%9a%84人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

细胞自噬在器官纤维化病变中的作用毛　骏１，３　李仁礼１，３　李?华２，３　张　青２，３　李　海２，３　向晓辉２，３，△（１武警后勤学院，天津３００３０９；２天津市西青医院消化内科，天津３００３８０；３天津市肝脏胰腺纤维化与分子诊疗重点实验室，天津３００１６２）摘要　自噬是细胞中一种进化上保守的生物学过程，通过降解受损的细胞器和多余的蛋白质使细胞在应激损伤时能够维持正常的平衡。

它包括一系列连续的过程，如吞噬泡的形成与延伸、自噬体的成熟、自噬体与溶酶体的融合等。

目前，对于调节自噬过程不同阶段的分子机制以及在疾病发展中作用的认识正逐渐加强。

本文综述了近几年来细胞自噬在多种器官纤维化病变中的研究进展，着重整理归纳与疾病相关的发生机制，以期为纤维化疾病的治疗提供新的理论指导和临床思路。

关键词　自噬；器官纤维化；分子机制中图分类号　Ｒ５９３ＣｅｌｌｕｌａｒＡｕｔｏｐｈａｇｙｉｎＯｒｇａｎＦｉｂｒｏｓｉｓ ＭＡＯＪｕｎ１，３，ＬＩＲｅｎ Ｌｉ１，３，ＬＩＭａｎ Ｈｕａ２，３，ＺＨＡＮＧＱｉｎｇ２，３，ＬＩＨａｉ２，３，ＸＩＡＮＧＸｉａｏ Ｈｕｉ２，３，△（１ＬｏｇｉｓｔｉｃｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｏｐｌｅ＇ｓＡｒｍｅｄＰｏｌｉｃｅＦｏｒｃｅｓ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００３０９，Ｃｈｉ ｎａ；２ＤｉｇｅｓｔｉｖｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＴｉａｎｊｉｎＸｉｑｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００３８０，Ｃｈｉｎａ；３ＴｉａｎｊｉｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｅｐａｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃＦｉｂｒｏｓｉｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｉｓ＆Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｔｉａｎｊｉｎ，３００１６２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ａｕｔｏｐｈａｇｙｉｓａｎｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｉｎｃｅｌｌｓ．Ｉｔｃａｎｍａｉｎｔａｉｎａｎｏｒ ｍａｌｂａｌａｎｃｅｂｙｄｅｇｒａｄｉｎｇｄａｍａｇｅｄｏｒｇａｎｅｌｌｅｓａｎｄｒｅｄｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｓｔｒｅｓｓｉｎｊｕｒｙ．Ｉｔｉｎｃｌｕｄｅｓａｓｅ ｒｉｅｓｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｏｆｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ，ｔｈｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏ ｐｈａｇｏｓｏｍｅ，ｔｈｅｆｕｓｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅａｎｄｌｙｓｏｓｏｍｅ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｄｉｓｅａｓｅｓｉｓｇｒａｄｕａｌｌｙｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄ．Ｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ，ｔｈｅｒｅｃｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｏｒｇａｎｆｉｂｒｏｓｉｓａｎｄｔｈｅｐａｔｈｏ ｇｅｎｅｓｉｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｓｉｓｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅｎｅｗｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｇｕｉｄａｎｃｅａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｉｄｅ ａｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｏｒｇａｎｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ；ｏｒｇａｎｆｉｂｒｏｓｉｓ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍ 纤维化是指组织中细胞外基质（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）发生过度沉积，细胞再生能力不能满足损伤修复的动态病理过程，几乎可以发生在任何实体器官或组织中，终末期可导致肝、肺、肾等重要器官的衰竭［１］。

止消通脉宁干预转化生长因子—β1诱导人肾小管上皮细胞表型转化的研究作者：杨丽霞李晓东程涛刘铜华吴丽丽Margetts Peter Joseph来源：《中国中医药信息》2013年第01期摘要：目的观察止消通脉宁药物血清对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）表型转化的影响，并探讨其机制。

方法将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养基培养并分为空白对照组、TGF-β1诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）、空白血清对照组（TGF-β1 10 ng/mL+10%空白血清）、干预1组（TGF-β1 10 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁药物血清）、干预2组（TGF-β1 10 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁药物血清）、干预3组（TGF-β1 10 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁药物血清）。

药物干预24 h后，免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达。

在24、48、72 h应用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和纤连蛋白（FN）的含量。

结果正常HK-2细胞表达E-cadherin，不表达α-SMA，经TGF-β1刺激后细胞表型发生转变，E-cadherin的表达明显减弱，α-SMA表达明显增强，且ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌明显增加，与空白对照组比较差异有统计学意义（P关键词：止消通脉宁；转化生长因子-β1；人肾小管上皮细胞；表型转化；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原；纤连蛋白中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）01-0037-03糖尿病肾病（DN）是糖尿病最为常见的慢性微血管并发症之一，严重影响糖尿病患者的生活质量和生命健康。

DN的发病机制尚未明确。

既往认为DN的早期病变部位在肾小球，近年来研究发现肾小管病变及肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性更为密切，故肾间质纤维化的机制在DN的发展中越来越受到人们的重视[1]。

内皮-间质转化参与组织纤维化的研究进展王倩倩;杨宝军【摘要】组织纤维化的典型特征是成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度蓄积.近年来研究表明,成纤维细胞是一组高度异源的细胞群体,除了由局部静止的成纤维细胞活化而来外,还可由上皮细胞、内皮细胞、血管周细胞和骨髓起源的循环祖细胞、单核细胞等转化而来,其中源自内皮细胞的内皮-间质转化是成纤维细胞的重要来源之一,亦是纤维化发生、发展的重要机制之一.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2013(019)021【总页数】4页(P3856-3859)【关键词】内皮-间质转化;内皮细胞;成纤维细胞;纤维化【作者】王倩倩;杨宝军【作者单位】汕头大学医学院第二附属医院心内科,广东,汕头,515041;汕头大学医学院第一附属医院心内科,广东,汕头,515041【正文语种】中文【中图分类】R364.3组织纤维化是指组织在缺血、化学药物、毒素、感染、物理损伤和免疫反应等慢性损伤因素作用下，导致成纤维细胞激活、大量增殖，细胞外基质合成增多、降解减少、基质过度沉积的病理过程。

以往研究认为，成纤维细胞的激活仅仅是局部处于静态的成纤维细胞的活化而来［1］，但近年来研究认为，成纤维细胞并非一群同质性细胞，而是由不同来源的细胞群体组成［2-4］。

值得注意的是，内皮细胞受到刺激后向间质成纤维细胞的转化，即内皮-间质转化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)是成纤维细胞的重要来源之一，在心肌纤维化、肾脏纤维化、肺纤维化等组织纤维化过程中发挥重要作用。

1 EndMT的类别EndMT过程中，一方面细胞逐渐丧失原有的内皮细胞特异性标志物，如VE-cadherin等表达逐渐减少，内皮细胞间紧密连接和细胞极性减弱;另一方面开始表达间质成纤维细胞标志物(如成纤维细胞特异蛋白1等)并获得合成胶原和迁移的能力，待迁移至间质后转化为成纤维细胞，进一步激活为肌成纤维细胞，大量表达α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，分泌大量细胞外基质，导致组织纤维化的发生［2，5］。

(organ
Байду номын сангаас
fibrosis)一直是世界医学的研究热点之一。
4.1慢性肾脏病
慢性肾脏病的主要病理特征为细胞外基质过度沉积，广泛的纤维化。 最终导致终末肾功能衰竭的共同通路。肾纤维化的范围和程度与肾 功能缺陷具有高度的相关性。
4.2肺纤维化
肺纤维化是各种内外致病原引起慢性肺疾病的共同结局病理过程。 是肺组织损伤修复失调导致大量细胞外基质重构、过度沉积，最终 导致肺组织结构改变和功能丧失 。
C、纠正ECM合成及降解失平衡 脯氨酸4－羟化酶和赖氨酰氧化酶等抑制胶原合成过程所需要的
酶，可能直接减少纤维性胶原沉积在ECM。发现己酮可可碱能明显
降低人HSC中TIMP-1mRNA的表达，发挥抗肝纤维化作用。
5.1逆转的研究
近年来，对ECM转换在纤维化逆转方面进行了一些研究，主要涉及： 提高胶原降解酶的活性； 抑制胶原降解酶抑制物PAI-1和TIMPs 的活性等，以促进胶原的 降解，恢复胶原的合成与降解的平衡；
3.1转化生长因子-β （TGF-β)
属于一组调节细胞生长和分化的TGF-β 超家族。有广泛的生物学作用:调节 细胞生长、分化、凋亡、迁移、黏附、基质形成，以及损伤修复等。在促纤维 化作用是细胞因子中最强的。 TGF-β 是由两个分子量为12.5 kD的亚基通过二硫键连接而成的同源二聚 体，二聚体形式的TGF-β 才具有生物活性。 哺乳动物主要有TGF-β 1、TGF-β 2和TGF-β 3的3种形式，三者的生物学 作用基本相似，其中以TGF-β 1最重要。
3.3 结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor，CTGF
CTGF蛋白是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽。 在创伤愈合、器官 纤维化发生中已观察到结缔组织生长因子的过度表达， CTGF在纤 维化形成中的作用： 促进细胞增殖、粘附、迁移、整合素表达； 促使Ⅰ、Ⅲ型胶原和 FN 等ECM的合成。在创伤愈合、皮肤、肾 脏、肝脏、心脏、肺脏和胰腺纤维化以及粥样硬化的动脉，均观察 到呈高表达的CTGF。

（4）两药袋表面，要用手压平，然后在塑料布 上沿，铺上一条毛巾，以防药液沾污衣物 （5）患者在平躺之前，一定要先用手背测试药 袋的温度，感觉温度适宜时方可躺下。 （6）药袋一定要调整到两肾区位置（约后背腰 部），双肾下缘大约在两髂脊向上2公分左 右，平躺后，肘尖应处于药袋中间的位置。
（7）设定理疗时间，一般以45分钟左右 为宜，选择模式，调好电流强度和加热等级， 以感到舒服为止。电流强度的设置，可按自 己的承受力逐渐上调。但不能太强，要适当 掌握。在调试过程中，可以适当调整药袋所 敷的位置。 （8）渗透治疗结束时，应先切断电源， 才可起床。起床后，用温湿毛巾轻轻擦除腰 背部残留药液，穿好衣服以防感冒。 以上为一次完整的微化中药渗透理疗的 程，渗透治疗以每日两次为宜。
第二期、炎症基质合成期（纤维化形成期） 该期特点：继续依赖炎症性刺激，浸润的单核细胞持 续释放促炎症因子与促纤维化生长因子，成纤维细胞 呈持续性活化增殖状态；并出现小管上皮细胞转分化 （EMT）此期增殖的间质成纤维细胞与来源于EMT形 成的成纤维细胞其细胞表型共同发生转化，转化成肌 成纤维细胞（MyoF）。MyoF形成后，首先合成并分 泌纤粘连胶原蛋白（FN），组成ECM支架结构，继而 合成Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原成分，ECM形成。该期的 成纤维细胞依赖炎性刺激和致纤维化生长因子的持续 刺激下合成ECM为特点从而形成肾脏固有细胞、浸润 的炎性细胞、促炎症因子与抗炎症因子以及其他各种 生物活性物质在肾内相互作用，构成了错综复杂的关 系，最终纤维化形成。
⑵中药活性物质通过阻止凝血酶激活抑制因子 的合成，来解除凝血酶合成的障碍。通过凝血 酶合成能力的恢复，来加速ECM降解，从而阻 断ECM的大量积聚，恢复肾脏组织结构与肾功 能。
中药活性物质对肾脏的修复主要包括以 下五个方面： 第一、 激活残存肾单位功能，恢复正常 细胞代谢。 第二、 改善肾脏微循环，缓解缺氧状态， 加速肾脏修复。能缓解肾小球的三高（高灌 注、高内压、高滤过）状态，减少蛋白漏出， 促进排毒。

单细胞成纤维细胞亚群的marker基因-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以包括对单细胞研究和成纤维细胞亚群的marker 基因的概述。

具体内容可以参考以下示例：在生物医学研究领域，单细胞研究已经成为一种重要的技术手段。

随着高通量测序技术的发展，人们可以逐个细胞地分析其基因表达谱，从而揭示细胞的异质性和功能特性。

其中，成纤维细胞作为一类重要的细胞类型，广泛存在于人体组织中并且具有多种重要的生理功能。

在单细胞研究中，对成纤维细胞亚群的研究具有重要意义。

成纤维细胞是一类关键的结缔组织细胞，在维持细胞外基质的合成和重塑中起着重要的作用。

成纤维细胞的功能多样，包括参与生长因子的分泌与调控、参与组织修复与创伤愈合以及细胞外基质的合成与降解等。

此外，成纤维细胞还在炎症反应、免疫应答等生理和病理过程中发挥着重要的调节作用。

然而，由于成纤维细胞的异质性以及其亚群之间的功能差异，研究人员迫切需要一种能够准确鉴定和分类成纤维细胞亚群的方法。

为了解决这一问题，研究人员发展了一种名为marker基因的分析手段。

marker基因是一组具有特异性表达的基因，可以作为标志物来鉴定特定细胞类型或亚群。

通过鉴定成纤维细胞亚群的marker基因，研究人员可以更好地理解不同亚群间的功能差异和调控机制，并进一步揭示成纤维细胞在生理和病理条件下的作用。

本文将着重探讨单细胞研究中鉴定成纤维细胞亚群的marker基因的重要性，并对未来相关研究方向进行展望。

通过深入剖析marker基因的作用和意义，我们可以更好地认识成纤维细胞亚群的功能特点，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。

1.2 文章结构文章结构是指文章整体上的组织和安排方式。

一个清晰的文章结构可以帮助读者更好地理解和掌握文章的内容。

本文的结构分为引言、正文和结论三个部分。

引言部分用于介绍文章的背景和目的，引起读者的兴趣并概述文章的主要内容。

正文部分是文章的核心部分，包括单细胞研究的背景、成纤维细胞的功能和特点、成纤维细胞亚群的重要性以及Marker基因的作用和意义等内容。

皮肤与皮肤再生一、皮肤的解剖与生理皮肤作为一个复杂的器官覆盖人体全身，约占人体体重的15%，是人体最大的器官。

担负着多个重要的功能，主要为保护人体免受化学、物理或生物学伤害。

皮肤的构造精良，组织来源多样，包括上皮细胞、结缔组织、血管、肌肉和神经。

皮肤分为3层：表皮（内含附属器如皮脂腺、毛囊和汗腺），真皮和皮下组织。

皮肤细微结构在不同部位差异很大，如厚度、表皮附属物分布和黑素细胞密度。

除了手掌和足底，毛发遍布全身。

表皮是由不断自我更新的上皮细胞组成，细胞类型多样，但90%～95%为角质形成细胞，为来源于外胚层经历特定分化过程的上皮细胞，最终发展为扁平，无核的角质形成细胞。

角质形成细胞在分化成熟过程中经历从基底层向上迁移的过程，最终成为角质从表面脱落。

5%～10%的表皮细胞为非角质形成细胞，主要包括朗格汉斯细胞、黑素细胞和麦克尔细胞。

表皮细胞呈连续层状分布，由下至上分为：基底细胞层，棘细胞层或棘层（5～15层），颗粒细胞层（1～3层）和角质（或角化）层（5～10层），在人体某些部位（如掌跖），在颗粒层与角质层之间存在透明层。

表皮角质层细胞来源于基底层干细胞的有丝分裂，分裂出来的细胞向皮肤表面迁移，同时进行生态学和生物学分化（角质化），此过程大约需要30天。

基底层位于表皮底部与真皮层相邻，真皮层内丰富的血管可以供应基底层细胞所需要的营养。

表皮平均厚度为100μm，但在不同部位有差异（眼睑部位50μm而掌跖部位1mm）。

表皮内还有汗腺，亦由上皮细胞组成，但具有各自的生物学特性（如重建、分化和对外界刺激的反应）。

（一）角质形成细胞（KC）角质形成细胞的形态在表皮各层各不相同，基底层细胞为柱状或立方状，为6～10μm；其胞质嗜碱性，细胞核较大。

它们垂直于基底膜有序排列，以特殊的附着结构（半桥粒）锚定在基底膜上。

电镜下；棘层细胞较基底层细胞大，为10～15μm，呈多边形，胞质嗜酸性，内有一个泡状核与一个或两个突出的核仁。

肿瘤相关成纤维细胞的分类全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：肿瘤是一种极具危害性的疾病，其发生和发展涉及到一系列复杂的细胞类型和信号通路。

成纤维细胞在肿瘤的形成过程中扮演着重要的角色。

成纤维细胞是一种起源于间叶的细胞，具有合成胶原蛋白和纤维蛋白等蛋白质的能力，是维持组织结构和功能的重要细胞之一。

在肿瘤的微环境中，成纤维细胞可以被肿瘤细胞引导或激活，从而发生功能和表型的改变，促进肿瘤的生长和扩散。

根据其在肿瘤微环境中的不同功能和表型，我们可以将肿瘤相关成纤维细胞进行分类。

一、活跃型成纤维细胞活跃型成纤维细胞是一种具有高度代谢活性和细胞增殖能力的成纤维细胞。

在肿瘤微环境中，活跃型成纤维细胞能够被肿瘤细胞激活，释放大量的细胞因子和生长因子，如基质金属蛋白酶、血管内皮生长因子等，促进肿瘤细胞的增殖和转移。

活跃型成纤维细胞还可以合成大量的胶原蛋白和纤维蛋白，形成肿瘤的基质支架，为肿瘤的生长和扩散提供支持。

抑制型成纤维细胞是一种在肿瘤微环境中发挥抑制作用的成纤维细胞。

在肿瘤发生时，抑制型成纤维细胞可以通过释放抑制性因子或直接抑制肿瘤细胞的增殖和转移，从而抑制肿瘤的生长和扩散。

抑制型成纤维细胞在肿瘤治疗中具有重要的作用，可以成为潜在的靶点和治疗策略。

肿瘤相关成纤维细胞的分类是一个复杂而又重要的研究领域，对其进行深入的研究可以为肿瘤的发生机制和治疗提供重要的启示。

希望未来在这方面的研究能够取得更多的进展，为肿瘤的防治工作做出更大的贡献。

【本文共涉及1132字】第二篇示例：肿瘤相关成纤维细胞是一类具有重要生物学功能的细胞类型，在肿瘤的发生和发展过程中扮演着重要的作用。

成纤维细胞是结缔组织中的一种细胞类型，主要起到细胞外基质合成和修复组织损伤的作用。

在肿瘤相关成纤维细胞中，存在着多个亚型，根据其表型和功能的不同可以将其分类为多种类型。

根据功能和作用的不同，可以将肿瘤相关成纤维细胞分为促进和抑制肿瘤生长的两类。

促进肿瘤生长的成纤维细胞主要通过促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，促进肿瘤血管生成等途径来促进肿瘤的发展。

上皮间质转化和内皮间质转化在肾纤维化中的研究进展金芬;张忠寿;黄卫锋【摘要】上皮间质转化(EMT)和内皮间质转化(EndMT)参与各种纤维化疾病的发病机制，EMT和EndMT已经成为器官纤维化研究的一个重点课题。

EMT和EndMT在肾的纤维化过程中起到至关重要的作用。

越来越多细胞内外分子可控制EMT和EndMT的表达，尤其是microRNA (miRNA)在EMT和EndMT中的调控作用，已被确定可利用于开发治疗纤维化。

本文综述了EMT和EndMT在肾纤维化中的研究进展，了解EMT和EndMT参与肾病纤维化过程的机制，这将会给人类肾纤维化疾病的治疗提供一种新的靶点和方法。

【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2014(000)018【总页数】3页(P2723-2725)【关键词】上皮间质转化;内皮间质转化;肾的纤维化;miRNA【作者】金芬;张忠寿;黄卫锋【作者单位】三峡大学医学院，湖北宜昌 443002;三峡大学医学院，湖北宜昌443002;三峡大学医学院，湖北宜昌 443002【正文语种】中文【中图分类】R692.1+2肾纤维化是肾长期损伤或正常伤口愈合过程中功能失调，导致过量的细胞外基质(ECM)沉积造成的。

EMT与EndMT过程中激活产生的成纤维细胞是肾成纤维细胞的主要来源。

在肾纤维化过程中，肾成纤维细胞发挥着重要的作用。

在EMT和EndMT过程中存在复杂的调控，最新的研究表明，miRNA在EMT和EndMT过程中发挥重要的调节作用。

miRNA是小的非编码RNA，通过抑制蛋白质翻译或诱导mRNA降解来抑制靶基因的表达。

miRNA可调控细胞的分化、增殖、死亡、代谢等多种病理生理机制的基本过程[1]。

因此，研究EMT和EndMT过程在纤维化中的作用，可以推进我们对常见发病机制的理解，也可能为治疗干预提供新的靶点。

这篇综述侧重于上皮间质转化和内皮间质转化在肾脏疾病中的生物学角色。

在上皮-间质转化过程中上皮细胞有一系列的变化，它的极性丧失，迁移和运动能力增强，同时获得间质细胞特性。

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3、Patience is bitter, but its fruit is sweet. (Jean Jacques Rousseau , French thinker)忍耐是痛苦的，但它的果实是甜蜜的。10:516.17.202110:516.17.202110:5110:51:196.17.202110:516.17.2021
减轻角膜炎性反应，促进角膜上皮化，恢复正常的角膜上皮表型。 研究证明： 羊膜移植可以有效的治疗持续性角膜上皮缺损，单纯羊膜移植可以治疗角膜缘 干细胞的部分失代偿，并提高干细胞的移植成功率。但羊膜促进上皮化的机制 尚不清楚，可能与羊膜中含有促上皮生长因子。另外移植的羊膜可以作为干细 胞的载体，加速上皮的移行。
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羊膜的作用机制
羊膜移植的作用机制主要有5个方面
▪ 延长上皮细胞的生命，维持其克隆形成 ▪ 刺激上皮细胞的分化 ▪ 在置于含有成纤维细胞的结膜时能刺激杯状细胞的分化 ▪ 通过抗蛋白酶的活性，清除炎症细胞 ▪ 能抑制转化因子的信号传递和抑制正常成纤维细胞分化为
肌成纤维细胞
5个方面的临床效果
加速上皮化 维持正常上皮表型 减轻炎症反应 减轻血管化 减少瘢痕形成等
生物羊膜特点与应用
江西住友生物工程技术有限公司
羊膜-理想的眼科生物材料
自Davis(1910)首先利用羊膜作为生物敷料替代皮肤帮助 烧伤创面修复以来，羊膜作为一种来源方便、取材容易 和价格便宜等诸多优点的生物膜在临床上应用越来越广， 如覆盖烧伤的创面；修补阴道缺损；四肢溃疡；脾破裂 的修补和肾、胰移植时的包裹材料等等。
羊膜手术适应症
睑球粘连、结膜囊缺失、翼状胬肉、角膜溃疡、化学灼伤和 热烧伤、烫伤、近视眼手术并发症、干眼症、眼表肿瘤、眼 表多重手术损害、眼内疤、先天性无虹膜、眼角炎、角膜白 斑、青光眼手术、角膜新生血管、角膜病等。

国隧囱坌塑垡遨苤查２堂生！旦箜堑鲞筮！塑丛婴』丛曼！丛丛堂！趔！堂：巡堑！№：璺肾小管上皮细胞表型转化与糖尿病肾病李能娟李红【摘要】肾小管病变及肾问质纤维化在糖尿病肾病中的重要作用逐渐被认识，其中肾小管上皮细胞向间充质细胞转化（ＥＭＴ）可能是其发挥作用的关键环节，与肾间质纤维化的程度相平行。

在糖尿病肾病中引发ＥＭＴ的因素主要有高血糖、晚期糖基化终末产物、蛋白尿、血管紧张素Ⅱ、结缔组织生长因子等。

【关键词】糖尿病。

肾病；上皮细胞向间充质细胞转化；肾间质纤维化Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｔｏ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｎｄｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙⅡⅣｅ略扣ｎ，１１舶愕．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎ—ｄｏｃｎ加ｌｏｇｙ，ＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅＣｏｌｌｅｇｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１０００３，Ｃｈ／ｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｒｅ耐ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｐｌａｙｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，ａｎｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｔｏ－ｍｅ￥一ｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（ＥＭＴ）ｍａｙｂｅｔｈｅｋｅｙｓｔｅｐ．Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ，ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃａｆｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＡＧＥｓ），ａｎ·ｇｉｏｔｅｎｓｉｎ１Ｉ，ａｌｂｕｍｉｎｕｒｉａ，ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄｏｎ，ｍａｙｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＥＭＴｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ；Ｅｐｉｔｈｅｆｉａｌ－ｔｏ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；Ｒｅｎａｌｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ（ＩｎｔｅｒｎＪＥｎｄｏｃｎｎｏＺＭｅｔａｂ，２００６，２６：２７７—２７９）糖尿病肾病（ＤＮ）是糖尿病最为常见的慢性微血管并发症之一。

第七章生长因子类药物1、细胞因子的概念：由机体各种细胞第七章生长因子类药物1、细胞因子的概念：由机体各种细胞分泌的具有调控细胞生长分化、调节免疫功能和生理活性并参与病理反应的小分子蛋白质。

2、细胞因子的种类：白细胞介素（IL）：介导白细胞间相互作用的细胞因子，迄今发现IL-1至IL-26；集落刺激因子（CSF）：刺激造血细胞形成细胞集落，参与造血功能的细胞因子，如GM-CSF,G-CSF,M-CSF，EPO,TPO等；干扰素（IFN）：抵抗病毒的感染，干扰病毒复制的细胞因子，包括IFN-α,IFN-β,IFN-γ；肿瘤坏死因子（TNF）家族：可直接诱导肿瘤细胞凋亡的细胞因子，包括TNF-α,TNF-β；TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand),FAS配体等；趋化因子：具有趋化作用的细胞因子，能吸引免疫细胞到免疫应答局部，参与免疫调节和免疫病理反应。

分为CXC,CC,C,CX3C亚家族。

生长因子：对各种细胞具有促生长作用的细胞因子，如表皮生长因子，胰岛素样生长因子，血管内皮细胞生长因子等。

3、细胞因子结构和功能特点：小分子蛋白，单链或双链，多含糖基；量微而活性强；通过与细胞因子受体结合而发挥效应。

第一节生长因子概述1、生长因子概念：是一类调节细胞生长增殖的可溶性多肽类物，是导致细胞增殖效应的信息分子，又称为多肽生长因子。

2、生长因子的作用方式：生长因子通过与靶细胞上的生长因子受体特异性结合而发挥作用。

生长因子受体可位于细胞膜、细胞质或细胞核。

大部分生长因子受体位于细胞膜上。

胞外：配体结合区；中间：跨膜区；胞内：酪氨酸激酶活性区（1）生长因子与细胞膜受体结合（2）活化的膜受体激活细胞内某些物质（3）细胞内生长信息的传递（G蛋白，磷酸肌醇，环磷酰胺）（4）某些基因的活化3、生长因子分类：表皮生长因子（epidermol growth factor,EGF）；转化生长因子（transforming growth factor,TGF）；胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor,IGF）；神经生长因子（nerve growth factor,NGF）第二节胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子，是生长激素诱导靶细胞产生的一种具有促生长作用的肽类物质，由两种紧密相关的小肽，胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）和胰岛素样生长因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）组成。

心肌细胞成纤维细胞表型
心肌细胞和成纤维细胞是两种不同类型的细胞，它们在心脏组
织中起着不同的作用。

心肌细胞是构成心肌组织的细胞，主要负责
心脏的收缩和泵血功能。

而成纤维细胞则是一种结缔组织细胞，主
要负责合成和维持心脏组织的结缔组织。

在心脏组织中，心肌细胞和成纤维细胞表现出不同的表型。

心
肌细胞具有高度分化的特点，其特殊的细胞结构和功能使其能够进
行快速、有序的收缩和舒张，从而维持心脏的正常功能。

而成纤维
细胞则主要参与心脏组织的修复和再生过程，它们在心脏受损或受
到刺激时会发生表型改变，增殖并合成胶原蛋白等细胞外基质成分，从而促进受损组织的修复。

此外，心肌细胞和成纤维细胞在细胞内和细胞间信号传导、基
因表达调控等方面也有着不同的特点。

心肌细胞主要通过离子通道
和钙信号传导系统来实现心肌收缩和舒张，而成纤维细胞则参与调
节细胞外基质的合成和降解，从而影响心脏组织的结构和功能。

总的来说，心肌细胞和成纤维细胞在心脏组织中扮演着不同但
又密切相关的角色，它们的不同表型和功能特点对于维持心脏的正
常结构和功能至关重要。

对于心脏疾病的研究和治疗也需要深入了解这两种细胞的特性和相互作用。

《肿瘤相关成纤维细胞在胃癌肿瘤微环境中的作用》一、引言胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病机制复杂，涉及多种细胞和分子间的相互作用。

肿瘤微环境是影响胃癌发生、发展和转移的重要因素之一。

近年来，肿瘤相关成纤维细胞（CAF）在肿瘤微环境中的作用逐渐受到关注。

本文将就肿瘤相关成纤维细胞在胃癌肿瘤微环境中的作用进行探讨。

二、肿瘤相关成纤维细胞概述肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境中一种重要的细胞类型，与正常组织中的成纤维细胞相比，CAF在表型、功能和基因表达等方面存在显著差异。

CAF通过分泌细胞因子、生长因子和基质金属蛋白酶等，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和血管生成等过程。

三、肿瘤相关成纤维细胞在胃癌肿瘤微环境中的作用1. 促进胃癌细胞的增殖和侵袭CAF通过分泌多种生长因子和细胞因子，如EGF、TGF-β等，促进胃癌细胞的增殖。

同时，CAF还能分泌基质金属蛋白酶，降解细胞外基质，为胃癌细胞的侵袭和转移提供条件。

2. 调节免疫应答CAF通过分泌免疫抑制因子，如IL-10、TGF-β等，抑制机体的免疫应答，使胃癌细胞得以逃避免疫攻击。

此外，CAF还能通过分泌趋化因子，吸引免疫抑制性细胞如Treg细胞和MDSCs 等进入肿瘤微环境，进一步增强免疫抑制作用。

3. 促进血管生成CAF通过分泌血管生成因子，如VEGF等，促进新生血管的形成，为胃癌细胞提供营养和氧气。

同时，新生血管的形成也有助于胃癌的侵袭和转移。

四、研究进展与展望目前，针对CAF的研究已成为胃癌等恶性肿瘤领域的研究热点。

通过研究CAF的表型、功能和基因表达等特点，有望为胃癌的诊断、治疗和预后提供新的思路和方法。

未来研究可关注以下几个方面：1. 深入研究CAF与胃癌细胞之间的相互作用机制，为制定针对CAF的靶向治疗提供理论依据。

2. 探索CAF在胃癌免疫治疗中的作用，为免疫治疗提供新的策略和方向。

3. 研究CAF与其他肿瘤微环境成分的相互作用，全面了解胃癌肿瘤微环境的组成和功能。

康复新液对转化生长因子-β1诱导人胚肺成纤维细胞MRC-5纤维化模型的干预作用徐秋颖;刘伟伟;王宝家;马秀英;高永翔【摘要】为探讨康复新液对人胚肺成纤维细胞纤维化模型的干预作用,以转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1诱导人胚肺成纤维细胞MRC-5构建细胞纤维化模型,并运用CCK-8(cell counting kit-8)法检测康复新液对MRC-5细胞的毒性.以测得的最高不致死给药浓度(80倍稀释)的康复新液干预TGF-β1诱导的MRC-5细胞模型,进而通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(WB)检测细胞纤维化指标的mRNA及蛋白质表达水平变化.结果显示:10 ng/mL TGF-β1可成功诱导MRC-5细胞发生纤维化,且细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、层黏连蛋白(laminin,LN)、纤维连结蛋白(fibronectin,FN)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)的mRNA表达水平均显著升高;以80倍稀释的康复新液为最高不致死给药浓度,对MRC-5细胞纤维化模型进行干预,上述纤维化指标的mRNA及蛋白质表达水平均出现显著下降,与地塞米松(Dexamethasone,DXM)的干预效果相当.综上,康复新液可改善由TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化的表型,有望被应用于肺纤维化的治疗.%To investigate the effect of Kangfuxin liquid on the pulmonary fibrosis cell model,the pulmonary fibrosis cell model was established by treating human fetal lung fibroblast MRC-5 cell with transforming growth factor-β1(TGF-β1),and the toxic effect of Kangfuxin liquid on MRC-5 cell was detected by cell-counting kit-8(CCK-8)assay.Then,Kangfuxin liquid diluted by 80 times was implemented on MRC-5 cell model induced by TGF-β1,and the mRNA andprotein expression levels of fibrosis indexes were detected by qRT-PCR and Western blotting.The results showed that the pulmonary fibrosis cell model was established by treating human fe-tal lung fibroblast MRC-5 cell with TGF-β1 at the dose of 10 ng/mL.Kangfuxin liquid could significantly alleviate pulmonary fibrosis degree and efficiently down-regulate expression levels of α-SMA,LN,FN,CTGF,Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ in the pulmonary fi-brosis cell model,with the comparable effect with Dexamethasone.Thus Kangfuxin liquid could significantly alleviate pulmonary fi-brosis degree and might be a potential anti-fibrosis drug.【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(057)003【总页数】6页(P432-437)【关键词】康复新液;肺纤维化;转化生长因子-β1;MRC-5细胞【作者】徐秋颖;刘伟伟;王宝家;马秀英;高永翔【作者单位】成都中医药大学基础医学院,四川成都 610075;成都中医药大学基础医学院,四川成都 610075;成都中医药大学基础医学院,四川成都 610075;药用美洲大蠊四川省重点实验室,四川成都 610000;成都中医药大学基础医学院,四川成都 610075【正文语种】中文【中图分类】R33肺纤维化(pulmonary fibrosis)发生于许多不同病因引发的肺间质疾病,生理特点表现为肺泡持续性损伤、成纤维细胞(fibroblast)增殖及大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积,从而导致肺组织反复破坏、修复,最终造成肺组织中的大量胶原沉积[1].康复新液是由美洲大蠊(Periplaneta americana L.)干燥虫体的乙醇提取物制成的溶液,其主要成分包括氨基酸(17种以上,包含人体必需氨基酸)、多肽(抗菌肽、咽侧体抑制神经肽、焦激肽等)、多糖(硫酸黏多糖等)、核苷(次黄嘌呤、尿嘧啶等)及油脂等[2].《神农本草经》记载其“味咸、寒,生川泽,治血癖症坚、寒热,破积聚,喉咽痹,内寒无子”.康复新液可“通利血脉,养阴生肌”,内服可治消化道出血与溃疡等,外用可疗金疮、外伤等,具有改善黏膜创面微循环、加速机体病损组织修复再生、增强免疫力等功能.已有研究显示康复新液可以改善实验性结肠炎,治疗小儿手足口病、带状疱疹、干症、头颈部恶性肿瘤等[3].随着临床使用康复新液的范围不断扩大,其更多药效有待挖掘,而目前尚无关于其应用于肺纤维化治疗的报道.在肺纤维化的进程中,许多因子参与调控,其中最重要的是转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1[4-5],它可以促进成纤维细胞的迁移、增殖及其向肌成纤维细胞的转化,加速ECM的过度分泌,逐渐以纤维组织取代正常的肺组织,对肺功能造成不可逆的破坏.结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是TGF-β1诱导的早期基因表达产物,在病理状态下,纤维化组织中CTGF的表达量会明显增加[6].这个过程中肌成纤维细胞会表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)这种独特的分子[7],而α-SMA增多可明显增强肌成纤维细胞的迁移及收缩能力,进而增强ECM的合成和分泌.ECM的主要成分是纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和层黏连蛋白(laminin,LN),其中FN可以诱导胶原的形成,从而导致脏器的纤维化[8].FN、LN及胶原的合成增多、降解减少会导致ECM的过度积聚,进而导致纤维化.肺纤维化时还会出现基底膜增厚，这主要与FN和Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)表达明显增加有关[9].本研究选取α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)这6种反映肺纤维化程度的因子,作为检测康复新液对肺纤维化是否有效的客观指标.通过肺纤维化中的关键因子TGF-β1诱导人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast)MRC-5细胞系,构建细胞纤维化模型.验证此模型成功后,运用CCK-8(cell counting kit-8)法检测康复新液对MRC-5细胞的毒性,得出康复新液对MRC-5细胞的最高不致死给药浓度.进而使用此安全浓度干预TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化,从而在细胞层面实现康复新液治疗肺纤维化的有效性验证,旨在扩大中成药康复新液的适应范围,从干预肺纤维化的角度对其进行二次开发.1 材料与方法1.1 细胞系MRC-5细胞来源于中国科学院上海细胞库,使用MEM(minimum essential medium)培养基(Gibco,41500034),添加10%(体积分数)胎牛血清(Gibco,10099-141),于37 ℃、5%(体积分数)二氧化碳的恒温培养箱中进行培养,5～7 d传代,按1瓶细胞传2～3瓶的比例进行.1.2 试剂及耗材实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测试剂Realtime PCR Master Mix(QPK-201)、反转录试剂ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix(FSQ-201)购自ToYoBo公司,RNA抽提试剂TRIzolTM Plus RNA Purification Kit(12183555)购自Invitrogen公司.地塞米松(Dexamethasone,DXM;5 mg/mL,02138)购自西南药业股份有限公司.LN抗体(ab11575)、FN抗体(ab2413)、α-SMA抗体(ab124964)购自Abcam公司,CTGF抗体(86641)购自CST公司,CollagenⅠ抗体(14695-1-AP)购自Proteintech公司,CollagenⅢ抗体(OM275892)购自Omnimabs公司,内标甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(200306-7E4)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠(511103)与羊抗兔(511203)二抗购自Zen-bioscience公司.无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇等均为国产分析纯试剂.所用耗材均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，为一次性无RNA酶耗材.1.3 主要设备和仪器qRT-PCR仪(CFX96,Bio-Rad公司)、离心机(5415D,Eppendorf公司)、微量分光光度计(NanoDrop 2000,Thermo Fisher公司)、全波长酶标仪(Multiskan Spectrum,Thermo Fisher公司),高速冷冻离心机(Legend Microfuge 22R Centrifuge,Thermo Fisher公司).1.4 引物本研究中所使用的引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成,序列见表1.表1 引物及其序列Tab.1 Primers and their sequences名称序列(5′→3′) h-CollagenⅠ-FGAGGGCCAAGACGAAGACATC h-CollagenⅠ-RCAGATCACGTCATCGCACAAC h-CollagenⅢ-FTTGAAGGAGGATGTTCCCATCT h-CollagenⅢ-RACAGACACATATTTGGCATGGTT h-α-SMA-FGTGTTGCCCCTGAAGAGCAT h-α-SMA-RGCTGGGACATTGAAAGTCTCA h-FN-FCGGTGGCTGTCAGTCAAAG h-FN-RAAACCTCGGCTTCCTCCATAA h-LN-FGGACGAAAAGAAGTGCTTCCT h-LN-RGCAGGGATACCATTCTCTGACT h-CTGF-FAAAAGTGCATCCGTACTCCCA h-CTGF-RCCGTCGGTACATACTCCACAG GAPDH-FACAACTTTGGTATCGTGGAAGG GAPDH-RGCCATCACGCCACAGTTTC1.5 MRC-5细胞纤维化模型的建立与检测MRC-5细胞接种24 h后加入TGF-β1(10 ng/mL)进行诱导[10],分别在0,48与72 h取样;使用TRIzolTM Plus RNA Purification Kit进行RNA抽提,测定RNA 浓度及纯度,并用反转录试剂ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix按照1μg/10 μL体系进行逆转录;之后以GAPDH为内参,于qRT-PCR仪检测α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ的mRNA表达水平.20 μL反应体系:SYBR(2×)10 μL,上、下游引物各0.8 μL,cDNA模板2 μL,无核酸酶水6.4 μL.反应程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火延伸30 s,40个循环.以2-ΔΔCt 法进行mRNA相对表达水平的分析.1.6 CCK-8法检测在96孔细胞培养板中按照每孔细胞数104接种,24 h后分别加入10倍、20倍、40倍、80倍、160倍及320倍稀释的康复新液(使用完全培养基稀释),同时设置不加药对照;培养72 h后加入1/10培养基体积的CCK-8试剂,继续培养1 h,采用酶标仪记录450 nm的吸光度,绘制生长曲线.1.7 康复新液干预*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,下同.图1 TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化模型中纤维化指标的mRNA相对表达水平Fig.1 Relative mRNA expression levels of fibrosis indexes in the MRC-5 cell fibrosis model induced by TGF-β1在6孔细胞培养板中按照每孔细胞数105接种,细胞贴壁后加入10 ng/mL的TGF-β1进行纤维化诱导,24 h后加入最高不致死给药浓度的康复新液进行干预;在干预24,48与72 h时取样,用于qRT-PCR与蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB)检测,同时设置DXM(50 μg/mL)阳性对照组,处理72 h后取样.分别检测α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ及GAPDH(内参)的表达量.qRT-PCR反应体系与反应程序参照1.5小节步骤.WB操作如下:使用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻洗涤细胞样品3次,加入含蛋白酶抑制剂的RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液,4 ℃裂解20 min,12 000 r/min离心5 min后收取上清;BCA(bicinchoninic acid)法测定蛋白浓度,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带,湿转至聚偏氟乙烯膜,5%(质量分数)牛血清白蛋白封闭1 h后加入一抗，4 ℃孵育过夜；含0.5%(体积分数)吐温-20的Tris-盐酸缓冲液(TBST)洗涤3次后加入HRP标记二抗,37 ℃孵育1 h后用TBST洗涤3次；加入增强型化学发光底物发光液,于化学发光成像仪下拍照.1.8 统计学分析数据用表示；用SPSS 13.0软件进行统计分析,通过配对样本t-检验和独立样本t-检验进行组间比较,p<0.05表示差异显著.2 结果与分析2.1 TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化模型检测以10 ng/mL TGF-β1处理MRC-5细胞,通过qRT-PCR分别检测0,48,72 h后α-SMA、LN、FN、CTGF、Collage n Ⅰ、Collagen Ⅲ这6个特异性纤维化指标的mRNA相对表达水平,结果如图1所示:FN、CTGF、CollagenⅢ的mRNA相对表达水平在48 h出现显著升高,α-SMA、LN、CollagenⅠ的mRNA相对表达水平则在72 h出现显著升高,可见MRC-5细胞在TGF-β1诱导下48 h时出现纤维化,72 h时纤维化充分,呈现出一定的时间依赖性,说明72 h时此模型诱导成功. 2.2 康复新液对MRC-5细胞的毒性检测1.空白对照;2.TGF-β1诱导模型;3～5.康复新液干预24，48，72 h;6.DXM阳性对照(下同).图3 康复新液干预不同时间后TGF-β1诱导MRC-5纤维化细胞模型中纤维化指标的mRNA表达水平Fig.3 Relative mRNA expression levels of fibrosis indexes after Kangfuxin liquid treatment on the MRC-5 cell fibrosis model for different time通过CCK-8法检测不同稀释倍数的康复新液对MRC-5细胞的毒性,结果见图2:MRC-5细胞在10～40倍稀释的康复新液作用下增殖受强烈抑制,在80倍稀释的康复新液作用下有明显增殖,160倍及以上稀释的康复新液作用下与空白对照基本一致.由此可见最高不致死给药浓度为80倍稀释,因此后续实验中使用80倍稀释作为康复新液的处理浓度.图2 CCK-8法检测康复新液对MRC-5细胞的毒性Fig.2 Toxic effects of Kangfuxin liquid on MRC-5 cells by CCK-8 assay2.3 康复新液对TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化模型的干预以80倍稀释的康复新液干预TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化模型,干预时间分别为24,48和72 h,通过qRT-PCR仪检测6个特异性纤维化指标的mRNA相对表达水平,比较干预不同时间的效果差别,结果如图3所示:空白对照组和TGF-β1诱导模型组比较有显著差异；康复新液干预组与TGF-β1诱导模型组比较，干预24 h 时mRNA相对表达水平均出现显著下调;康复新液干预组72 h时与DXM阳性对照组相比,α-SMA和FN的mRNA相对表达无显著差异,其他纤维化指标的mRNA 相对表达水平显著高于DXM阳性对照组,但也显著低于TGF-β1诱导模型组.上述结果表明80倍稀释的康复新液可以有效降低TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化模型中纤维化指标的mRNA表达水平.进而通过WB方法检测康复新液干预不同时间后TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化模型中上述6个特异性纤维化指标的蛋白表达水平,结果如图4所示:TGF-β1诱导模型组和空白对照组相比,各蛋白表达水平均上调,说明造模成功;康复新液干预组与TGF-β1诱导模型组相比,α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表达水平在24～72 h持续降低,LN、FN和CTGF蛋白表达水平在48 h出现明显降低;康复新液干预组与DXM阳性对照组相比,72 h时康复新液干预组中α-SMA、LN、FN和CollagenⅢ蛋白表达水平略高,CTGF和CollagenⅠ蛋白表达水平相当.所得结果与qRT-PCR仪检测的趋势基本一致,表明康复新液干预可以有效降低这些纤维化指标的蛋白表达水平.图4 康复新液干预不同时间后TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化模型中纤维化指标的蛋白表达水平Fig.4 Relative protein expression levels of fibrosis indexes after Kangfuxin liquid treatment on the MRC-5 cell fibrosis model for different time3 讨论在世界范围内,组织器官纤维化是许多疾病致残、致死的主要原因.有关统计表明,特发性肺纤维化的患者从疾病诊断到死亡的时间仅2～5年,5年生存率仅20%[11].临床上这类患者大都会使用糖皮质激素治疗,但是糖皮质激素只对1/3的患者有一定的疗效,并且长期使用糖皮质激素会出现很多不良反应,如库欣综合征、机体免疫力下降、伤口难愈合等[12].虽然2014年美国食品药品监督管理局(FDA)已批准肺纤维化的药物吡非尼酮(pirfenidone)和尼达尼布(nintedanib)用于临床,但这两种药物只能延缓疾病进程,对肺纤维化并没有实质的治疗作用,加之进口药品价格不菲,难以被患者接受,临床上使用的安全及有效性仍需要更多的数据支持[13].目前国际公认的最有效治疗方式是肺移植,但是肺移植存在肺供体少、手术风险大、技术要求高、价格昂贵等缺点,很难在肺纤维化的治疗中广泛选用.因此,拓展新的治疗措施并在临床上推广有重要的意义.肺纤维化的形成过程中,成纤维细胞在TGF-β1的刺激作用下被激活并转化成肌成纤维细胞.而肌成纤维细胞的胞浆丰富,能够分泌胶原的同时还具有收缩功能,具备成纤维细胞和平滑肌的双重特性,是造成ECM异常沉积的主要细胞[14].因此肺成纤维细胞不断增殖并向肌成纤维细胞转化是肺纤维化发生发展的关键所在.本研究成功构建了TGF-β1诱导的MRC-5细胞纤维化模型,经检测纤维化特征性因子α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ在建模中的mRNA表达水平均有所上调.以80倍稀释的康复新液干预此模型后,上述指标因子的mRNA 和蛋白表达水平均有所下调,表明康复新液对MRC-5细胞纤维化模型可起到有效的干预作用,效果与DXM相当,为抗纤维化的药物开发提供了新的思路和方向.但本研究也存在一定的局限性,即本研究中MRC-5细胞来源于中国科学院上海细胞库,经过多次培养后细胞的增殖及可诱导性都有所下降,因此临床上康复新液用于肺纤维化患者的效果还有待进一步验证.【相关文献】[1] 徐慧蓉,马小兵,王献华.肺纤维化相关因子研究进展[J].现代预防医学,2011,38(10):1953-1955.[2] 李奇娟,王战国,刘巧,等.美洲大蠊研究现状及其研究中关键问题分析与展望[J/OL].中国中药杂志,2018.[2018-02-10].https:∥/kcms/doi/10.19540/ki.cjcmm.20180201.009.[3] 陈新,王洪,张艳萍.康复新液的最新临床应用[J].中国医药指南,2016,6(17):89-96.[4] THIERY J P,ACLOQUE H,HUANG R Y,et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell,2009,139(5):871-890.[5] RADISKY D C，LEVY D D，LITTLEPAGE L E，et al.Rac1b and reactive oxygen species mediate MMP-3-induced EMT and genomic instability[J].Nature,2005,436(47):123-127. 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