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一、实验目的1. 了解核酸的基本概念和生物学意义。
2. 掌握核酸提取、纯化和鉴定方法。
3. 熟悉紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作。
4. 通过实验验证核酸的特性和功能。
二、实验原理核酸是生物细胞中携带遗传信息的生物大分子，主要由核苷酸组成。
根据碱基排列顺序的不同，核酸分为DNA和RNA两种。
DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于细胞质中。
1. 核酸提取：通过破碎细胞，使核酸从细胞内释放出来。
2. 核酸纯化：通过层析等方法，去除杂质，获得纯净的核酸。
3. 核酸鉴定：通过电泳、紫外分光光度法等方法，对核酸进行定性和定量分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鲜鸡肝组织- 氯化钠- 氯化镁- 磷酸盐缓冲液- 乙醇- 异丙醇- 0.1% 溴酚蓝- 1% 琼脂糖- 核酸提取试剂盒- 紫外分光光度计- 凝胶成像系统- 离心机2. 实验试剂：- Tris-HCl缓冲液- EDTA- 氢氧化钠- 氯化钠- 乙醇- 异丙醇- 0.1% 溴酚蓝- 1% 琼脂糖四、实验步骤1. 核酸提取- 将鲜鸡肝组织剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液和EDTA，用玻璃棒搅拌。
- 加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），剧烈振荡。
- 12,000 rpm离心10分钟，取上清液。
- 加入等体积的95%乙醇，沉淀核酸。
- 12,000 rpm离心5分钟，弃去上清液。
- 加入适量70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm离心5分钟。
- 弃去上清液，用无菌去离子水溶解沉淀。
2. 核酸纯化- 将核酸溶液加入琼脂糖凝胶电泳槽，进行琼脂糖凝胶电泳。
- 用凝胶成像系统观察电泳结果，将目的条带切割下来。
- 将切割下来的核酸条带用胶回收试剂盒纯化。
3. 核酸鉴定- 将纯化的核酸溶液用紫外分光光度计测定其含量。
- 将核酸溶液进行电泳，观察条带，确定核酸类型。
五、实验结果与分析1. 核酸提取：通过实验，成功提取出鸡肝组织中的核酸。
2. 核酸纯化：通过琼脂糖凝胶电泳，成功纯化出核酸。
实验九动物组织和细胞中核酸的提取和测定第一部分动物组织和细胞中DNA和RNA的提取【实验目的】学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法【实验原理】1.从动物组织和细胞中提取DNADNA存在于细胞核中。
提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。
本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）溶解细胞膜并使蛋白质变性。
核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。
这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。
2.从动物组织和细胞中提取RNARNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。
为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。
高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种RNA 酶失活，使释放出的RNA不被降解。
细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。
【实验材料】1.实验器材研钵和研棒，匀浆机，橡胶刮棒，低温冷冻离心机，恒温水浴，宽口移液管，锤子，塑料袋，涡旋。
2.实验试剂(1)裂解缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(PH8.0)，0.1mol/L EDTA(PH8.0)，0.5%(m/V)SDS，20µg/mg无Dnase 的胰RNase，裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。
RNase在用前适量加入。
(2)溶液D(变性液)：4mol/L硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠.2H20，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，0.1mol/L β-巯基乙醇，将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V)月桂基肌酸钠溶于293ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。
核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于～。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （）为6 600，含磷量为%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥；DNA 的A 260/ A 280≥。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于和时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 DNA/RNA 样液，然后向甲管加入蒸馏水，向乙管加入过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。
以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A 260值。
核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （pH7.0）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.022～0.024。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （pH7.0）为6 600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于0.020。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥2.0；DNA 的A 260/ A 280≥1.8。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 1.0mL DNA/RNA 样液，然后向甲管加入1.0mL 蒸馏水，向乙管加入1.0ml 过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液0.5mL 转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。
一、实验目的1. 掌握核酸定量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法在核酸含量测定中的应用。
3. 学会使用紫外分光光度计进行核酸含量测定。
二、实验原理核酸是生物细胞中重要的生物大分子，由核苷酸单体聚合而成。
核酸的定量测定在生物学、医学等领域具有广泛的应用。
本实验采用紫外分光光度法测定核酸含量，其原理如下：1. 核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，能够吸收紫外光。
RNA和DNA的紫外吸收高峰在260 nm波长处。
2. 在一定浓度范围内，核酸的紫外吸收值与其浓度成正比。
3. 通过测定核酸溶液在260 nm波长处的吸光度，可以计算出核酸的浓度。
三、实验器材1. 紫外分光光度计2. 10 mm光程比色皿3. 移液器4. 移液管5. 超纯水6. 核酸标准品7. 核酸样品8. 容量瓶9. 试剂：NaOH、HCl、NaCl、EDTA等四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）准确称取一定量的核酸标准品，用超纯水溶解并定容至一定体积，配制成一系列不同浓度的核酸标准溶液。
（2）取核酸标准溶液适量，加入比色皿中，用紫外分光光度计在260 nm波长处测定吸光度。
（3）以核酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定（1）准确称取一定量的核酸样品，用超纯水溶解并定容至一定体积。
（2）取核酸样品适量，加入比色皿中，用紫外分光光度计在260 nm波长处测定吸光度。
（3）根据标准曲线，计算核酸样品的浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制根据实验数据绘制标准曲线，如图所示。
从图中可以看出，核酸浓度与吸光度呈线性关系，相关系数R²为0.999。
2. 样品测定根据标准曲线，计算核酸样品的浓度为X mg/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意避免样品和试剂污染，确保实验结果的准确性。
2. 在绘制标准曲线时，应选择合适的浓度范围，以保证线性关系良好。
3. 实验过程中，应注意比色皿的清洗和干燥，避免吸光度值偏低或偏高。
核酸的定量测定——定磷法[原理]磷的测定方法很多，Fiske-Subbarow定磷法是一经典的但至今仍被经常采用的方法，它具有灵敏、简便的特点。
各种含磷有机物经硫酸或过氯酸水解，使有机磷消化成为无机磷。
无机磷在酸性条件下，与钼酸盐（常用钼酸铵或钼酸钠）反应生成磷钼酸盐络合物。
用还原剂处理，磷钼酸盐络合物被还原生成钼蓝，在660nm处有最大光吸收峰。
在一定浓度范围内，颜色的深浅与磷含量成正比关系。
因此可应用分光光度法进行磷的定量测定。
化学反应式：(NH4)2MoO4+ H2SO4→ H2MoO4+ (NH4)2SO4H 3PO4+ 12H2MoO4→ H3P (Mo3O10)4+ 12H2O还原剂H 3P (Mo3O10)4→ Mo2O3MoO3核酸是一类含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般纯的RNA及其核苷酸含磷质量分数为9.0%；DNA及其核苷酸含磷质量分数为9.2%，即每 100g核酸含有9.0～9.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11倍左右，故测得磷的量，即可求得核酸量。
这就是定磷法的理论依据，磷的定量测定是测定核酸含量常用手段之一。
生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化直接测得的含磷量。
将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量。
[方法和步骤]1、磷标准曲线的绘制取试管7支，0～6依次编号。
按下表加入各试剂。
注意每加好一种试剂后应立即摇匀。
各反应液加毕后，于30℃保温20min，置分光光度计中在波长660nm比色，测光吸收值。
以磷含量为横坐标，光吸收值为纵坐标作图，即得定磷标准曲线。
2、总磷量的测定取30毫升凯氏烧瓶2只，Ⅰ、Ⅱ依次编号，Ⅰ号瓶为空白对照，用刻度吸管准确吸取核糖核酸样液1.0mL，置于Ⅱ号凯氏烧瓶内，Ⅰ号瓶加入蒸馏水 1.0mL，不加样液，两瓶分别加入6mol/L硫酸1.0mL置消化架用小火加热消化，待溶液呈褐色，稍加冷却，加入2 mol/L硝酸2滴，再继续加热，直至逸出白色烟雾，溶液无色透明，表示消化完成时为止。
12⽣物化学实验--核酸的定量分析核酸的定量分析【⽬的】1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的⽅法。
2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】核酸分⼦中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之⼀即可推算出核酸含量。
1 ．定糖法通过测定 DNA 或 RNA 分⼦中戊糖的含量，从⽽计算出 DNA 或 RNA 含量的⽅法。
RNA 在强酸环境中加热可⽔解产⽣核糖。
核糖在浓酸作⽤下脱⽔形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - ⼆羟基甲苯（地⾐酚）缩合成绿⾊化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最⼤吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进⾏⽐⾊即可测定出 RNA 的含量。
DNA 在强酸环境中加热⽔解⽣成的脱氧核糖与浓酸共热脱⽔⽣成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与⼆苯胺反应⽣成蓝⾊化合物（反应式见实验 11 ），其最⼤吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进⾏⽐⾊即可测定出DNA 的含量。
2 ．定磷法通过测定核酸中磷的含量，从⽽计算出 DNA 或 RNA 含量的⽅法。
核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。
⽤强酸使核酸分⼦中的有机磷消化成⽆机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作⽤⽣成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏⾎酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，⽴即被还原为蓝⾊的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最⼤吸收峰波长为660nm 。
当⽆机磷浓度在 2.5~25µg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正⽐。
本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中⽆机磷的含量，将测得的总磷量减去原⽆机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进⽽计算核酸的含量。
3 ．紫外吸收法核酸分⼦中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最⼤吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。
