激光共聚焦显微镜的成像原理
什么是荧光？
荧光是当以某一波长的光线照射一个物质（原子/分子）的时候，该物质（原子/分子）吸收了光线能量的一部分并且发射出另一种低能量的光线。图中示意的光线里蓝色（较高能量光线）为入射光线，绿色（较低能量光线）为反射光线。
什么是分光镜？
分光镜是可以把不同波长的光线区分开来的光学装置。
分光镜可以起到使特定的光线可以通过，特定光线反射的作用。
荧光显微镜是如何工作的？
我们假定入射光线是紫色的（较高能量光线），反射光线是红色的（较低能量光线）。显微镜系统使用了一种特殊的分光镜， (更恰当地说一个“区分两种颜色的镜片”)。这个镜片反射低于特定波长的光线，并且可以通过高于特定波长的光线。因此你的眼睛只能看到这些由荧光染料反射出来的光线（红色光线），而不是看到入射的紫色光线。紫色和红色的光栅位于分光镜后，作为一种特殊的过滤装置，来保证其他颜色的光线传到了不正确的方向。
关于共聚焦显微镜
想象下在显微镜中有一些镜片组，由镜片组一个焦点发出的光线延光路发送到另一个焦点。这表现为图中的蓝色光线。红色光线表示式样上的其他点发出的光线，这些点并不在镜片组的焦点上，因此这些点就不能通过镜片组在另一边的焦点上成像。 （这里的需要注意的是，红色的光线和蓝色的光线是为了区分式样上的不同点，并不是为了表示他们的波长不同。）这样，蓝色光和红色光成像的点就不相同。这里我们只希望得到位于镜片组焦点上发出光线成的像。如果我们在镜片组的另一边放置一个带有针孔的隔挡，这个孔正好在蓝色点成像的位置，那么所有从蓝色点发出的光线都可以通过这个针孔。并且，由红色点发出的大部分光线是不能通过这个针孔的。 这就解决了荧光显微镜的一个缺陷。通常来说式样都是完全被照亮的，因此式样上的每一个点都会同时发出荧光。当然，成像最清晰，也就是亮度最高的点是在物镜焦点上的点，但是其他点的光一样会对成像结果产生影响。增加一个针孔就解决了这个问题，因为式样位于物镜焦点上的点会在针孔位置成像，这样对点是共轭的。针孔的位置就是镜片组的位置，这就是共聚焦针孔。
共聚焦荧光显微镜技术参数1
技术规格（配置）
1. 激光照射部分
(1) 系统激光器应覆盖可见光，三个激光器单独分立：红光HeNe激光器 633nm；绿光HeNe激光器 543nm；多线蓝光Ar激光器 458/488/514nm。
(2) 具有独立电动机械光闸，以降低声光调制器的漏光现象。
(3) 激光器强度由各独立AOM控制，调节由计算机的激光共聚焦扫描软件系统控制，与整个系统偶合程度高，电噪声小，安全。
2. 扫描检测部分
(1) 激光扫描系统通过照相端口与显微镜相连，不影响传统荧光观察效果，并且使扫描系统在正置与倒置显微镜通用。与所接显微镜一体化设计，一体化像差及色差校正，以保证高质量，高分辨率成像。软件对硬件应有效控制， 使系统有优异的稳定性及可维护性。光纤藕合表面应有专用防反射涂层，以提高激光传输效率
(2) 检测器：
① 传统荧光检测器：三个荧光扫描检测器+一个透射光DIC（明场/相差/微分干涉）扫描检测器
② 专用光谱检测器：32个通道
(3) 光谱/荧光检测系统：
① 光谱检测通道与传统荧光检测通道分别工作，不相互影响
② 采用多阳极PMT灵敏度矫正技术，可以对每个光谱检测通道的灵敏度误差以及波长透射属性进行矫正，使测量误差和偏差降至最低
③ 光谱检测通道可自由选择光谱的波长范围、光谱分辨率及当前工作的通道数，通过一次扫描即可获取完整的最大32个通道的光谱图像，能精确地对光谱进行分析。可以任意指定软件只显示选定的波段，相当于拥有了一个可编程的荧光阻挡滤光片
④ 光谱检测器上具有可移动的激光遮光片，可以屏蔽任意波长的激光，这样即增加了激光的应用种类，又提高了PMT的利用率
⑤ 光谱探测器可同时拍摄透射和共聚焦图像，为定位荧光标记，提供手段
⑥ 三个传统荧光通道和一个透射光DIC通道可同时进行快速扫描
⑦ 多个传统荧光通道的图像可即时叠加、荧光图像与透射光DIC图像即时叠加
⑧ 使用者可自行更换传统荧光检测系统中所有的滤色镜，这样可以在使用新的探针和染料不会存在兼容性问题
1 模块九 激光共聚焦技术
1. 实验目的
让学生了解激光共聚焦显微镜硬件组成，掌握激光共聚焦显微镜常用的基本操作及注意事项，能够熟练、准确地设计光路，重点掌握激光共聚焦显微镜测定细胞荧光信号动态变化的方法以及钙指示剂（fluo-3/AM）标记Ca2＋的基本原理与方法，了解激光共聚焦显微镜在生物学上的应用。
2. 实验原理
激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
激光扫描共聚焦显微镜基本结构
（1）扫描模块
扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。
荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象。
（2）荧光显微镜系统
激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。
（3）常用激光器
激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型：
多谱线Ar离子激光器（氩离子激光器）：发射波长为458 nm、477 nm、488 nm、514 nm的蓝绿光；He-Ne激光器（氦氖激光器）：发射波长为543 nm的绿光和633 nm的红光；UV激光器（紫外激光器）：发射波长为351 nm、364 nm的紫外光。
（4）辅助设备
非损伤性导入法：在正常的生理条件下加入Ca2+荧光探针与植物细胞共同孵育, 使探针渗
入到细胞内的方法。在培养液中加人荧光探针和增强膜透性的药物, 如去垢剂digitonin(毛
地黄甘)、表面活性剂Pluronic F-127等, 药物使细胞膜通透性增强, 利于荧光探针的导入【1】。周平等发现：在PH5.6条件下，绿豆、花生、水稻、烟草等细胞原生质体用5~10umol/L
Indo-1-K+或Fura-2-AM共同孵育1.5h,荧光探针可导入部分原生质体【2】。
样品的制备1：
样品制备是上机检测前的关键步骤。样品需经荧光探剂标记( 单标、双标、三标) 。标本可
以是固定的或活的组织, 也可以是固定的或活的贴壁培养, 细胞应培养在Confocal 专用小 培养皿或盖玻片上, 悬浮细胞, 甩片或滴片后, 用盖玻片封片。样品的最大厚度约1~ 2 mm,
使用的盖玻片厚度应小于0117mm, 载玻片厚度应在018~ 112 mm 之间, 而且表面光洁, 厚度
均匀, 没有明显的干扰荧光。固定样品常用封片剂进行封片,常用PH815- 9 的PBS 配制的甘
油封片。
样品准备2： 样品的最大厚度大约1~2mm(10×/ 0.4 物镜), 它取决于物镜的数值孔径(NA) 、物镜的工作
距离、激光的穿透力以及样品的透明度。一般要求是单层贴壁细胞, 可以是经荧光探针标记
(单标、双标、三标)固定的或活的组织; 固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal 专用小培养
皿, 盖玻片); 用盖玻片封片的经甩片或滴片后的悬浮细胞。对于非贴壁细胞的粘贴, 一
般常用的粘贴剂有多聚赖氨酸﹑ 伴刀豆球蛋白﹑cell- tak﹑vectabond﹑琼脂凝胶等。选择粘贴剂的标准是: 不影响实验目的, 对标本无损害[1]。
激光扫描共聚焦显微镜的样品制备技术3：
3.1 取材
组织标本：包括活检标本、手术切除标本、动物模型标本及尸检解剖标本等， 应在标本离
