临床微生物实验室血培养操作标准1 范围本标准规定了血培养标本临床微生物检验的技术要求。
本标准适用于开展血培养的临床微生物实验室。
2 术语一套血培养：从同一穿刺点同时采集的血液标本，分别注入需氧和厌氧瓶；静脉输液港：一种植入皮下，可长期留置在体内的静脉输液装置；HACEK菌群：嗜沫嗜血杆菌、伴放线放线杆菌、人心杆菌、啮氏艾肯菌和金氏金菌；血培养污染率：一般由凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌、芽孢杆菌、痤疮丙酸杆菌和微球菌等污染引起的阳性瓶占总送检瓶数的比例。
3 导言人体血液中有很多物质，包括溶菌酶、白细胞、免疫球蛋白、补体等，可在几分钟内将入侵血流的微生物清除。
当微生物感染超出人体免疫系统的防御能力时，人体不能将微生物局限于原始感染的部位，或在治疗中不能通过切除、引流等措施清除感染源，那这些微生物将侵入血液迅速繁殖形成菌血症或真菌血症。
一过性菌血症常发生于对感染灶的外科处理、黏膜的创伤操作和易污染的外科手术，亦可发生于全身或局部感染的早期；间歇性菌血症常发生于腹腔等部位未能及时引流的脓肿；持续性菌血症常发生于感染性心内膜炎等血管内膜感染以及伤寒和波浪热的最初几周。
菌血症是临床急症，应尽快采集血液进行培养。
血培养是对入住急诊科、ICU患者、移植患者以及静脉插管患者的败血症进行早期诊断的一种方法，并根据阳性血培养病原菌的药物敏感性试验，可为临床医生提供最佳的抗菌药物治疗方案，对降低病死率有很大帮助，血培养对于临床诊断和预后评估也具有重要的意义。
4 血样采集和培养瓶接种4.1 采血指证可疑感染患者出现以下一种或几种特征时，可以考虑采集血培养：发热（≧38℃）或低温（≤36℃），寒战，白细胞计数增多（计数＞10.0×109 /L，特别有“核左移”时）或减少（计数＜3.0×109 /L），皮肤黏膜出血，昏迷，多器官衰竭，血压降低，C反应蛋白、降钙素原（PCT）、1，3-β-D-葡聚糖（G试验）升高及突然发生的急性呼吸、体温和生命体征改变。
4.2 采血时间及套数4.2.1 采血时间推荐在寒战或高热高峰前后采集，用抗菌药物之前采集。
4.2.2 血培养套数应同时采集2~3套血培养，2~5d内无需重复采集血培养。
只有在怀疑感染性心内膜炎或其他血管内感染（如导管相关性感染）时，才有必要间隔多次采集血培养。
对于新生儿，采集一瓶儿童需氧瓶，建议同时做尿液和脑脊液培养。
4.3 采血量成人每瓶采血量8~10ml，儿童1~5ml，但不应超过患儿总血量的1%。
血液和肉汤之比1:5~1:10。
新生儿0.5ml。
4.4 需氧瓶和厌氧瓶间的血标本分配4.4.1 采血量充足的患者推荐配套需氧瓶和厌氧瓶，将血液先注入厌氧瓶，后注入需氧瓶。
4.4.2 采血量不足的患者应将充足血标本先注入需氧瓶，再将剩余血液注入厌氧瓶。
有利于分离出真菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌。
4.5 血培养采集程序4.5.1 采集血培养标本之前首先做好手卫生。
静脉穿刺点选定后，去除血培养瓶的塑料瓶帽，切勿打开金属封口和胶塞，使用70%异丙醇或75%乙醇消毒，自然干燥60s；4.5.2在穿刺前或穿刺期间，防止静脉滑动，可戴无菌乳胶手套固定静脉；4.5.3穿刺点皮肤消毒；4.5.3.1三步法1）75%酒精擦拭静脉穿刺部位，待干30s以上；2）1%~2%碘酊作用30s或10%碘伏60s，从穿刺点向外画圈消毒至消毒区域达3cm以上；3）75%酒精脱碘：对碘过敏的患者，用75%酒精消毒60s，待酒精挥发干燥后采血。
穿刺点消毒后不可再接触。
4.5.3.2 一步法：0.5%葡萄糖酸洗必泰作用30s（不适用于2个月以内的新生儿），或70%异丙醇消毒后自然干燥。
4.5.4 用注射器无菌穿刺取血后，勿换针头（如果行第二次穿刺，换针头），直接注入血培养瓶，不可将抗凝血注入商品化血培养瓶；4.5.5 血液接种到培养瓶后，轻轻颠倒混匀以防血液凝固。
4.5.6完成工作后洗手。
5 血培养瓶运送血培养瓶应尽快送至实验室孵育或上机，如果运送延迟，应在血液接种以后尽快35~37℃孵育，切勿冷藏或冷冻。
如果病房没有孵育箱，血培养瓶应置于室温下，而非冷藏或冷冻。
6 血培养标本的接收与拒收标准6.1 实验室工作人员在收到标本之后应观察血培养瓶生长的指示信号，如果指示剂有细菌生长，则应该进行涂片镜检。
6..2血培养瓶一般不予拒收，如发现以下情况：血培养瓶标识错误或没有标识，破碎，损坏，渗漏，凝血等情况，应及时与临床联系。
7实验室操作方法及流程7.1 影响检出率的关键因素7.1.1 培养基胰酶消化的大豆肉汤（TSB）是应用最广泛的基础培养基，脑心浸液、哥伦比亚、布鲁氏硫醇疏基乙酸盐和添加蛋白胨肉汤也是常见的用于需氧菌和厌氧菌的培养基。
Middlebrook肉汤可增强分支杆菌的复苏能力。
7.1.2添加剂抗凝剂聚茴香脑磺酸钠（SPS），能中和溶菌酶，抑制吞噬作用，使部分氨基糖苷类失活，抑制部分补体串联。
浓度为0.025~0.05%，有些浓度低到0.006%。
SPS会抑制部分细菌生长，包括奈瑟菌属、厌氧消化链球菌、卡他莫拉菌和阴道加德纳菌。
除了营养肉汤可稀释血液以及SPS可降血中抗生素对细菌的抑制作用外，某些血培养瓶中加入了抗生素和或吸附剂，如树脂。
抗凝剂肝素、EDTA和柠檬酸盐对微生物有毒性，不能用于血培养瓶中。
7.1.3 孵育条件7.1.3.1 温度：35~37℃孵育7.1.3.2气体：出厂的血培养瓶中气压的气压低于大气压以保证能注入足量的血液。
有些手动系统，培养瓶必须用针制造一个需氧的气体环境。
厌氧瓶顶端的气体有二氧化碳和氮气。
7.1.3.3 自动化血培养系统每间隔一定时间检测需氧和厌氧瓶中微生物的生长信号。
当有阳性信号时进行处理（详见9：血培养阳性结果的处理和报告程序）。
对于已经培养5d的阴性瓶不需要常规盲传或终点接种。
7.2 血培养方法7.2.1手工血培养7.2.1.1传统肉汤培养需氧培养基：脑心浸液肉汤、哥伦比亚肉汤或胰酶消化大豆汤；微需氧或厌氧培养基；硫醇或硫基乙酸盐。
苛养菌培养需添加溶血素、维生素K1。
L型半胱氨酸。
抗凝剂采用0.025~ 0.05%的SPS。
推荐添加树脂中和抗菌药物。
肉汤的体积为18~100ml。
7.2.1.2 双相培养基同时含有琼脂和肉汤的血培养瓶，可用于成人或儿童患者的需氧菌、厌氧菌和分支杆菌培养。
培养瓶需垂直孵育，同时观察肉汤和琼脂表面有无微生物生长。
7.2.1.3溶血离心法溶血离心法是将微生物从溶解的血液中释放出来后，通过离心将其与血液成分分离，因浓度不同而聚集在收集管底层的一种血培养方法。
从溶血离心管底层沉淀物转移至固体培养基进行孵育。
7.2.1.4 孵育时间：手工法推荐35~37℃孵育7d，一些缓慢生长的苛养菌（巴尔通体、李斯特菌属、布氏杆菌属和奴卡氏菌属）和双相真菌可能需要更长的孵育时间。
手工法需要每天观察培养状态，如果无生长迹象后摇动再孵育。
7.2.1.5 检测的频率和转钟：手工法需每天或更频繁的观察微生物肉眼可见的生长，应特别注意孵育48h内的生长迹象。
检测培养时需明亮的荧光或白炽灯，观察浊度、溶血、产气、表面菌落形成和血液颜色的改变，发现有微生物生长迹象进行涂片革兰染色和转钟，根据涂片结果选择培养基类型。
7.2.2 自动化培养原理：通过电子感应器检测微生物生长代谢的CO2 浓度、监测其生长。
孵育时间：35~37℃孵育5d，包括布鲁菌属、嗜血杆菌属、放线菌属、心杆菌属、艾肯菌属、金氏杆菌属和营养变异性链球菌（乏氧菌属和颗粒链球菌属）也可以检测出来。
某些缓慢生长的苛养菌（巴尔通体、李斯特菌属和奴卡菌属）和双相真菌可能要更长的孵育时间。
血培养仪阳性报警后，立即进行涂片革兰染色和转种，根据镜检结果决定转种的培养基类型。
对于已使用抗菌药物治疗的患者，建议采用含树脂等中和物质的培养瓶，可提高细菌的检出率、缩短检出时间。
7.2.3 真菌血液培养7.2.3.1 危险人群真菌血症与创伤性或消化道粘膜溃疡、广谱抗细菌药物的应用、静脉营养、中心静脉插管和免疫抑制剂使用有关。
血培养中最常分离的酵母菌，包括白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和新型隐球菌，其他念珠菌（如克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌和季也蒙念珠菌）、糠秕马拉色菌、红酵母属和毛孢子菌属分离率较低。
马内菲青霉是最常分离到的双相真菌。
荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌、镰刀菌、赛多孢菌、外瓶霉、喙枝孢霉少见，多在AIDS、血液恶性肿瘤、骨髓及器官移植和其它严重的免疫缺陷疾病的患者中分离出。
7.2.3.2 培养条件酵母菌在需氧瓶中易生长。
摇动肉汤培养可提高酵母菌的检出率，对于全自动商品化血培养系统或手工培养系统孵育最初24h的机械摇动都可实现。
多数酵母菌孵育2~5d可检测出，某些酵母菌（如光滑念珠菌和新型隐球菌）可能需要延长孵育时间。
糠秕马拉色菌需要在培养基中添加油脂（如橄榄油）。
如果怀疑双相真菌或丝状真菌感染，孵育时间可能需要延长至2~4周。
7.2.3.3 方法-手工检测法真菌血症检测的手工血培养瓶包括：1）营养肉汤培养瓶，2）双相培养瓶，3）溶血离心培养瓶。
酵母菌应用这三种培养瓶都可检测出，但是双相真菌和丝状真菌只能用双相培养瓶和溶血离心培养瓶可靠检测。
双相培养瓶在酵母菌，双相真菌和丝状真菌的培养中可以应用，其中双相真菌需孵育4周时间。
双相培养瓶在孵育的最初24h内，应轻轻摇动。
双相真菌和丝状真菌在溶血离心培养瓶中的检测时间要早于其他手工血培养系统，离心浓缩的血液沉淀物应接种到多种琼脂培养基，27~30℃和35~37℃同时孵育。
7.2.3.4 方法—自动化检测法建议采用专用真菌血培养瓶，可提高酵母菌的检出率、缩短检出时间。
7.2.4 分枝杆菌血培养7.2.4 .1危险人群分支杆菌菌血症易发生在免疫抑制患者中，如AIDS、白血病、多发性骨髓瘤、接受高剂量类固醇激素或细胞毒性化疗和长期的血管置管的患者。
最高分离的是结核分枝杆菌和鸟分支杆菌复合体。
其他缓慢生长分支杆菌，包括堪萨斯分枝杆菌、猿分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和日内瓦分枝杆菌也已分离到。
快生长分枝杆菌引起的菌血症（如偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌）与长时间的留置中心静脉导管和人工植入物感染相关。
7.2.4.2 培养条件分枝杆菌不是专性苛养菌，如果孵育时间延长，也能够在普通血培养肉汤中生长。
血培养中分枝杆菌的最佳培养方式是在肉汤中添加脂肪酸（如不饱和脂肪酸）、白蛋白和CO2。
分枝杆菌有些种（日内瓦分枝杆菌和嗜血分枝杆菌）生长是需氧添加剂（分枝杆菌生长素、溶血素、血红蛋白或柠檬酸铁胺）。
由于分枝杆菌繁殖缓慢，所有培养应至少孵育4~6周。
7.2.4.3 方法-手工检测法血标本在接种前，必须通过溶血素释放细胞内的菌体。
