超滤法(ultrafiltration)分离明胶厚壳贻贝血清蛋白溶液

生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。

透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。

在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。

透析只需要使用专用的半透膜即可完成。

通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。

保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。

透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。

透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。

透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。

商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。

为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。

可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。

实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。

使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。

凝胶过滤法分离蛋白质实验报告
凝胶过滤法是一种分离蛋白质的方法。

本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构，能够根据分子大小的不同进行分离。

大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而小分子物质要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。

从而实现分离的目的。

实验步骤包括凝胶溶胀、装柱、样品处理、上样和过滤、部分收集和凝胶回收。

在收集洗脱液的过程中，开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。

接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。

这是因为分子的扩散有快有慢，少量的高铁血红蛋白与缓冲液一起滴出，使得溶液慢慢加深。

3.经过过滤后，溶液变成深褐色，这是高铁血红蛋白的本色。

颜色越深，表示过滤后蛋白质越纯。

4.随着洗脱的进行，红褐色开始变浅。

这是因为大部分高铁蛋白已经被洗脱，只剩下一小部分洗脱较慢的高铁蛋白。

5.开始呈现浅黄色，并逐渐变成无色，这是由于高铁氰化钾的扩散速度不同。

一部分高铁氰化钾扩散得很快，接着大部分K3Fe(CN)6被洗脱出来，最后全血几乎被洗脱完毕。

试管中接收的是缓冲液。

6.红褐色先释放出来，然后才是黄色。

这是因为血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白，因为高铁血红蛋白的分子较大，洗脱速度较快。

而小分子的高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，因此红褐色先被洗脱出来，黄色则稍后。

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定一、实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术二、实验原理：蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。

对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。

利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。

A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。

B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。

C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。

D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

三、材料与方法A材料样品：人混合血清试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓2冲溶液、电泳仪、电泳槽B实验步骤盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）具体操作流程示意：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。

血清中蛋白提取方法血清是人体血液中的液体部分，其中含有丰富的蛋白质。

蛋白质是生命活动中不可或缺的重要分子，因此提取血清中的蛋白质对于研究和应用具有重要意义。

本文将介绍几种常用的血清中蛋白提取方法。

一、盐析法盐析法是一种常用的蛋白质提取方法，其原理是利用不同离子强度对蛋白质的溶解度差异进行分离。

首先将血清样品加入含有不同浓度盐溶液的离心管中，然后离心沉淀蛋白质。

通过调节盐浓度，可以选择性地提取特定类型的蛋白质。

二、凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于蛋白质分子大小差异进行分离的方法。

首先将血清样品加入具有特定孔径大小的凝胶柱中，较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔隙而被滞留，较小分子量的蛋白质则可以通过凝胶柱流出。

通过这种方式，可以将不同分子量范围的蛋白质分离提取。

三、电泳法电泳法是一种利用电场作用下蛋白质的电荷和分子量差异进行分离的方法。

在电泳过程中，将血清样品置于凝胶中，通过施加电场使蛋白质在凝胶中移动。

根据蛋白质的电荷和分子量差异，可以将不同类型和不同大小的蛋白质分离开来。

电泳方法具有高分辨率和高灵敏度的优点，广泛应用于蛋白质分离和分析领域。

四、亲和层析法亲和层析法是一种利用蛋白质与特定配体之间的特异性相互作用进行分离的方法。

在亲和层析过程中，将具有特定配体的固相材料填充在柱子中，然后将血清样品溶液通过柱子。

与配体有特异性相互作用的蛋白质将与配体结合，并通过洗脱步骤将蛋白质从柱子中洗脱出来。

亲和层析法可以高效地提取特定类型的蛋白质。

五、质谱法质谱法是一种基于蛋白质质量和电荷差异进行分离和鉴定的方法。

在质谱法中，首先将血清样品进行蛋白质提取和纯化，然后通过质谱仪对蛋白质进行分析。

质谱法具有高分辨率和高灵敏度的优点，可以对蛋白质进行精确的定性和定量分析。

血清中蛋白提取方法主要包括盐析法、凝胶过滤法、电泳法、亲和层析法和质谱法等。

根据需要和实验目的的不同，选择合适的方法可以高效地提取和分离血清中的蛋白质。

这些方法在生命科学研究和临床应用中发挥着重要的作用，为人们深入了解蛋白质的功能和相互作用提供了重要的技术手段。

凝胶过滤法分离蛋白质实验原理ONE:分子筛层析molecular-sieve chromatography凝胶过滤层析gel-filtration chromatography分子排阻层析molecular exclusion chromatography凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。

当混合溶液过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质按不同分子量筛分开。

TWO:凝胶过滤介质不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，多孔的网状结构。

常用凝胶：葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose），聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P）。

凝胶因交联度不同,孔径不同，交联度越大，孔径越小。

蛋白质分子直径>凝胶孔径时，被排阻在外，小于孔径者则进入凝胶。

THREE:交联葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。

按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。

Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。

Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。

G值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀越小，只能分离相对分子量小的物质；G值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀越大，可以分离相对分子量大的物质；分离范围Mr（肽和球蛋白）Sephadex G-25 1000-5000Sephadex G–50 1500-30000Sephadex G–75 3000-70000补充说明：凝胶过滤层析特点❃设备简单，操作方便❃分离条件温和，样品回收率高（100%）❃实验重复性好除盐：☊选择孔径小，交联度大的凝胶。

☊Sephadex G-25全排出的最小分子量为5000☊Sephadex G–50全排出的最小分子量为30000（除盐的蛋白质分子量必须大于30000，消除凝胶对蛋白质的滞留作用。

蛋白质溶液的浓缩方法1.渗透浓缩法：渗透浓缩法是一种常见的浓缩蛋白质溶液的方法。

这种方法基于溶液和溶剂浓度差异的渗透力，利用半透膜将小分子溶质（如盐、小分子蛋白质）透过，同时阻止大分子溶质（如蛋白质）的通过。

常见的膜材料有聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯酰胺（PAM）等。

渗透浓缩法的步骤如下：（1）选择合适的膜材料，将膜组装在浓缩装置上。

（2）将蛋白质溶液加入装置中，通过渗透作用，溶液中的小分子溶质会透过膜，而蛋白质则被滞留在浓缩装置中。

（3）持续向装置中加入纯水或缓冲液，以保持浓缩装置内的水分量，促进蛋白质的浓缩。

（4）根据需要，可以多次重复以上步骤，加速蛋白质的浓缩过程。

2.覆膜浓缩法：覆膜浓缩法是通过将蛋白质溶液覆盖在薄膜上，然后通过薄膜的渗透作用，使溶剂透过薄膜，蛋白质被浓缩的方法。

这种方法适用于小规模的浓缩操作，例如实验室规模的研究。

覆膜浓缩法的步骤如下：（1）选择合适的薄膜材料，如高密度聚乙烯（HDPE）膜。

（2）将膜材料放在容器内，然后将蛋白质溶液倒入容器，覆盖在膜上。

（3）通过薄膜的渗透作用，溶剂会透过膜，蛋白质被滞留在薄膜上。

（4）可以将浓缩后的蛋白质从薄膜上刮取或者用缓冲液冲洗。

3.超滤法：超滤法是一种常见且有效的蛋白质溶液浓缩方法。

这种方法利用超滤膜的孔径选择性，将大分子溶质（如蛋白质）从溶液中滤出，从而实现浓缩。

超滤法的步骤如下：（1）选择合适的超滤膜，根据蛋白质的大小选择孔径大小。

（2）将膜组装在超滤设备上，确保完好无损。

（3）将蛋白质溶液加入设备中，通过压力或重力作用，使溶液通过超滤膜。

（4）大分子溶质（如蛋白质）会被滞留在超滤膜上，形成浓缩液，滤出物则为小分子溶质。

总结：以上所述是几种常见的蛋白质溶液浓缩方法。

这些方法各有特点，在具体操作中可以根据蛋白质的性质、浓缩效果和设备条件等因素选取合适的方法。

同时，为了保证蛋白质的活性和稳定性，在浓缩过程中也应注意蛋白质的处理温度、pH值和离子浓度等因素，以避免对其产生不良影响。

超滤法生产大豆分离蛋白的研究超滤法生产大豆分离蛋白的研究大豆分离蛋白是一种高品质、高营养的植物蛋白，主要由Glycinin和Beta-conglycinin两种储存蛋白组成。

它们能够提供人体所需的必需氨基酸，并且不含胆固醇。

近年来，随着人们对健康食品的追求，大豆分离蛋白被广泛应用于食品和保健品的生产领域。

为了提高大豆分离蛋白的纯度和产量，超滤法成为了一种常用的工艺方法。

超滤法的原理是以分子量为基础，通过孔径较小的滤膜，将大分子物质和小分子物质分离开来。

分离蛋白的过程中，先将大豆磨成粉末，然后加入适量盐酸、苏打等试剂，使大豆分离蛋白有所溶解。

这样的混合物经过调节后，会在超滤装置上进行加压，将大分子物质如未被酵素水解的蛋白多肽、油脂等通过滤膜留在上部，而小分子物质如溶解的水分和蛋白质被抽离到滤膜下部。

超滤法生产大豆分离蛋白的关键在于滤膜的选择和运用。

滤膜的选择较为复杂，需考虑至少四个因素：分子量截留、生产效率、维护成本和耐化学腐蚀程度。

一般分子量在1-40kDa之间的滤膜具有好的截留效果，选择这样的滤膜可以使大分子物质过滤不过去。

但是，超龄法的滤膜数量较多，且需要经常更换，所以需要兼顾生产效率和维护成本。

此外，滤膜应该是耐化学腐蚀的，因为混合物中加入的试剂有可能对滤膜有反应。

关于超滤法生产大豆分离蛋白的技术难点，主要包括以下两个方面。

首先是选择最合适的滤膜。

我国目前缺乏大量的关于大豆分离蛋白滤膜的研究，滤膜的放大生产和应用还存在很多问题，例如滤膜压力不稳定、堵塞、泄漏等情况。

同时，大豆分离蛋白的成分较为复杂，由多种蛋白组成，难以从中区分出各种蛋白的分子量差异。

因此，选择合适的滤膜十分重要，以充分发挥超滤法分离蛋白的优势。

其次，是克服生产过程中的成本和瓶颈问题。

虽然超滤法生产的大豆分离蛋白质量高，但耗费的原材料成本比传统分离法要高很多，生产效率也较低。

在提高产品质量的同时，如何控制生产成本，实现产量和商业利润的平衡，是挑战超滤法生产大豆分离蛋白的一个关键问题。

凝胶过滤法分离蛋白质一、实验目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。

二、实验原理凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。

高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。

当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。

由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。

从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。

三、试剂与仪器0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.0），0.4%K3Fe(CN)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒四、实验步骤1.凝胶溶胀2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。

使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。

待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。

3.样品处理4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。

打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。

凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。

5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。

并观察柱上的色带，待黄色的0.4%完全脱下来后，再继续收集两管透明洗脱液作对照，关闭出口。

6.凝胶回收：收集样品后，凝胶柱用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，从回收凝胶留给下一组。

五、实验现象结果及其讨论颜色：开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。

接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。

原因：1.开始时，由于先加进缓冲液，而加入的全血扩散没有那么快，所以白色透明液体为缓冲液。

将单细胞蛋白从发酵液分离的方法
将单细胞蛋白从发酵液中分离的方法有以下几种：
1. 超滤法：利用超滤膜进行分离，选择合适的孔径超滤膜，将发酵液通过超滤膜，使单细胞蛋白和较大分子物质（如细胞碎片、菌体等）被滤除，较小分子物质（如蛋白质）通过滤膜，实现分离。

2. 蛋白质沉淀法：利用化学药剂（如盐酸、硫酸等）或有机溶剂（如醇类）将单细胞蛋白沉淀下来，然后通过离心等方法将沉淀物与上清液分离。

3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法：将发酵液样品施加在聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行电泳分离，通过移动电场的作用，使不同分子质量的蛋白质在凝胶中移动，实现分离。

4. 逆流凝胶过滤法：将发酵液通过特殊的过滤介质，利用逆流的方式进行过滤，将单细胞蛋白与其他物质分离。

5. 有机溶剂抽提法：利用有机溶剂（如醇类）的溶解性差异，将单细胞蛋白与其他组分进行分离，然后通过溶剂的蒸发和回收，得到单细胞蛋白。

以上方法可以根据具体的实验条件和要求进行选择和优化，以实现高效的单细胞蛋白分离。