基于复合型微流控芯片的紫外检测毛细管电泳系统

V o l.25高等学校化学学报　N o.7　2004年7月 CH E M I CAL JOU RNAL O F CH I N ESE UN I V ER S IT IES 1231～1234　基于复合型微流控芯片的紫外检测毛细管电泳系统曹小丹,方　群,方肇伦(浙江大学化学系微分析系统研究所,杭州310028)摘要　提出了一种基于芯片2毛细管复合装置的紫外检测2微流控芯片毛细管电泳分析系统.采用小死体积的耦合技术实现了石英毛细管与“十”字通道型微流控玻璃芯片的耦合.本系统的紫外检测灵敏度与商品化毛细管电泳仪相当.采用夹流进样方式,达到较高的进样重现性,2mmo l L苯甲酸的峰高相对标准偏差(R SD)为1.5%(n=11).可用于复方磺胺甲　唑片剂的两种有效成分的快速分离.关键词　毛细管2芯片耦合系统;微流控芯片毛细管电泳;紫外检测中图分类号　O657 文献标识码　A 文章编号　025120790(2004)0721231204微流控分析技术[1]自20世纪90年代初兴起以来,就以微型、快速、高效和高通量等特点而成为目前分析化学领域的研究热点之一.在基于微流控芯片的毛细管电泳系统中,目前已报道的检测方法有激光诱导荧光、电化学、质谱、紫外吸收光度及化学发光分析法等[2].与其它检测方法相比,紫外吸收光度法[3]是目前最通用的检测方法.L iang等[4]采用在玻璃芯片上加工“U”型池及池两侧的光纤通道实现了可见吸收检测.在N akan ish i等[5]研制的紫外检测系统中采用了在2个石英芯片之间沉积Si O2 Si层的方法加工入射和出射光的狭缝,消除了杂散光的影响.Petersen等[6]在单晶硅芯片上利用生长Si O2以加工入射和出射光传输光纤.Ceri o tti等[7]利用高分子基质芯片进行紫外检测,但该法难以实现短波长下的紫外检测.以上各种方法中的芯片多数采用石英基质,芯片成本高,加工难度较大.此外,紫外检测器的光路系统对光路的对准及杂散光的消除均有很高要求,大多需要复杂的微加工技术和设备,加工难度大,难以广泛普及.本文提出了一种实现芯片毛细管电泳2紫外吸收检测的新思路,将石英毛细管与玻璃微流控芯片进行耦合,实现微小体积试样进样的高度重现性,利用石英毛细管完成电泳分离和紫外吸收检测操作.此类复合毛细管芯片系统曾被应用于质谱[8]和荧光检测[9]的微芯片分析系统中,分别起到电喷雾接口和增加分离通道长度的作用,但尚未见到用于实现芯片上的紫外吸收光度检测的报道.该系统具有光路结构简单、易加工、成本低廉、易推广及实用性强等优点.1　实验部分1.1　仪器与试剂紫外2可见检测器(Jasco公司);H PE2100毛细管电泳仪毛细管卡盒(B i o2R ad公司);Capel103R毛细管电泳仪(L um ex公司);自制4触点高压电源(最高电压2000V);XTB21型体视镜(南京江南光电股份有限公司,放大倍数160倍),配以DM T2520彩色CCD摄像机(D edicated M icro s公司,分辨率为350线);XW TD2104台式记录仪(上海大华仪表厂);0.35mm直柄麻花钻头(上海工具厂).SG2506型均胶铬板及玻璃片(长沙韶光微电子总公司);石英毛细管(河北永年光导纤维厂,内径75Λm,外径375Λm);环氧树脂胶(浙江黄岩光华胶粘剂厂).苯甲酸、硼砂、荧光素钠和氢氧化钠等均为分析纯,实验用水为去离子水.复方磺胺甲　唑样品由10片复方磺胺甲　唑片剂(浙江得恩德制药有限公司)经研磨成粉末后,取500 m g放于10mL乙醇中超声10m in,用去离子水定容至100mL,静置后取上层清液,微孔滤膜过滤作为贮收稿日期:2003208212.基金项目:国家自然科学基金重大项目(批准号:20299030)、国家“八六三”计划项目(批准号:2002AA2Z2042)和教育部科学技术研究重点项目(批准号:01093)资助.联系人简介:方　群(1966年出生),男,博士,教授,从事微流控分析芯片的研究.E2m ail:fangqun@m 备液.测定时取20mL 贮备液,以5mm o l L 硼砂缓冲液(pH =9.2)稀释定容至250mL .1.2　实验操作1.2.1　毛细管耦合芯片的加工和耦合　芯片加工:芯片为玻璃基质,采用标准的紫外光刻、湿法刻蚀和高温封接技术,具体操作参见文献[10].芯片通道构型为“十”字通道[图1(A )和图2],玻璃芯片通道宽75Λm ,深25Λm ,其中ad ,bd 和cd 通道长度均为6mm ,de 方向的通道长度为2mm (图2).在a ,b 和c 端钻孔(直径1.5mm ),在其上方加贮液池.毛细管2芯片的耦合:在体视镜(放大倍数160)下,先用0.35mm 钻头的锥形头沿ed 通道方向钻一个1.5mm 的深孔,然后用钻头另一端的平头磨平,孔前端距离d 点0.5mm .将内径75Λm 、外径375Λm 的6.5c m 长石英毛细管前端磨平,并除去聚酰亚胺涂层后插入孔中.用环氧树脂胶填充孔与石英毛细管之间的空隙.具体方法是:以2∶1体积比调和环氧树脂胶及固化剂,于室温(20℃)下放置20m in 后,加于芯片孔外的毛细管周围,用电吹风加热,环氧树脂胶缓慢流入孔和毛细管之间的缝隙,当流到接近耦合处时,将芯片放入冰箱中(-18℃)冷冻24h 后取出,在室温(20℃)下静置24h ,待环氧树脂胶完全固化后即可使用.图1(A )为接口示意图,图1(B )为接口的实际显微CCD 照片.F ig .1　Sche matic di agram of the hybr id m icrof luidicdev ice with UVdetection F ig .2　Sche matic di agram of sam ple loadi ng (A )and separation (B )process1.2.2　紫外检测系统　选定耦合的毛细管在距离芯片d 点50mm 处作为检测点,除去该处毛细管外壁的聚酰亚胺涂层,将毛细管固定于毛细管电泳仪的透镜卡盒中.将石英毛细管的出口端水平插入废液池e 中(见图2),并将接口缝隙密封.将芯片、耦合的毛细管、透镜卡盒以及废液池共同固定于塑料基座上,构成完整的紫外检测芯片系统.实际使用时,将该装置水平推入紫外2可见检测器的检测室中即可进行光度检测.1.2.3　实验操作　以复合毛细管芯片系统、紫外2可见检测器和多触点高压电源构成完整的紫外检测微流控芯片毛细管电泳分析系统.紫外检测波长254nm .电泳系统采用夹流进样技术[11,12],原理如图2所示.具体操作如下:先在芯片贮液池a ,b 和e 内加入5mm o l L 硼砂缓冲液(pH =9.2),再向贮液池c 中加入样品.将高压电源的4个电极分别插入贮液池内.在充样阶段,于a ,b ,c 和e 贮液池内的电极上分别施加1100,0,1000和1100V 电压,充样时间30s ;在进样分离阶段,a ,b ,c 和e 处电压分别变为1800,1050,1050和0V .以2mm o l L 苯甲酸为样品,以5mm o l L 硼砂(pH =9.2)缓冲液为分离介质,考察了夹流电压(a 2b 和e 2b 间电位差)、分离电压(a 2e 间电位差)和抑流电压(a 2b 和a 2c 间电位差)的变化对分离效率和信号峰高的影响.实际试样的分离:以市售的复方磺胺甲　唑片为样品,以5mm o l L 硼砂(pH =9.2)缓冲液为分离介质.进样电压1000V ,夹流电压为1100V ,分离电压1800V ,抑流电压为750V .2　结果与讨论2.1　设计思想本文提出的利用石英毛细管耦合玻璃微流控芯片实现紫外检测的思路,充分发挥了微流控芯片和毛细管电泳分析各自的优势,相对常规微流控芯片而言,本系统无需采用石英基质芯片,避免了高成本(高于玻璃芯片10倍)、高难度(芯片热键合需1200℃)的石英芯片加工;可利用成熟的常规毛细管电泳仪器及设2321 高等学校化学学报V o l .25备实现毛细管上的紫外检测,检测灵敏度达到常规毛细管电泳仪的水平,避免了设备昂贵、步骤复杂的光学系统加工.此外,采用毛细管作为分离通道其长度灵活可调、不易产生弯道效应、通道内壁光滑并对流体干扰小.另一方面,毛细管耦合芯片利用芯片夹流进样技术,可显著提高进样重现性[13],同时降低进样区带宽度至75Λm 以下(CCD 摄像实测),因而可采用更短的分离通道,缩短了分离时间.2.2　毛细管2芯片耦合技术毛细管2芯片耦合技术的关键在于对毛细管2芯片接口处死体积的控制.为减小耦合难度,采用的石英毛细管的直径与通道宽度(75Λm )相同.由于在芯片上钻孔的直径通常比石英毛细管外径大,当以缓冲液充满芯片和通道时,钻孔和毛细管外壁的空隙之间会存有一定体积的气泡,对电泳操作有干扰.本工作参考B ings 等[14]使用的方法,提出了一种更为简易,且容易控制的减小毛细管2芯片接口处死体积的方法.首先利用电吹风加热,通过降低环氧树脂胶的粘度来增加其流动性;待气泡从缝隙中排尽后,再利用冰箱冰冻降温,冻结树脂胶的流动.该方法能使环氧树脂胶准确快速定位至目标位置,且不会产生毛细管口被胶堵塞的现象.采用该法加工的芯片,在体视镜下以10-3m o l L 荧光素钠溶液为示踪物,通过目视和CCD 摄像方法观察,在接口处无气泡产生,经多次进样操作,重现性良好.样品区带在经过接口时,未观察到明显的试样区带分散变宽现象.2.3　分离条件的优化系统考察了新建芯片系统中夹流电压、分离电压和抑流电压变化对分离性能的影响,结果如图3和图4所示.总体结果表明,上述因素的影响变化规律与普通玻璃芯片相似[11,12].从图3(A )可见,进样电压为1000V 时,随着夹流电压的增加,试样区带宽度变窄,信号峰高减小,塔板数增大.当夹流电压高于1150F ig .3　The effects of p i nched volt age (A )and separation volt age (B )on plate nu m bers and UV respon sesF ig .4　The effects of choke volt age on plate nu m bers and m igration ti m eV 时,夹流达到极限,系统无法实现正常进样.由图3(B )可见,样品的迁移时间随分离场强的增加而减小.在场强大于200V c m 时,分离塔板数随场强的变化不明显,可能是由于样品区带在由芯片进入石英毛细管后发生扩散和峰展宽所致.在图4中,分离电压保持1800V 不变,分离塔板数在抑流电压为750～1000V 范围内出现一个近似平台区.若抑流电压过低(<750V ),试样向分离通道泄漏,导致进样区带展宽,塔板数下降;若抑流电压过高(>1000V ),体系向两侧进样通道分流过多,导致分离通道流速过低,试样迁移时间延长,区带变宽,塔板数降低.综合以上结果,选择夹流电压为1100V ,分离电压为1800V ,抑流电压为750V .2.4　分析性能与应用采用上述优化的实验条件,以10-3m o l L 荧光素钠溶液为试样,对比了本系统与商品化毛细管电泳仪的检测灵敏度,结果表明,在254nm 下,本系统与电泳仪(75Λm 内径毛细管)的检测吸光度分别为0.036和0.068,可见灵敏度与商品化毛细管电泳仪相当.以2mm o l L 苯甲酸为试样考察了系统分离的重现性,连续11次进样,信号峰高的R SD 为1.5%.利用上述系统,在70s 内成功地实现了复方磺胺甲　唑片23321N o .7曹小丹等:基于复合型微流控芯片的紫外检测毛细管电泳系统 F ig .5　Electropherogram for sulfatr i m t ablets种有效成分氧苄氨嘧啶(TM P )和磺胺甲　唑(S M Z )的分离(见图5).信号峰高重现性的R SD (n =8)分别为1.7%(S M Z )和2.4%(TM P ).系统分析速度达到36样 h ,其中充样时间30s ,分离时间70s .芯片系统有效分离距离5c m ,最高分离效率达到80000 m ,但尚未达到常规微流控芯片的水平,可能与毛细管和微芯片两者通道的截面积及内表面的电渗性质差异有关.参　考　文　献[1]　M anz A .,Graber N .,W idm er H .M ..Sens .A ctuato rs B [J ],1990,B 1:244—248[2]　W AN G Sh i 2L i (王世立),FAN G Zhao 2L un (方肇伦).Spectr .and Spectr .A nal.(光谱学与光谱分析)[J ],2000,20:143—148[3]　FU X iao 2Yun (傅小芸),LU J ian 2D e (吕建德),CH EN Yao 2Zu (陈耀祖).Chem.J.Ch inese U niversities (高等学校化学学报)[J ],1997,18(9):1453—1455[4]　L iang Z .H .,Ch iem N .,O cvirk G .et a l ..A nal .Chem .[J ],1996,68:1040—1046[5]　N akanish i H .,N ish i m o to T .,A rai A .et a l ..E lectropho resis [J ],2001,22:230—234[6]　Peterson N .J .,M ogensen K .B .,Kutter J .P ..E lectropho resis [J ],2002,23:3528—3536[7]　Ceri o tti L .,L ich tenberg J .,C l ém ent S .et a l ..M icroTA S 2001[C ],N etherlands :K luw er A cadem ic Publishers ,2001:339—340[8]　L i J .J .,T h ibault P .,B ings N .H .et a l ..A nal .Chem .[J ],1999,71:3036—3045[9]　L iu S .,Zhang Z .,R en H .et a l ..M icro 2TA S 2001[C ],N etherlands :K luw er A cadem ic Publishers ,2001:99—100[10]　Y I N Xue 2Feng (殷学锋),SH EN Hong (沈　宏),FAN G Zhao 2L un (方肇伦).Ch inese J .A nal.Chem .(分析化学)[J ],2003,31:116—119[11]　Jacobson S .C .,H ergenroeder R .,Koutny L .B .et a l ..A nal .Chem .[J ],1994,66:1107—1113[12]　A larie J .P .,Jacobson S .C .,Culbertson C .T .et a l ..E lectropho resis [J ],2000,21:100—106[13]　Fang Q .,Xu G .M .,Fang Z .L ..A nal .Chem .[J ],2002,74:1223—1227[14]　B ings N .H .,W ang C .,Sk inner C .D .et a l ..A nal .Chem .[J ],1999,71:3292—3296A Hybr id M icrof lu id ic Ch ip -ba sed Cap illary ElectrophoresisSystem w ith UV Absorbance D etectionCAO X iao 2D an ,FAN G Q un 3,FAN G Zhao 2L un(Institu te of M icroanaly sis S y ste m ,D ep art m ent of Che m istry ,Z hej iang U niversity ,H ang z hou 310028,Ch ina )Abstract A hyb rid m icroflu idic system p roduced by coup ling a m icrofab ricated glass ch i p w ith con 2ven ti onal silica cap illary fo r UV ab so rbance detecti on w as develop ed .T he system has p roved to be ro 2bu st ,and easily fab ricated at a low co st .T he effects of sam p le loading and separati on field strength on p late num ber ,m igrati on ti m e and signal respon se w ere ob served in the op ti m izati on studies .T he rep roducib ility w as exam ined by u sing benzo ic acid as a m odel sam p le and fo llow ing si m ilar behavi o r as fo r com p lete pho to lithograph ically p roduced glass ch i p system s .T he resu lts show ed that the rep ro 2ducib ility is good and the R SD (n =11)w as on ly 1.5%fo r benzo ic acid .T he perfo r m ance of the sys 2tem w as dem on strated by separating su lp ham ethoxazo le (S M Z )and tri m ethop ri m (TM P )in su lphatri m tab lets w ith in 70s .T he detecti on li m its w ere com p arab le to tho se ob tained w ith a comm ercial cap il 2lary electrop ho resis in strum en t .Keywords M icroflu idic ch i p 2silica cap illary hyb rid system ;M icroflu idic cap illary electrop ho resis ;UV detecti on(Ed .:A ,G ,Z )4321 高等学校化学学报V o l .25。