石河子大学生命科学学院设计实验设计报告
实验报告题目：检测不同药材的多糖的含量
——内部沸腾法检测两种药食两用真菌的多糖含量所在院系：
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1.实验原理
1.1内部沸腾法提取原理
香菇多糖、猴头菇多糖是极性大分子酸性多糖，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂。将真菌烘干磨碎后用低浓度乙醇解析，使乙醇进入物料内部，再加入一定量的热水使物料内部的乙醇和水达到共沸点，处于沸腾状态，产生对流扩散，加快了扩散的速率。如果物料内部的乙醇和水没有沸腾，提取过程为分子扩散，扩散速率很慢，提取不彻底；如果水温过高，物料内部沸腾过快，则会使对流扩散提前结束导致提取时间过短，提取不彻底[1]。
1.2提纯原理
提取液浓缩处理后加乙醇提高醇浓度，析出多糖沉淀，过滤弃去滤液可除去某些小分子杂质，如单糖。滴加氢氧化十六烷基三甲基胺用于二次沉淀酸性多糖，收集沉淀，弃去滤液则可除去中性糖等杂质。沉淀使用氯仿-正丁醇（4：1）脱蛋白，同时水层加入乙醇再次析出多糖。甲醇、乙醇洗涤去除氯仿、正丁醇，然后干燥去除乙醇和水分得到纯品多糖[2]。
1.3含量测定原理
苯酚-硫酸试剂可与游离多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490nm有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系[2]。则可用分光光度法测出香菇多糖含量并计算出纯度。
2.实验过程（具体、详细，备选两个实验方案）
2.1前期准备
2.1.1原料处理
将已购买的食用菌菌棒提前20天栽培，待出菇后采摘子实体，切片，称量质量80g并50摄氏度烘干。得到干品菇后磨碎再次烘干，称取质量记为a(g),计算干重百分比=a/80×100%（记为n），干粉保存待用。
2.1.2实验试剂配制
提前2天配好试剂：
（1）40ml 氯仿-正丁醇（4：1）：氯仿32ml，正丁醇8ml混合（2）葡萄糖标准溶液：精密称取 105℃干燥至质量恒定的无水葡萄糖 14.8mg，置 100mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。（3）20ml 0.2mol/L氢氧化十六烷基三甲基胺溶液：2.40g氢氧化十六烷基三甲基胺溶液溶于40ml水
（4）5ml 20%乙醇（2份） 1ml乙醇+4ml水
（5）6% 苯酚溶液 6g苯酚（分析重蒸馏试剂），加20ml水溶解，避光低温保存
2.2多糖提取
2.2.1提取
提前一天取5g干粉在刻度试管内浸泡于5ml 20%的乙醇中30分钟，使乙醇充分渗透物料，同时量取体积；倒入烧杯，迅速加入125ml 90℃的水，提取5分钟。过滤弃去滤渣，滤液待用。
2.2.2浓缩
将提取液置于解压浓缩器中浓缩至物料体积的1.2倍，并记录体积，停止浓缩[1]。
2.2.3沉淀
浓缩液置于烧杯中，边搅拌边加入1倍量的乙醇，静止过夜。过滤得沉淀，滤液中再加入3倍乙醇，得沉淀物，合并。
2.2.4二次沉淀
沉淀物置于烧杯中称量，加约70倍的水，搅拌均匀，猛烈搅拌下，滴加0.2mol/L氢氧化十六烷基三甲基胺溶液，调pH至12.8时产生大量沉淀，离心，沉淀用乙醇洗涤，收集沉淀。
2.2.5除蛋白
沉淀用氯仿-正丁醇（4：1）脱蛋白，水层加3倍乙醇沉淀，收集沉淀。
2.2.6洗涤干燥
沉淀依次用甲醇、乙醚洗涤，收集沉淀，用真空干燥器干燥后称量质量记为b（单位g）。
2.3含量测定
采用苯酚 - 硫酸法，精密称取 105℃干燥至质量恒定的无水葡萄糖
14.8mg，置 100mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。分别
取 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，加水补充至 2.0mL，
再加1mL 6% 苯酚溶液，迅速加入浓硫酸5mL，摇匀，静置20min 冷
却至室温，以蒸馏水为空白，在490nm 波长处测定吸光度，绘制标
准曲线[2]。
准确称取香菇粗多糖干品5mg，加少量热水溶解后移入100ml容量瓶，
加水至刻度，摇匀，精密量取0.5-1.0ml（相当于40μg左右多糖），
按相同步骤，测光密度，以标准曲线计算多糖含量，记为c，粗多糖
纯度为c/5(单位：mg/mg）。
每克干菌含多糖量：b×c/25（g）
每克鲜菌含多糖量：n×b×c/25（g）
参考文献
[1] 陈晓光，韦藤幼，彭梦微，童张法. 内部沸腾法提取香菇多糖的工艺优化[J]. 食品科学，2011，32（10）：31-34
[2] 陈来同生化工艺学实验教程[M].科学出版社.176-178
3.分组情况
刘惠东胡雨雨
4.实验药品清单
1.无水乙醇（化学纯） 500ml
2.甲醇（化学纯）50ml
3.氯仿（化学纯）50ml
4.正丁醇（化学纯）20ml
5.乙醚（化学纯）50ml
6.氢氧化十六烷基三甲基胺（化学纯）5g
7.苯酚（分析重蒸馏试剂）15g
（以上提前2天需要）
8.浓硫酸（分析纯.95.5%）150ml
9.标准葡聚糖或葡萄糖（分析纯）100mg
10.蒸馏水
5.玻璃仪器、及其他特殊仪器清单
粉碎机、鼓风干燥箱、离心机、解压浓缩器、温度计（1-100℃）、pH计、恒温水浴锅或电炉、可见光分光光度计、分析天平、100ml烧杯3个、250ml烧杯1个、培养皿3套、铁架台、漏斗2个、离心管6个、滤纸若干、玻璃棒2个、胶头滴管2个、20ml刻度试管15个、100ml容量瓶2个、比色杯若干、移液管1ml 2ml 5ml各4个、250ml 量筒1个、10ml量筒1个、50ml量筒1个、棕色试剂瓶6个、牛皮纸袋4个
