带按时)(EEP102).为了电泳方便起见,也可以采纳整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定按时时间为90－120分钟.设置按时可以防止经常发生的电泳过头. 通常电泳时溴酚蓝达到胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染卵白质分子量标准的电泳情况,预计目的卵白已经被适当分离后即可停止电泳.3. 转膜(Transfer) 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33).硝酸纤维素膜(NC时间：二O二一年七月二十九日
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。
一、基本原理
WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。具体步骤如下：
1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。
2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。
3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。
4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。
5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。
6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。
7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。 8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。
9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。
二、操作流程
下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。
1.样品制备：
a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。
b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。
c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。
2.SDS-电泳：
a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。
b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。
c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。
Western Blotting操作步骤
一、蛋白样品制备
（1）细胞总蛋白的提取：
1、倒掉培养液， PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。
2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。（整个操作尽量在冰上进行，保持低温。）
3、4℃下12000rpm离心15min。（提前开离心机预冷）
4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。
（2）组织总蛋白的提取：
1、 称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、 200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织尽量碾碎至无明显组织碎块。
3、 将混合液移至1.5ml离心管中， 4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保
存。
二、蛋白含量的测定
1、 取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。
2、 取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。
3、 按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。
4、 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。
5、 加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。
6、 各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。
7、 酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
三、SDS－PAGE电泳
wb蛋白提取步骤
WB蛋白提取步骤
引言：
WB蛋白提取是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。本文将详细介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质提取、浓缩和检测等关键步骤。
一、细胞裂解
细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，旨在破坏细胞膜、细胞核膜以及其他细胞组分，释放出目标蛋白质。常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和生物学方法等。其中，最常用的方法是使用细胞裂解缓冲液，通过冷冻-解冻或超声波等方式破坏细胞结构。
二、蛋白质提取
蛋白质提取是WB蛋白提取的关键步骤之一。在细胞裂解后，目标蛋白质以及其他细胞组分被释放到裂解液中。为了提取目标蛋白质，需要将裂解液进行离心，分离出上清液。上清液中含有目标蛋白质，可以用于后续的蛋白质浓缩和检测。
三、蛋白质浓缩
蛋白质浓缩是WB蛋白提取的重要步骤之一，旨在提高目标蛋白质的浓度，便于后续的蛋白质检测。常用的蛋白质浓缩方法有醋酸沉淀法、酒精沉淀法和尿素沉淀法等。在浓缩过程中需要注意控制温度和pH值，以避免蛋白质的降解和聚集。
四、蛋白质检测
蛋白质检测是WB蛋白提取的最后一步，用于确定提取的蛋白质是否含有目标蛋白以及其相对丰度。常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE和免疫印迹等。其中，SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法，可以根据蛋白质的分子量将其分离成不同的条带；免疫印迹则是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后使用酶标记的二抗进行检测。
总结：
WB蛋白提取是一种重要的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。其步骤包括细胞裂解、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质检测等。通过合理选择和操作这些步骤，可以获得高质量的蛋白提取物，为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。
参考文献：
[1] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines:
minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622.
