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钙离子荧光探针
钙离子荧光探针（CalciumIonFluorescentProbe）是一种特殊的荧光探针，可用于检测细胞内钙离子的浓度。
钙离子在哺乳动物细胞中发挥着重要作用，用于激活细胞内酶、转录因子和神经元信号传导。
因此，准确地检测和监测细胞内钙离子浓度，将有助于深入研究细胞环境中的生物学过程。
钙离子荧光探针的原理是：钙离子的参与荧光探针的改变使其荧光发生变化，以反映细胞内钙离子的浓度。
这种类型的荧光探针有多种类型，其中绝大多数都是以蛋白质或小分子化合物为基础，其中荧光活性位点上结合有一种特定的钙离子侦测分子。
在细胞内，当钙离子浓度增加时，这种侦测分子与钙离子结合，从而引起荧光发生变化，可用来监测细胞内钙离子的浓度。
钙离子荧光探针的优势有两个方面：其一，它非常灵敏，能够有效检测钙离子的浓度，从而预测和研究细胞内环境的变化；其二，它具有极高的特异性，能够单独检测钙离子中的杂质，而不受其他可能存在的离子的干扰。
结果，它能够准确反映细胞内钙离子的变化，为研究细胞生物学过程提供了重要的参考。
由于钙离子荧光探针的优势，它被广泛应用于生命科学和医学研究中。
例如，它可用于检测细胞中钙离子的浓度，以及在疾病发生中细胞内钙离子浓度的变化；可用于监测神经元细胞中钙离子的活动性，以及神经元之间的信号传导；还可以用于研究细胞增殖调控中钙离子的作用机制。
总而言之，钙离子荧光探针是一种新颖、灵敏、特异性较高的荧光探针，在生物学研究中有着广泛的应用，可以精准监测细胞内钙离子的浓度，为深入探索细胞环境中的生物学过程提供有力的技术支持。
细胞活性检测方法细胞活性检测方法主要用于评估细胞的生存和功能状态，广泛应用于生物医学研究、药物筛选、环境监测等领域。
目前，细胞活性检测方法主要可以分为细胞形态学观察方法、细胞色素检测方法、细胞代谢活性检测方法、细胞增殖检测方法和细胞毒性检测方法等。
细胞形态学观察方法是通过显微镜观察细胞的形态、结构和运动等来评估细胞的活性。
常用的方法有细胞染色、免疫细胞化学染色、电子显微镜观察等。
细胞染色常用的方法有吉姆萨染色、伊红染色、达科显色等，通过染色剂与细胞器和细胞成分的特异性反应，可以评估细胞的形态和结构是否正常。
免疫细胞化学染色则是利用抗体与特定蛋白结合，通过免疫反应染色的位置和强度来评估细胞中特定蛋白的分布以及相关的细胞活性。
电子显微镜观察可以提供更高分辨率的细胞形态和结构信息。
细胞色素检测方法主要用于评估细胞中某些特定酶或分子的活性水平。
例如，青蛙卵中的细胞色素-c还原酶活性检测是通过测定细胞中细胞色素-c的还原酶活性来评估细胞的呼吸功能。
此外，细胞色素琥珀酸酶、醛酮还原酶、过氧化物酶等也是常用的酶活性检测指标。
这些方法主要通过测定细胞中特定酶的底物转化产物的生成量或底物消耗量来间接评估细胞中该酶的活性水平。
细胞代谢活性检测方法是通过测定细胞中一些代谢产物的水平来评估细胞的代谢活性。
例如，细胞呼吸活性检测方法可以通过测定细胞中耗氧量或产生的二氧化碳量来评估细胞的呼吸代谢活性。
蛋白质、核酸和糖类代谢等也可以通过测定细胞中相关代谢产物的水平来评估细胞的代谢活性。
细胞增殖检测方法主要用于评估细胞的增殖能力。
常用的方法有细胞计数、增殖染料标记和细胞周期分析等。
细胞计数是通过手动显微镜观察或自动计数器进行的，可以定量评估细胞的增殖数目。
增殖染料标记则是利用细胞内染料的稳定性或代谢产物的积累来评估细胞的增殖活性。
细胞周期分析是通过流式细胞术来确定细胞在G0/G1、S和G2/M等不同细胞周期阶段的比例，从而评估细胞的增殖能力。
用荧光测定法，通过测定荧光强度来反映细胞中的钙离子浓度是目前普遍采用的细胞内钙离子检测方法。
根据激发光的波长不同，可以将检测细胞内钙离子用的荧光染料分为紫外光激发的钙离子荧光指示剂和可见光激发的钙离子荧光指示剂。
其中，紫外光激发的钙离子荧光指示剂有Fura 2、lndo-1、Bis-fura、Ouin-2、Fura-4 F、Fura-5F、Fura-6F、Benzothiaza-1、Benzoth．Iaza-2、BTC等；可见光激发的钙离子荧光指示剂有FIno-3、Fluo-4、Fluo-5N、Rhod-5N、X-rhod-5N 、Calcium Green-1 、Calcium Green-2、Calcium Orange、Calcium Crimson、Fura Red等。
Fluo-3具有Kd值较高、可见光激发、监测背景低等优点，被广泛用于荧光监测的指示剂[9]。
Fluo-3/AM在与钙结合后表现为荧光强度的增加，细胞内钙离子浓度愈高，荧光愈强，细胞内钙离子浓度愈低，荧光愈弱[10]。
以往测定细胞内钙离子浓度变化的方法通常是利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)来完成，但缺点是LSCM扫描采集速度慢，对培养器皿要求特殊，且价格高昂，检测成本高，对细胞伤害大。
为降低长时间采集对样品造成的损伤，作者应用高灵敏度的流式细胞仪和流式细胞技术相结合，以纯化的T淋巴细胞为研究对象，选择Fluo-3/AM负载细胞，成功获得了实时监测并分析受到外界信号刺激时细胞内Ca2+浓度的动态变化。
结果显示随着刺激信号的加入和时间的变化，Fluo-3/AM负载的T淋巴细胞内的钙离子浓度呈现动态变化。
该方法能简单快速、可直接动态实时检测细胞内钙离子荧光信号，为研究细胞内的Ca2+浓度的动态变化提供了实用的解决方案和方法。
水母发光蛋白（ＡＥＱ）广泛应用于Ｃａ２＋信号监测领域己有近４０年。
ＡＥＱ是由一个２２ＫＤａ大小的可结合Ｃａ２＋的脱辅基发光蛋白和辅基腔肠素（ＣＴＺ）组成的，在有氧情况下，自发组成功能全蛋白，具有三个Ｃａ２＋结合手性位点。
细胞内钙离子浓度及过程的可视化研究细胞内钙离子（Ca2+）是一种重要的信号分子，它参与了多种细胞过程，包括细胞增殖、代谢、分化和凋亡等。
钙离子的浓度变化可以引发多种信号通路的激活和抑制，而这一过程的精确测量和研究一直是生物学研究的热点之一。
为了研究细胞内钙离子浓度及其变化的过程，科学家们发展了一系列可视化技术，并不断地改进和完善。
以下将对这些技术进行介绍和探讨。
1. 荧光探针荧光探针是一种常用的细胞内钙离子浓度测量技术。
它基于荧光物质在钙离子存在下的荧光强度变化来反映细胞内钙离子浓度的变化。
目前，常用的荧光探针有Fura-2、Fluo-3、Rhod-2等。
这些探针具有灵敏度高、响应速度快、使用方便等优点，并且可以在单个细胞层面进行测量，从而反映细胞内钙离子浓度的局部变化。
但是，荧光探针也存在一些缺点，例如探针本身的毒性、荧光信号受到细胞内环境的影响等。
2. 光学成像技术光学成像技术是一种可以在细胞内实时观察钙离子浓度变化的技术。
它包括单细胞成像、双光子成像、多光子成像等不同的方法。
其中，单细胞成像可以在单个细胞的水平上观测钙离子的变化，但是受到成像区域的限制。
而双光子成像和多光子成像可以在更大的区域内进行成像，但是需要更高的设备成本和技术水平。
无论哪种方法，光学成像技术都具有高时间分辨率、高分辨率、高活细胞成像等优点，并且可以提供非常直观的瞬态钙信号。
3. 基因编辑技术基因编辑技术可以用来研究细胞内钙离子的调节机制。
通过基因编辑技术，可以实现精确地修饰特定的靶基因，从而观察对应的生物学变化。
例如，可以使用CRISPR/Cas9技术对钙离子通道进行编辑，观测其对钙离子信号传递的影响。
4. 蒙古花生素受体技术蒙古花生素受体技术是一种可以研究钙离子信号传递通路的技术。
基于该技术，研究人员可以精确地操纵细胞内的蒙古花生素受体，从而调节钙离子的浓度变化和传递通路。
该技术可以模拟细胞内钙信号的变化，从而深入地研究钙离子信号传递的机制。
用Furo-3/AM检测细胞内钙离子浓度FSC forward scatter 480nmSSC side scatter 480nmFL1 515-545nm 绿色FL2 564-606nm 橙色FL3 650- 红色1, 实验目的：检测不同细胞株中细胞质内钙离子浓度的差异，以检测钙离子浓度对癌细胞的迁移性的影响。
1，检测迁移性不同的FBJ-LL-H于S1-H 两株细胞中细胞内钙离子浓度的差异。
2，检测间质作用因子Stim1对细胞内钙离子浓度的影响包括对照组细胞，Stim1表达的几株单克隆细胞3，观察细胞ER钙离子释放之后的钙离子内流2, 样品处理：1.储备液配制F-127 5mg + 25uL DMSO 终浓度20%0.05mg Fluo-3/AM +22uL DMSOF127与Fluo-3/AM 以体积比1比1混合终浓度为2 μM2. 消化细胞3*10e6/mL-1*10e7/mL 细胞混悬液加入Fluo-3/AM，使之终浓度为4 μM3. 避光37℃45min4. PBS(-)清洗2遍5. 用PBS(-)重悬细胞，将浓度定为1*10e6/mL6. 当用毒胡萝卜素Thapsigargin（TG）排空细胞内质网钙池钙离子时, 用终浓度为3 μM的TG 孵育15min，上样20 s后加入钙离子使其终浓度为1 μM观察钙离子内流7, 为观察细胞在加入TG之后胞内钙离子的变化，将未经TG处理的细胞上样20s后加入TG观察钙离子浓度变化，正常情况下TG加入后因为钙池钙离子的释放胞内钙离子浓度会有一个上升的过程，随后因为钙泵失效，钙离子会逐渐降低。
流式细胞仪Coulter图·横轴时间time纵轴荧光强度（FL1）（40-秒baseline monitoring？）上样持续检测1-3min 激发光波长488nm 发取400uL混悬液，射波长530nm数据处理CellQuest software实验原理：Fluo-3-Am进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶的Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm 波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。
急性胰腺炎时胰腺细胞内钙离子变化的初步观察报告
沈骥;吴宗平
【期刊名称】《四川省卫生管理干部学院学报》
【年(卷),期】1996(15)1
【摘要】近来的研究提示在急性胰腺炎（ＡＰ）病理生理过程中可能有钙离子内流的参与。
使用ＳＤ大白鼠胆胰管逆行加压注射牛磺胆酸制成ＡＰ模型，用荧光指示剂Ｆｕｒａ－２／Ａｍ测定游离胰腺腺泡活细胞内游离钙离子浓度（〔Ｃａ＾２＋〕ｉ）。
结果显示ＡＰ后的２和３小时胰腺呈急性出血坏死性胰腺炎早期改变，ＡＰ组〔Ｃａ＾２＋〕ｉ较对照组明显增高（Ｐ〈０．００１）。
本实验结果提示ＡＰ发生发展过程中存在着明显的钙离子内流。
【总页数】4页(P1-4)
【作者】沈骥;吴宗平
【作者单位】外科教研室;外科教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R657.51
【相关文献】
1.细胞内自由钙离子浓度变化的时-频分析 [J], 周永军;牛中奇;侯建强;陈建华;白冰;黄华
2.急性胰腺炎腺泡细胞钙离子浓度变化研究 [J], 邓小雨;黄博
3.肾上腺髓质素对低氧时肺成纤维细胞内钙离子动态变化的影响 [J], 郝淑玲;于忠和;齐保申;周晓梅
4.急性胰腺炎与细胞内游离钙离子 [J], 韩磊;江少杰;朱善德
5.用Fura—2测定缺氧时海马细胞内游离钙离子浓度的变化 [J], 刘振伟;王福庄因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
活细胞内钙离子浓度的检测钙离子—第二信使钙离子在信号传导通路中发挥第二信使作用。
在细胞收缩、运动、分泌和分裂等重要活动中，均需要钙离子的参与及调节。
钙离子的信使作用是通过其浓度的升高或降低来实现的。
细胞内游离钙离子的浓度是10-8---10-7M，比细胞外钙离子浓度低104---105倍，当细胞受到特异性信号刺激后，细胞内钙库（内质网、肌浆网）的钙通道或质膜上的钙通道开放，使细胞内钙离子浓度快速升高，产生钙信号，进而使细胞内某些酶的活性和蛋白质功能发生改变，产生细胞效应。
荧光钙离子测定技术发展简史荧光钙离子浓度测定中常用的指示剂 荧光钙离子测定常用仪器荧光钙离子测定的原理及具体方法荧光钙离子测定技术发展简史In 1920s 许多学者开始着手进行钙离子浓度的测定许多学者开始着手进行钙离子浓度的测定。
1962年，Shimomura 等首次分离出水母蛋白作为钙激活蛋白检测Ca 2+浓度浓度，，但其发光高峰较相应生理过程出现慢但其发光高峰较相应生理过程出现慢，，且分子量大且分子量大，，通过细胞膜及在胞浆内扩散的能力较差浆内扩散的能力较差，，难于反映细胞内Ca 2+浓度的动态变化浓度的动态变化。
1967年Ross 使用离子选择性微电极直接测定细胞内Ca 2+水平水平，，该方法简便该方法简便，，但反应时间长但反应时间长，，只能测定静息状态下的Ca 2+水平水平。
70年代用砷偶氮年代用砷偶氮ⅢⅢ（aresenazo Ⅲ）染色染色，，可定量分析钙离子变化可定量分析钙离子变化，，但用微注射技术将染料注入细胞内注射技术将染料注入细胞内，，故只能测大细胞的Ca 2+变化变化。
1980s ，Tsien 和同事合成了一种不需微注射就能进入到细胞的新荧光染料Quin2，以后又合成了Fura-2、Indo-1和Fluo-3，这些新的荧光染料被称为荧光钙探针(Fluorescent probes)或钙荧光指示剂(Fluorescent indicators)，很容易透过细胞膜进入胞内很容易透过细胞膜进入胞内，，对Ca 2+的敏感性高敏感性高。
活体钙成像钙荧光曲线
活体钙成像是一种用于观察细胞内钙离子浓度变化的技术，可以用于研究许多生物学过程，如神经元活动、肌肉收缩和细胞分裂等。
在活体钙成像中，通常使用钙荧光探针来测量细胞内钙离子的浓度。
钙荧光探针是一种荧光染料，可以结合钙离子并发出荧光信号。
当细胞内钙离子浓度发生变化时，荧光信号也会发生变化，从而反映出钙离子的浓度变化。
钙荧光曲线是指在活体钙成像实验中记录下的钙离子浓度随时间的变化曲线。
这些曲线可以用来研究细胞内钙离子的动态变化，以及不同刺激和药物对钙离子浓度的影响。
钙荧光曲线通常包含多个时间点的测量值，这些时间点可以在实验中定期采集。
通过分析这些时间点的钙荧光信号，可以得到钙离子浓度随时间的变化曲线。
这些曲线可以用来计算钙离子的平均浓度、波动范围和变化速率等参数，以更好地理解细胞内钙离子的动态变化。
细胞生物学中的细胞内钙离子测定技术在细胞生物学研究领域中，测定细胞内钙离子浓度是一个非常重要的课题。
细胞内钙离子浓度的变化与许多生物学过程密切相关，如细胞信号传导、细胞增殖、细胞凋亡等。
因此，开发出准确、可靠的细胞内钙离子测定技术对于揭示细胞内钙离子的重要调控作用具有重要意义。
1. 荧光探针法荧光探针法是一种常用的细胞内钙离子测定技术。
它利用钙离子结合剂（如Fura-2, Fluo-3, Rhod-2等）及其与钙离子配合形成的荧光产物来测定细胞内钙离子浓度。
通过荧光显微镜等荧光成像仪器，可以直接观察到细胞内钙离子的分布和变化情况。
2. 钙指示剂法钙指示剂法是另一种常用的细胞内钙离子测定技术。
它利用钙指示剂（如BAPTA, EGTA等）与钙离子结合形成稳定的配位化合物，通过测定钙指示剂与钙离子的结合情况来推测细胞内钙离子的浓度。
这种方法通常需要将细胞或亚细胞分离提取，并通过化学分析方法（如光谱法、离子选择性电极法等）来测定结合状态和浓度。
3. 钙敏感蛋白法钙敏感蛋白法是一种基于钙敏感蛋白与钙离子结合的测定技术。
这种方法通常利用细胞内的特定钙敏感蛋白（如calmodulin, troponin C等）与钙离子结合后的构象或功能变化来间接测定细胞内钙离子的浓度。
通过测定钙敏感蛋白的结合活性或功能变化程度，可以推测出细胞内钙离子的浓度变化。
值得注意的是，细胞内钙离子测定技术要求仪器灵敏度高、选择性好、操作简单快速。
此外，为了保证测定结果的准确性，还需要进行严格的实验设计和数据处理。
为了增加细胞内钙离子测定技术的可靠性，研究人员不断进行技术改进和创新，推出了一系列新的测定方法，如光学成像法、基于天然荧光染料的测定法等。
总结起来，细胞生物学中的细胞内钙离子测定技术是一项关键的研究内容。
荧光探针法、钙指示剂法和钙敏感蛋白法是常用的测定技术，它们在测定细胞内钙离子浓度的同时，也为我们揭示细胞内钙离子的重要生物学功能提供了重要的手段和思路。
细胞内钙离子的研究进展细胞内钙离子的研究进展【摘要】钙离子对细胞的功能起着至关重要的作用，因此研究细胞内钙离子有非常重要的意义。
现从细胞内钙离子的生理作用，检测方法，以及与细胞内钙离子相关疾病作一综述。
【关键词】钙离子文章编号：1004-7484（2013）-02-0569-02钙在维持细胞结构和功能起着重要作用。
钙在体内有两种形式：结合状态和离子状态（钙离子），钙离子又分为细胞内钙离子和细胞外钙离子。
正常情况下，细胞外液钙离子的浓度约为10-3mmol/L，细胞内钙离子浓度为10-7mmol/L，二者之间保持动态平衡。
当这种平衡被打破以后，将会出现细胞的损伤和疾病。
1 细胞内钙离子的生理作用1.1 钙离子在肌肉―兴奋收缩偶联中的作用在神经―肌肉接头处兴奋传递的关键是钙离子的内流。
在肌肉―兴奋收缩偶联中，当肌细胞质内钙离子升高，肌肉收缩；当胞质内的钙离子降低，肌肉舒张。
因此胞质内钙离子浓度的升高和降低是引起肌肉收缩和舒张过程的关键。
1.2 钙离子作为第二信使的作用当某些受体与配体结合后，可将二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2），分解为三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG），IP3与内质网或肌质网膜上的受体结合引起钙离子释放，然后钙离子与胞质中的钙调蛋白（CaM）结合，生成4Ca2+.CaM复合物，进而发挥各种生理作用。
1.3 钙离子调节神经递质的释放当神经纤维传来动作电位，到达末梢，使突触前膜去极化，钙离子内流，是末梢内钙离子浓度升高，钙离子可启动突出小泡的出胞机制，从而使乙酰胆碱释放突触间隙。
2 细胞内钙离子的检测方法2.1 钙离子选择性微电极测定法钙离子选择性微电极是一种电化学敏感器。
它是利用内充液和组织或细胞之间产生电位差，理想情况下，该电位差是钙离子对数的线性函数，遵循Nernst方程。
该方法的优点：不需使用指示剂。
缺点：穿刺损伤细胞可引起渗漏。
2.2 钙离子活化的荧光蛋白60年代从水母体内发现钙结合发光蛋白，Aequorin是应用最广泛的发光蛋白，它与钙离子结合后，释放氧分子，氧化coelenterazine发出波长465nm的蓝色荧光。
用流式细胞仪检测钙离子流的方法流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种用来分析和计数细胞数量，并且可以测定它们的大小、形状、表面蛋白和内部结构等的仪器。
在生物医学研究领域中，流式细胞仪被广泛地应用于细胞分析和免疫学研究中。
钙离子流则是生物细胞中一种重要的信号传导通路，通过测定钙离子在细胞内的浓度变化，可以揭示细胞的活跃状态和生理功能。
下面我们将介绍一下使用流式细胞仪检测钙离子流的方法。
一、原理介绍流式细胞仪是通过检测细胞中的荧光信号来获取细胞信息的。
当细胞中的钙离子浓度发生变化时，可以使用荧光钙指示剂来标记细胞内的钙离子，然后通过流式细胞仪来检测这些荧光信号的强度和数量，从而获得钙离子流的信息。
荧光钙指示剂可以选择Fura-2、Fluo-3、Rhod-2等。
这些指示剂在细胞内与钙结合后会发出荧光信号，通过流式细胞仪的激光激发，可以检测到这些荧光信号，并量化细胞内钙离子浓度的变化。
二、样本处理在使用流式细胞仪检测细胞内钙离子流之前，首先需要对细胞进行处理。
通常情况下，我们可以通过细胞培养来获得细胞样本。
然后将细胞用PBS（含钙和镁）洗涤，并用荧光钙指示剂染色。
在染色过程中需要注意，不要暴露在光线下或阳光下，以免荧光钙指示剂受到光照而退化失效。
三、测定条件在使用流式细胞仪测定钙离子流时，需要设置合适的测定条件。
首先是激光的选择，钙离子指示剂的激发和发射波长需要与流式细胞仪的激光波长相匹配。
然后需要设置适当的荧光信号探测器，以确保可以检测到钙离子指示剂产生的荧光信号。
此外，还需要进行空白对照，以便排除仪器本身产生的荧光信号对测定结果的干扰。
四、数据分析完成测定后，就需要对获得的数据进行分析。
可以采用流式细胞仪的数据分析软件来分析测定结果，并绘制相应的图表。
通常会绘制荧光强度随时间变化的曲线图来展示钙离子流的动态变化。
另外，还可以统计不同样本之间的荧光强度差异，以获得更加客观的实验结果。
五、应用领域流式细胞仪检测钙离子流的方法在生物医学研究中有着广泛的应用。
钙离子测定技术得益于两种近代实验技术，一是钙激活蛋白及荧光指示剂（或称荧光探针），二是荧光检测及成像分析，这些技术的日臻成熟使我们能够观察到许多与钙离子浓度变化有密切关系的亚细胞现象。
近年来，数字CCD成像荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、多光子扫描显微镜、流式细胞仪等技术的发展，使我们不但能够精确地测定出钙离子浓度的变化，还可以得出准确的亚细胞水平空间定位。
一、荧光钙离子测定常用技术1、荧光显微镜测定法是一类以荧光显微镜检测为基础的测量技术，可用来分析单独的完整活细胞中钙离子的分布和功能分子动力学。
然而，钙离子指示剂的性质易受细胞内环境（如pH）的影响，而且在多种细胞内现象中可见许多分子的浓度、分布、功能会同时或相应地发生一系列变化，为了研究这些细胞内现象的机制并排除测量准确性的干扰，目前多采用多参数分析。
（1）多参数数字化荧光显微镜系统（Multi-parameter digitized video microscope）多参数数字化荧光显微镜系统可允许观测单一活细胞被多种荧光指示剂标记的情况，对细胞内特定物质（细胞参数）发生特异性荧光反应。
组成该系统的几个主要部分是：装有相差或微分干涉相差的倒置（或正置）荧光显微镜、CCD数码相机（一般为高速、高灵敏度冷CCD）、可进行荧光钙离子浓度测定的图像工作站，荧光激发光源采用氙灯或汞灯，也有用激光的情形。
在荧光激发光路上放置有滤光片转轮，由软件经开关装置控制不同激发波长滤光片的转换，见图1。
CCD相机相当于一个检测器起到荧光信号检测和图像采集双重作用，采集到的荧光强度信号与钙离子浓度成正比，经软件分析得出细胞内钙离子浓度，钙离子浓度的基本计算方法见下式：①单波长测定[Ca2+]=Kd（F－Fmin）/ （Fmax－F）式中Kd为荧光剂与Ca2+形成复合物的解离常数。
Fmin和Fmax为最小荧光强度和最大荧光强度。
②双波长测定系用比值（Ratio）信号来计算细胞内游离Ca2+浓度，不必校正。
第37卷第6期2020年12月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.37 No.6December 20204研究报告i光电结合检测大鼠原代神经元胞内钙离子浓度方法的建立刘丽娜许晴魏华李华薛奋勤薛冰(首都医科大学中心实验室，北京100069)摘要：目的利用电刺激结合转盘共聚焦显微镜检测胞内钙离子浓度变化：方法钙离子变化是神经元发挥功能的关键因素。
本实验利用荧光探针fluo-4A M标记钙离子，电刺激兴奋神经元，转盘共聚焦技术检测胞内荧光强度的快速变化。
结果成功制备了刺激电极，并结合转盘共聚焦系统检测到刺激前1〇%左右的原代神经元有自发的钙离子升高，电刺激后，胞内钙离子迅速上升，刺激结束后，仍有周期性的升高，但幅度降低。
结论电刺激结合转盘共聚焦检测到胞内刺激前后钙离子的快速变化=关键词：钙离子；电刺激；转盘共聚焦显微镜；神经元中图分类号：Q95-336 文献标识码：A文章编号：1006-6179(2020)06-0007-04I)O I;10. 3969/j.issn. 1006-6179.2020.06.002神经元内钙离子的作用贯穿了其生命周期的整 个生命过程，如转录、分化、信号的传导及递质的释放和凋亡等等。
体内钙离子发生变化会导致很多疾 病，而很多应激也会首先导致钙相关蛋白发生改变[1。
显微成像技术已经广泛的应用在科学研究中，神经荧光染料结合成像技术已经广泛应用到检测各种活细胞胞内的钙离子的变化[2°]。
在神经元 中，钙离子通过电压和配体门控通道产生的胞内钙离子变化最明显。
另外，细胞内储存的钙释放也会导致胞内钙离子升高。
神经元处于静息状态时，胞 内钙离子浓度为1〇〇〜200 nmol/L，在神经元受到刺 激后，膜去极化，钙离子通道打开，钙离子内流，胞内 钙离子迅速升高到原来的1〇〜1〇〇倍。
我们通过搭 建转盘共聚焦系统结合电刺激，并对神经元细胞中 的钙离子进行成像。
生物分析化学试题及答案一、选择题（每题2分，共20分）1. 生物分析化学中，下列哪种技术不是用于蛋白质组学研究的？A. 二维凝胶电泳B. 质谱技术C. 核磁共振技术D. 色谱技术答案：C2. 在生物分析化学中，下列哪种技术不适用于核酸分析？A. PCR技术B. DNA测序C. 质谱技术D. 免疫分析技术答案：D3. 下列哪种化合物不是生物体内的主要能量来源？A. 葡萄糖B. 脂肪酸C. 氨基酸D. 核苷酸答案：D4. 生物分析化学中，用于检测细胞内钙离子浓度变化的技术是？A. 荧光共振能量转移B. 酶联免疫吸附测定C. 流式细胞术D. 原子吸收光谱法答案：A5. 生物分析化学中，用于检测细胞膜上受体的常用技术是？B. 免疫沉淀C. 免疫荧光D. 免疫共沉淀答案：C6. 在生物分析化学中，下列哪种技术不适用于蛋白质定量分析？A. 紫外-可见光谱法B. 荧光光谱法C. 质谱技术D. 酶联免疫吸附测定答案：A7. 生物分析化学中，下列哪种技术不适用于检测细胞凋亡？A. TUNEL法B. 流式细胞术D. 免疫组化答案：C8. 在生物分析化学中，下列哪种技术不适用于蛋白质结构分析？A. X射线晶体学B. 核磁共振技术C. 圆二色光谱法D. 酶联免疫吸附测定答案：D9. 生物分析化学中，用于检测细胞内活性氧（ROS）的技术是？A. 荧光探针B. 免疫印迹C. 质谱技术D. PCR技术答案：A10. 在生物分析化学中，下列哪种技术不适用于检测细胞周期？A. 流式细胞术B. 免疫印迹C. 免疫荧光D. 细胞计数法答案：B二、填空题（每题2分，共20分）1. 生物分析化学中，用于检测蛋白质磷酸化的常用技术是________。
答案：质谱技术2. 在生物分析化学中，用于检测DNA甲基化的常用技术是________。
答案：亚硫酸盐测序3. 生物分析化学中，用于检测蛋白质糖基化的常用技术是________。
答案：质谱技术4. 在生物分析化学中，用于检测蛋白质泛素化的常用技术是________。
荧光检测在医学实验中的应用–复习题第一章总论荧光的发生及基本检测原理1何谓发光？分子吸收辐射被激发后以光的形式释放，辐射跃迁而衰变回到电子基态→发光2荧光与磷光的区别？荧光：激发后马上发光，第一电子激发单重态辐射跃迁；延迟10-9～10-7秒后。
基态S0→单重态S1、S2跃迁→基态。
磷光：延迟时间长，几毫秒或更长10-3～10秒电子自旋未配对进入受激三重态，三重态→跃迁→基态3完成良好荧光检测的有关条件？1）选择相应的激发波长2）选择足够强度的激发光源，荧光强度与入射光强度成正比If＝φfI0(1-It/I0)；3）选择合适(QE)的发射波长检测器件；4）控制好样品制备与检测环境体系。
4荧光的种类根据激发方式。
1）光化发光2）化学荧光3）生物荧光。
按荧光素的标记过程可分为：1）免疫荧光2）组织荧光3）诱导荧光5有哪几种荧光现象？I次荧光现象：固有或自发荧光；一经辐射就可发出荧光的物质。
II 次荧光现象及荧光色素(标记物)又称继发荧光；样品分子不能或只能发出很弱的荧光，对此类分子需先经荧光色素标记结合或插入到不发光的大分子中去，根据荧光探针的荧光分析大分子。
6影响荧光强度（If）的因素1光化分解：荧光物质吸收光能后，某些键断裂，导致荧光弱。
制片时应避光。
2荧光淬灭：（1）温度淬灭：加快震动弛豫而丧失振动能量；增加分子热运动高温荧光分子与液基环境中分子碰撞。
温度适宜或低温。
（2）浓度淬灭：浓度大时发光分子在样品中分布不均，深部的分子吸收不到光子，量子产额反而小。
生成二聚体或多聚体，改变吸收光谱，If降低。
（3）杂质淬灭：静态淬灭，杂质与荧光分子组成另一种化合物。
环境净化。
碰撞、转入三重态淬灭。
3pH影响：破坏荧光物质环链结构，芳香族化合物的酸、碱功能团对pH敏感。
7半波宽定义：最大透光度Tmax波长1/2处对应的两波长差(λ1 -λ2)也称带宽(Bandwidth),带宽窄则光色纯。
第二章荧光成像检测1光学显微镜分辨率定义及简易计算公式2影响光学显微镜分辨率的主要因素？影响分辨率的因素为衍射效应：圆斑像AIRY斑，阻碍分辨率。
应用FACS测定细胞激活时胞内钙离子浓度的变化
陶加献;季永镛
【期刊名称】《中国免疫学杂志》
【年(卷),期】1993(009)002
【总页数】5页(P97-101)
【作者】陶加献;季永镛
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R392－33
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活细胞内钙离子浓度的检测钙离子—第二信使钙离子在信号传导通路中发挥第二信使作用。
在细胞收缩、运动、分泌和分裂等重要活动中，均需要钙离子的参与及调节。
钙离子的信使作用是通过其浓度的升高或降低来实现的。
细胞内游离钙离子的浓度是10-8---10-7M，比细胞外钙离子浓度低104---105倍，当细胞受到特异性信号刺激后，细胞内钙库（内质网、肌浆网）的钙通道或质膜上的钙通道开放，使细胞内钙离子浓度快速升高，产生钙信号，进而使细胞内某些酶的活性和蛋白质功能发生改变，产生细胞效应。
荧光钙离子测定技术发展简史荧光钙离子浓度测定中常用的指示剂 荧光钙离子测定常用仪器荧光钙离子测定的原理及具体方法荧光钙离子测定技术发展简史In 1920s 许多学者开始着手进行钙离子浓度的测定许多学者开始着手进行钙离子浓度的测定。
1962年，Shimomura 等首次分离出水母蛋白作为钙激活蛋白检测Ca 2+浓度浓度，，但其发光高峰较相应生理过程出现慢但其发光高峰较相应生理过程出现慢，，且分子量大且分子量大，，通过细胞膜及在胞浆内扩散的能力较差浆内扩散的能力较差，，难于反映细胞内Ca 2+浓度的动态变化浓度的动态变化。
1967年Ross 使用离子选择性微电极直接测定细胞内Ca 2+水平水平，，该方法简便该方法简便，，但反应时间长但反应时间长，，只能测定静息状态下的Ca 2+水平水平。
70年代用砷偶氮年代用砷偶氮ⅢⅢ（aresenazo Ⅲ）染色染色，，可定量分析钙离子变化可定量分析钙离子变化，，但用微注射技术将染料注入细胞内注射技术将染料注入细胞内，，故只能测大细胞的Ca 2+变化变化。
1980s ，Tsien 和同事合成了一种不需微注射就能进入到细胞的新荧光染料Quin2，以后又合成了Fura-2、Indo-1和Fluo-3，这些新的荧光染料被称为荧光钙探针(Fluorescent probes)或钙荧光指示剂(Fluorescent indicators)，很容易透过细胞膜进入胞内很容易透过细胞膜进入胞内，，对Ca 2+的敏感性高敏感性高。
随着这些试剂的发展随着这些试剂的发展，，我们能够观察到许多与钙离子浓度变化有密切关系的亚细胞现象浓度变化有密切关系的亚细胞现象。
数字式录像显微镜数字式录像显微镜、、流式细胞仪流式细胞仪、、激光共聚焦显微镜和多光子技术等的发展使我们不但能够测定出钙离子浓度的实时变化等的发展使我们不但能够测定出钙离子浓度的实时变化，，还可以得出精确分析的亚细胞水平的细胞内钙离子的空间定位得出精确分析的亚细胞水平的细胞内钙离子的空间定位。
目前关于钙离子的研究工作已经从细胞水平分析转移到亚细胞水平的研究的研究。
钙离子浓度测定中常用的指示剂化学荧光指示剂生物发光钙离子指示剂化学荧光指示剂化学类荧光探针是应用最为广泛的钙离子示踪剂，对于同样的钙离子浓度变化，它的信号强度变化最强。
根据不同的分类标准可将其分成不同类：根据是否能够进行率图(ratiometric)分析将其分为率图类和非率图类，前者包括Indo1 、fura2，后者常用的有fluo3 、calcium green和rhod2。
根据其激发/发射光谱将其分为：①蓝光发射组-quin2、indo1 、benzothiaza②绿光发射组-fura2 、fluo3 、calcium green③黄和橙光发射组-calcium orange 、calcium crimson④红光和近红外线发射组--calcium crimson 、fura red生物发光钙离子指示剂钙离子连接的发光蛋白:生物发光是由生物组织发出的光线，目前设计的几种发光蛋白质主要有aequorin、obelin、clytin、mitrocomin，当存在钙离子时，由于分子内反应，这些发光蛋白质能够发射出可见生物光，它们对仪器设备要求比较低，由于不是激发发光，所以不受荧光漂白的影响，最大缺点是标记和检测生物发光相对困难并很难校准。
绿荧光蛋白基础上的钙离子指示剂优点：1)与水母蛋白相比，它们能够进行率测量。
2)钙离子依赖性的荧光反应是可逆的，不需要其它的辅助因子。
3)与化学荧光探针相比，具有相对高荧光强度和时空分辨率，允许简单的光子探测系统。
4) 敏感度或钙离子结合动力学与指示剂的浓度无关。
5)如果用显微注射的方法将它们注入细胞，它们只是储留在微注射的部位，它们可以精确定位在细胞内靶细胞器。
绿荧光蛋白(GFP)基础上的钙离子指示剂的缺点：它们的荧光强度或率的变化范围较小, 大部分Rmax/Rmin<2，而fura-2和indo1可达到20，fluo3 的Fmax/Fmin>100。
荧光钙离子探针优点①易于进入细胞，为非损伤性测量。
②荧光图像分析技术可提供细胞内钙离子分布二维乃至三维图像，可实时显示，空间分辨率优于其他方法。
③反应速度快，对于相同浓度钙离子改变，信号变化最强。
④能与其他许多先进检测技术联合应用，可同时观察细胞的荧光图像与相差或微分干涉图像，以利于对照观察亚细胞结构并定位。
⑤能同时测定两种或多种离子浓度，有利于诸如钠/钙交换蛋白之类跨膜转运机制的研究。
染料标记方法1酯标记方法:新一代荧光钙离子探针是由钙螯合剂BAPTA发展而来，有游离酸和乙酰甲氧基酯(acetoxymethyl ester，AM ester) 衍生物两种形式。
游离酸形式有较强的亲水性，不易透过细胞膜，但能与钙结合并产生荧光强度变化，加上亲脂的AM变成酯化形式。
酯化形式的钙荧光指示剂与活细胞一起孵育一定时间后可透过细胞膜进入胞内，胞浆内的酯酶将酯化形式的钙荧光指示剂再水解为游离酸形式，与胞内游离钙结合，可产生荧光强度变化或荧光光谱移动，记录这些改变，依据公式可推算出胞浆内钙离子浓度。
常用某些促分布的药物如一种非离子型表面活性剂PluronicF-127 或Cremophor EL来帮助其通透。
Pluronic F-127是一种非离子型促进分布的药物，能够在生理介质环境中促进大染料分子溶解。
如果需要较长的标记时间则需要在标记液中加入1mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）或1-5%胎牛血清（FCS）来维持合适的渗透压，但FCS有时含有非特异性酯酶能够使AM在进入细胞前已经发生水解。
酯标记方法还可标记整个器官(完整的离体心脏)同时保持其生理状态。
2显微注射:化学荧光钙离子指示剂并不总是细胞通透的酯类形式，一些葡聚糖结合物和发光蛋白的分子量太大，不能通过细胞膜。
用这些指示剂标记细胞时，需要某种特殊的技术。
钙离子指示剂溶解在胞浆样溶液中并充满显微注射针，然后把它直接注入细胞。
这种方法的优点:能够把电荷型的指示剂准确地注入胞浆。
由于它是侵袭性的，需要特殊的仪器和一定的实验技术。
与AM相比，被标记的细胞数目也是有限的(最好的显微注射也只能达到100个细胞/小时) 。
3利用膜片钳技术注射:显微注射技术在大细胞是很有效的，而细胞较小时，注射针会损伤细胞。
将一些染料通过膜片钳针注入细胞，如兴奋细胞(神经元，心肌细胞等)，这种方法不但可用来测定细胞内钙离子浓度，并可同时测定膜电位，记录膜电流。
4 化学标记技术(低钙离子标记)和大量注射：这种方法可同时标记组织器官的许多细胞。
组织首先要暴露在低钙离子灌注液中，使胞浆的膜渗透性提高，将含有指示剂的溶液通过一根玻璃针加压注入细胞。
然后，灌流液的钙离子浓度不断增加到正常的范围。
它的操作比较容易，但可信度没有微注射高。
5通过缝隙连接分布：是将标记钙离子指示剂通过短暂通透的缝隙连接。
酶消化后某些缝隙连接处仍保持着它的通透性，部分对外界溶液(indo1)通过缝隙连接弥散进细胞浆。
这种方法可轻松标记许多种细胞；标记浓度范围变化大时，需仔细校正并估计细胞内钙离子浓度。
6 ATP诱导的通透性7 低渗休克处理(HOST)8 重力标记9 刮除标记10脂转移标记方法11融合细胞杂交12内吞作用和逆行吸收钙离子浓度的计算对于单波长激发或发射的荧光指示剂，可按下式计算[Ca2+]=Kd(F-Fmin) / (Fmax-F)Kd：荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数Fmin和Fmax为最小荧光强度和最大荧光强度测量最大值时，用一种Ca2+促进剂使胞内Ca2+饱和；测量最小值时，用荧光指示剂的淬灭剂Mn2+淬灭荧光来求得最小值。
对于双波长的荧光指示剂，用率比值信号来计算细胞内游离Ca2+浓度，公式如下：[Ca2+] = Kd(Fd/Fs)(R-Rmin) / (Rmax-R)Kd：荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数。
Fd和Fs分别表示荧光剂没有结合Ca2+和被Ca2+饱和时的荧光强度。
R为实验观察到的荧光比值。
Rmin为细胞内荧光剂最小量结合Ca2+时的荧光比值。
Rmax为胞内荧光剂被Ca2+饱和时的荧光比值。
荧光钙离子测定常用仪器1. 荧光显微镜：利用一定波长的光源照射被检物体，使之受激发产生荧光，然后再经显微镜成像镜检。
荧光显微镜可用来分析在单独的完整活细胞中钙离子的分布和功能分子动力学。
由于多种细胞内现象中同时可见许多分子的浓度、分布、功能会同时或相应地发生一系列变化，为了估计这些细胞内现象的机制，需要进行多参数分析。
一些钙离子指示剂的性质受细胞内环境的影响，因此，多参数分析是很必要的。
1.1 多参数数字式录像显微系统（Multiparameter digitizedvideo microscopy）：可允许单一活细胞被多种指示剂标记，系统包括带有微分干涉相差的倒置荧光显微镜、CCD相机（照像机或录像机）、可进行图像处理的计算机工作站、氩离子激发灯（汞灯）、控制系统的主计算机、计算机控制下多位置滤光片转化轮用来在激发光路上放置干涉和中性密度滤光片等，同时采集图像，数字化保存每种指示剂特异的相差、DIC和荧光图像，经图像分析和处理系统可以量化分析在单细胞中的不同参数的空间和时间的分布变化。
1.2 激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）1.3 双光子激发的激光扫描显微镜（Two-photon excitation laser scanning microscopy，TPLSM）1.4 时间分辨-荧光存留时间图像显微镜（Time-resolved fluorescence lifetime imaging microscopy，TRFLM）2. 流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）3. 荧光分光光度计荧光钙离子测定的原理及具体方法实验一荧光分光光度计检测细胞内钙离子浓度实验二倒置荧光显微镜活细胞钙离子测定系统检测细胞内钙离子浓度实验三激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内钙离子浓度实验一荧光分光光度计检测细胞内钙离子浓度Fura-2是第二代Ca2+荧光指示剂，具有荧光强度高，与Ca2+结合能力强，测定方法简便、灵敏、重复性好等优点。
