甘草组织培养研究进展_付玉杰

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010852849.7(22)申请日 2020.08.22(71)申请人 延安大学地址 716000 陕西省延安市宝塔区圣地路580号(72)发明人 白朕卿　吴佳文　高新新　田雨　毛仁俊　李丹　(74)专利代理机构 西安研创天下知识产权代理事务所(普通合伙) 61239代理人 郭璐(51)Int.Cl.A01H 4/00(2006.01)(54)发明名称一种甘草组培快繁体系的建立方法(57)摘要本发明公开一种甘草组培快繁体系的建立方法，该方法包括以下步骤：步骤S1：无菌苗诱导；步骤S2：愈伤组织诱导；步骤S3：再生植株诱导。

本发明中甘草不同外植体都可诱导出愈伤组织，且诱导率较高，且在愈伤组织诱导培养基和增殖诱导培养基均为：MS+2.0mg/L NAA+2.0mg/L6‑BA时，其诱导率超过92％。

甘草组培苗快繁体系的建立为甘草生产的规模化、效益化提供了坚实的基础。

权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 112005883 A 2020.12.01C N 112005883A1.一种甘草组培快繁体系的建立方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤S1：无菌苗诱导(1)甘草种子用去离子水浸泡22-26h，将水倒掉，留下种子放到已灭菌的平皿中；(2)倒入8％的次氯酸钠溶液(购于西陇科学股份有限公司)浸泡20min，期间晃动平皿，然后用无菌水冲洗7次，之后将灭过菌烘干后的滤纸铺到灭菌的平皿上，将种子放到滤纸上吸干水分；(3)用灭菌的镊子将种子接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25℃，湿度30％培养28-30天；步骤S2：愈伤组织诱导(1)选择生长状态良好的无菌幼苗作为材料，在超净工作台中切割外植体；(2)将获取的外植体放在愈伤组织诱导培养基中，温度25℃，湿度30％,光照强度为3500Lux ,培养15-20天；步骤S3：再生植株诱导待愈伤组织长成后，将形成的生长状态良好的愈伤组织块转接到适宜的增殖诱导培养基中，温度25℃，湿度30％，光照强度为3500Lux ,培养20-25天，可以看到愈伤组织表面长出了绿色小点，继续培养绿色小点逐渐发育，获得甘草再生植株。

植物黄酮类化合物提取与分离研究进展摘要：结合目前已报道的多种植物黄酮类化合物提取与分离的技术方法，对植物黄酮类化合物提取与分离研究进展进行了综述。

关键词：植物黄酮类化合物；提取；分离中药主要起源于我国，我国对其有着悠久的研究历史。

中药作为中华民族的瑰宝，为中华人民和世界人民的健康做出了巨大的贡献。

尤其是近年来随着西药毒副作用的日益明显，以及对中药学研究的深入，中药学引起了人们越来越多的兴趣和重视。

黄酮类化合物是中药的有效成分之一，物广泛存在于植物的各个部位，尤其是花叶部位，主要存在于芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科、与菊科等。

许多研究已表明黄酮类化合物具有多种生物活性，除利用其抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪氧化酶等方面也有显著效果所以提取分离出具有较高生物活性的黄酮类化合物对医药及食品工业是十分重要的。

关于黄酮类化合物提取及分离、纯化方法的研究报道很多，总结起来主要包括以下几个方面的内容。

1黄酮类化合物的提取方法1.1溶剂提取法包括有机溶剂提取法、水提取法及碱水提取法三种。

1.1.1有机溶剂提取法对苷类和极性较大的苷元如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等,常用某些极性较大的溶剂如甲醇、乙醇或混合溶剂提取,对大多数苷元则用乙醚、氯仿、乙酸乙酷等极性较小的溶剂提取。

虽然有机溶剂对黄酮的提取率高,但缺点是（1）大多有机溶剂都易燃易爆;（2）多数有机溶剂有毒或具有强刺激性,会危害人体和污染环境;(3)一般成本较高。

邵金华等[1]人以桂花叶为原料,采用有机溶剂提取法对桂花叶中黄酮类化合物的提取工艺进行研究,通过单因素试验研究了不同浸提溶剂,提取时间,提取温度,乙醇体积分数,固液比对桂花叶黄酮提取率的影响,采用正交试验优化得出桂花叶中黄酮类化合物提取的最佳工艺条件为:浸提时间2h,提温度85℃,乙醇体积分数75%,固液比1︰20(g/mL),在该条件下桂花叶黄酮提取率达1.926%。

甘草组织培养研究进展摘要：目前,组织细胞培养是中药领域研究的一个热点。

由于人们破坏性地对野生甘草采挖，使野生植物几乎灭绝，对甘草的保护性利用已迫在眉睫。

本综述概述了国内在甘草快速繁殖、植株再生和发状根培养方面的研究进展情况。

其中提出出甘草组织培养的基本培养基为MS，诱导培养基主要附加激素为2 , 4-D 、6-BA 和NAA。

能分化成苗的外植体仅有下胚轴而且分化率极低仅，快速繁殖方法有腋芽丛状茎生根成苗和带叶茎段直接生根成苗两种。

另外还综述了甘草组织细胞培养的优点,并对甘草组织培养技术在中药领域的应用和发展前景进行了探讨。

关键词：甘草；愈伤组织；快速繁殖；研究前景Abstract: At present, the cell and tissue culture of TCM is a hot research field. Because people to destructive wild licorice excavation of, make the wild plant nearly extinct, the use of licorice protective is imminent. This review summarizes the domestic in licorice rapid propagation, plant regeneration and hair root, cultivate the advances in the research of the situation. Among them the tissue culture of licorice put forward the basic culture medium for MS, inductive medium main additional hormone for 2, 4-D, 6-BA and NAA. Can differentiate into the seedlings explant only PeiZhou under and differentiation rate is extremely low, just fast breeding methods have axillary plexiform stem root seedlings and take YeJing period to directly take root seedlings into two. In addition also reviewed the advantages of licorice cell and tissue culture, and liquorice tissue culture technology in the application and development of traditional Chinese medicine field are discussed.Keywords: Licorice; Callus; Multiply rapidly; Research prospects引言甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）属于豆科（Leguminosae）甘草属（Gly-cyrrhiza）植物甘草( Gly-cyrrhiza uralensis Fischer) 、光果甘草( Glycyrrhizaglabral.)和胀果甘草( Glycyrrhizainflata) 的干燥根和根茎[1]。

甘草有效成‎分的提取分‎离实验方案‎实验目的：通过对甘草‎中甘草黄酮‎、甘草酸和甘‎草多糖的提‎取分离，进一步理解‎他们的理化‎性质，并且初步掌‎握提取分离‎的方法。

实验原理：黄酮类化合‎物则泛指两‎个苯环（A环与B环‎）通过中央三‎碳相互联接‎而成的一系‎列化合物。

根据中央三‎碳的氧化程度、是否成环、B 环的联接‎位点等特点‎，可将该类化‎合物分为多‎种结构类型。

代表化合物‎有甘草黄酮‎、甘草素、异甘草素、甘草甙、异甘草甙、甘草查尔酮‎等。

甘草中已经‎发现的黄酮‎类化合物有‎一百多种，本实验只对‎其进行粗提‎，并且测定其‎总含量。

甘草酸是一‎类三萜类皂‎苷，主要以甘草‎酸钾、钙盐的形式‎存在，是甘草次酸‎的二葡萄糖‎醛酸甙，含量在4-20%之间；甘草酸水解‎脱去糖酸链‎变形成了甘‎草次酸。

超临界CO‎2萃取甘草‎总黄酮的萃‎取率是1. 35%，含量32. 45%，是索氏提取‎法提取甘草‎总黄酮的提‎取率的2.2倍，索氏提取溶‎剂用量是超‎临界CO2‎萃取的6倍‎。

本实验采取‎超临界CO‎2萃取法提‎取甘草黄酮‎。

【1】大孔树脂适‎于物质水溶‎液的分离纯‎化，超临界C0‎2萃取提取‎的甘草总黄‎酮中乙醇含‎量过高，即使对萃取‎液进行浓缩‎处理，其中乙醇的‎含量仍然很‎高，所以大孔树‎脂的吸附、解吸附的效‎果不好。

萃取液浓缩‎近干加入水‎后，所要分离的‎物质析出变‎混浊，也不适合用‎大孔树脂进‎行分离纯化‎。

与大孔树脂‎层析比较，硅胶柱层析‎可以更有效‎的分离纯化‎甘草黄酮。

使用硅胶柱‎层析可以有‎效地使甘草‎黄酮类物质‎的含量达到‎55%以上，收率1. 12%，符合国家中‎药二类新药‎的原料要求‎。

【1】综合考虑，本实验选择‎硅胶柱层析‎对甘草黄酮‎进行分离纯‎化。

甘草酸和甘‎草次酸的极‎性比黄酮类‎物质的极性‎大，更易溶于极‎性大的低浓‎度乙醇中，采用85%乙醇作为夹‎带剂，使得在二氧‎化碳超临界‎萃取甘草黄‎酮类物质过‎程中，大部分甘草‎酸和甘草多‎糖仍然留在‎残渣中。

甘草愈伤组织培养及其代谢产物甘草酸的研究
甘草愈伤组织培养及其代谢产物甘草酸的研究
以MS培养基为基础,分别以甘草根、胚轴、子叶为外植体进行培养,考察光照、2,4-D质量浓度、不同激素组合、pH等理化因子对愈伤组织生长的影响,对代谢产物甘草酸进行了HPLC的定量测定.实验表明其中以根的愈伤组织中甘草酸含量最高,为70.2 mg/g;黑暗条件比光照条件更有利于甘草酸合成;以激素组合为2,4-D4.0 mg/L+KT0.5 mg/L,pH为5.4时甘草酸含量最高,在此条件下悬浮培养根培养物中甘草酸质量分数为81.6mg/g,比生药增多51.08%.
作者：杨会琴李敬戴翠萍崔娜 YANG Hui-qin LI Jing DAI Cui-ping CUI Na 作者单位：河北经贸大学,生物科学与工程学院,河北,石家庄,050061 刊名：河北师范大学学报（自然科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF HEBEI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2006 30(3) 分类号：Q813 关键词：甘草愈伤组织培养甘草酸 HPLC。

甘草研究开发与利用现状甘草是一种常见的中药材，具有悠久的药用历史和丰富的药用价值。

它来源于多种甘草属植物的根部和茎部，主要分布于亚洲、欧洲和北美洲等地区。

甘草具有清热解毒、润肺止咳、调和药性等多种功效，被广泛用于治疗各种呼吸系统疾病、消化系统疾病和神经系统疾病等。

随着人们对甘草的认识和需求的不断提高，甘草的研究开发与利用也得到了越来越多的。

甘草的化学成分复杂多样，主要包括黄酮类、生物碱类、氨基酸类和有机酸类等成分。

近年来，随着分离纯化技术的发展，越来越多的甘草化学成分被分离鉴定。

同时，药理研究表明，甘草具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌抗病毒等多种药理作用。

这些发现为甘草的新药开发和保健品开发提供了广阔的前景。

目前，甘草的研究开发已经进入到了一个新的阶段。

研究人员正在不断探索甘草的药理作用和作用机制，以便更好地发掘其药用价值。

同时，越来越多的企业开始甘草产业的发展，通过技术创新和产业升级，提高甘草的产量和质量，推动甘草相关药品和保健品的发展。

虽然甘草的研究开发和利用已经取得了很大的进展，但是仍然存在一些问题。

比如，甘草的种植和管理缺乏规范化，导致产量和质量不稳定；甘草的深加工技术不够成熟，无法充分发挥其药用价值；甘草的成分复杂，质量控制难度较大，需要进一步完善相关标准体系。

未来，甘草的研究开发和利用需要从以下几个方面进行改进和发展。

需要加强甘草种植和管理的规范化，提高产量和质量；需要加大甘草深加工技术的研究力度，开发高附加值的产品；需要完善甘草质量控制体系，保证药品和保健品的安全有效性。

甘草作为一种重要的中药材和保健品原料，其研究开发与利用具有重要意义。

未来需要加强技术创新和产业升级，提高甘草的产量和质量，推动甘草产业的可持续发展，以满足人们日益增长的健康需求。

当我们谈论美食和手工皂时，我们通常会想到两种完全不同的领域。

美食是指各种美味的食物，而手工皂则是一种清洁用品。

然而，随着人们对天然、环保和舒适生活的追求，美食柔肤手工皂应运而生。

［综述］甘草有效成分的提取纯化方法研究进展刘育辰1，王文全1*，郭洪祝2（1.北京中医药大学中药学院，北京100102；2.北京市药品检验所，北京100035）收稿日期：2010-02-14作者简介：刘育辰（1982－），女，在读博士，研究方向：道地药材形成机制研究。

E-mail ：lyc8564732@ *通讯作者：王文全。

Tel ：（010）84738623E-mail ：wwq57@关键词：甘草；甘草酸；黄酮；甘草多糖；提取；纯化摘要：作者通过查阅大量文献，对甘草中有效成分的提取方法和纯化方法进行了详细的总结，为甘草化学成分快速、有效的提取、纯化提供方法参考和依据。

中图分类号：R284.2文献标识码：B文章编号：1001-1528（2010）11-1953-05甘草为豆科（Zeguminosae ）植物甘草（Glycyrrhiza uralen-sis Fisch ）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）和光果甘草（Glycyrrhia glabra L.）的根及根茎，始载于《神农本草经》，列为上品，传统中医药认为它具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和药性的功效［1］。

甘草中的化学成分比较复杂，主要有三萜皂苷类化合物（甘草酸、甘草次酸）、黄酮类化合物（甘草苷、异甘草苷）及甘草多糖等。

现代药理学实验表明黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌抗病毒等作用；甘草酸具有保肝和治肝、治疗肾病和心脏疾病、抗病毒、抗菌等作用；甘草多糖具有抗病毒、抗肿瘤、提高免疫功能［2］。

随着对甘草化学成分研究的不断深入，如何将有限的甘草资源分离纯化成更多、更纯的甘草有效成分具有广泛的经济效益和社会效益，受到越来越多国内外学者的关注，甘草有效成分的提取、纯化工艺已成为近年来的一个研究热点。

目前甘草有效成分提取、纯化方法很多，本文将有关其提取、纯化甘草有效成分的方法做一概述，为进一步研究甘草有效成分的提取、纯化工艺提供参考。

甘草黄酮提取及其抗氧化能力测定方法研究进展韩雅慧;陶宁萍【摘要】我国甘草资源丰富,具有较高的药用价值.主要对甘草黄酮的提取方法和抗氧化能力的测定方法进行了总结,分析比较了各自的优缺点,以期为进一步研究提供参考.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2010(038)011【总页数】5页(P89-93)【关键词】甘草黄酮;提取方法;抗氧化能力【作者】韩雅慧;陶宁萍【作者单位】上海海洋大学食品学院,上海,201306;上海海洋大学食品学院,上海,201306【正文语种】中文【中图分类】TQ464甘草又名甜草、蜜草、美草等，其药用部位为豆科（Leguminosae）植物甘草属（Glycyrrhiza）甘草（Licorice）的根及根状茎[1]。

据《中华人民共和国药典》2000年版记载，甘草有3个品种，即乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensi Fisch）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）和光果甘草（Glycyrrhiza glabra L）[2]。

甘草有效成分包括黄酮类、三萜类、多糖等。

迄今为止，已从甘草中分离出150多个黄酮类化合物，主要包括黄酮类、黄酮醇类、查尔酮类、双氢黄酮类、双氢查尔酮类等[3]。

甘草黄酮具有明显的抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、保肝等药理作用，尤其在发现它具有抗艾滋病病毒[4]作用后，甘草黄酮类化合物的研究引起了人们的广泛关注和重视。

本文综述了甘草黄酮的提取方法及其抗氧化能力测定方法的研究现状，以期为甘草黄酮类成分的进一步开发利用提供参考。

1 甘草黄酮的提取方法及比较1.1 甘草黄酮的提取方法甘草黄酮的提取方法很多，基本原理都是通过物理、化学方法破坏甘草的细胞壁，再根据甘草黄酮的极性及溶解性能的差异进行提取分离。

1.1.1 溶剂萃取法它包括无机溶剂萃取法和有机溶剂萃取法。

其主要原理是利用甘草黄酮能溶于碱水或甲醇等有机溶剂的特性来提取甘草黄酮。

甘草抗氧化作用的研究概况摘要：目的介绍近些年来甘草在抗氧化作用方面的研究进展。

方法查阅国内外近年来有关文献并结合相关的研究成果进行综述。

结果与结论甘草具有很好的抗氧化作用，有着广阔的应用前景。

关键词：甘草；抗氧化；作用Abstract: to review recent years progress of licorice in antioxidant effect.Methods: the literatures in recent years in combination with related research results at home and abroad is expounded. Result and conclusion: licorice has the very good antioxidant effect, has a broad application prospect.Key Words:Licorice root ； antioxidant ； effect甘草为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza Linn.)乌拉尔甘草(G. ualensis Fisch.)、胀果甘草(G. inflate Bat.)和光果甘草(G. glabra L.)的干燥根和根茎[1]。

甘草具有抗炎、抗溃疡、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等诸多方面的生理活性[2]。

其中，甘草有效成分的抗氧化活性越来越受到人们的重视，已应用到医药、保健品、食品以及化妆品等各个领域，现对甘草的抗氧化研究进展综述如下：1 主要成分1.1 甘草根及根茎含三萜类化合物甘草酸(Glycyrrhizic acid)、甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)、甘草内酯(Glabrolide)、乌拉内酯(Uralsaponin)、乌热酸(Uralnic acid)、乌拉尔甘草皂苷甲(Uralsaponin A)、乌拉尔甘草皂苷乙(Uralsaponin B) [3]、甘草皂苷(A3，D3，B2，C2，E2)等；1.2 黄酮化合物甘草苷(Liquiritin)、甘草素(Liquiritigenin)[4]、异甘草苷(Isoliquiritin)、异甘草素(Isoliquiritigenin)、甘草利酮(Licoricone)、芒柄(Formononetin)[5]、芒柄花苷(Ononin) 、夏佛托苷(schaftoside)、佛来心苷(violanthin)甘草查耳酮(Licochalcone)等。

甘草的化学成分研究进展甘草中的一些主要成分包括甘草酸、甘草甜素、异甘草素、葛根素、氢化甘草素等。

甘草酸是甘草中含量最多的一种成分，具有明显的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等生物活性。

甘草甜素则是甘草的甜味来源，具有良好的甜味效应，被广泛应用于食品工业中。

异甘草素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用，被认为是甘草中的一种重要活性成分。

葛根素具有抗氧化、抗菌、抗炎等生物活性，对于促进人体健康具有重要作用。

氢化甘草素具有抗炎、抗肿瘤等生物活性，具有广泛的应用前景。

近年来，针对甘草的化学成分研究取得了新的进展。

研究人员利用现代科学技术手段，成功地从甘草中分离提取出了一系列新的化学成分，并对其进行了深入的研究。

一些新的甘草酸类化合物和甘草甜素类化合物被成功发现，并具有良好的生物活性。

这些新的化学成分为我们深化对甘草的认识和开发新的药物或保健品具有重要意义。

现代科学技术的进步也为甘草的化学成分研究提供了更多的手段和方法。

液相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱技术、核磁共振技术等现代分析技术的应用，为甘草中化学成分的鉴定和分析提供了更多的手段。

这些先进的技术方法为深入研究甘草的化学成分提供了有力支撑，为我们更全面地了解甘草的化学成分和药效提供了更多的可能性。

近年来关于甘草化学成分的研究也引起了国际上的广泛关注。

越来越多的国际科研团队加入到甘草的化学成分研究中来，他们纷纷利用自己国家的优势技术手段，对甘草中的化学成分进行了深入研究。

这些国际研究合作不仅拓宽了对甘草化学成分的研究思路，还为甘草的国际化进程提供了有力支持。

相信通过国际合作，我们可以更好地挖掘甘草的化学成分和药用价值，让更多人受益于甘草的药用作用。