水稻白叶枯病抗性基因的研究与分子育种

《生物工程进展》1999,V ol.19,No.6水稻白叶枯病抗性基因的研究与分子育种翟文学　朱立煌(中国科学院植物生物技术实验室　北京　100101)由革兰氏阴性菌黄单孢水稻变种(X anthomonas ory z ae pv.ory z ae,X oo)引起的白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害。

白叶枯病是一种维管束病害,自然条件下,病菌通常由水孔或伤口侵入,沿叶脉产生灰白色病斑。

田间常在分蘖期观察到病症,并随植株的生长而发展,至抽穗期达到高峰。

水稻遭受白叶枯病后,一般减产20%—30%,严重时甚至绝收。

白叶枯病最早于1884年在日本福岗地区发现。

50年代以来,发病范围扩大,目前白叶枯病的发生范围已遍及世界各水稻产区[1,2,3]。

由于其危害严重,而化学防治难以奏效,种植抗病品种是经济有效的防治方法,这引起育种家们对抗病性和遗传规律研究的重视。

多年来的研究在理论上和应用上取得了许多进展,主要表现在下面几个方面:从基因对基因的学说解释寄主和病原菌的相互作用,建立了标准的单基因寄主和相对应的病原菌生理小种的鉴别系统;随着水稻基因组研究的开展,通过分子遗传图谱和物理图谱的构建,对抗性基因进行了定位和克隆;利用分子标记辅助选择和基因工程手段,开始了水稻白叶枯病抗性的分子育种工作。

本文将从这几个方面对水稻白叶枯抗性基因的研究与应用进行概述和讨论。

1　水稻对白叶枯病的抗性研究与抗性基因的鉴定 植物抗病性的遗传研究开始于本世纪初叶。

1905年英国遗传学家Biffen通过对小麦抗条锈病的系统研究,证实抗病性是由基因控制,并和其它性状一样是独立遗传的。

与其它作物病害相比,稻白叶枯病的抗性利用开始得较晚。

日本最早利用寄主抗性防治稻白叶枯病,自1923年开始抗病育种以来,自成一套抗病性评价和利用体系。

根据品种对菌群的不同反应,在5个菌群上育成了7个品种抗性群[4]。

并且于1957年当源于农林27的抗性品种“朝风”因新菌系的出现而丧失抗性时,发现了稻白叶枯病菌致病性的专化作用。

从60年代末,国际水稻研究所(IRRI)充分发挥其遗传评价和利用计划中多学科协作的作用,用当时流行的各种白叶枯病原菌系对广泛收集的各国品种进行鉴定,从而鉴定出6个白叶枯病原菌生理小种和100多个抗源。

这些抗源在杂交育种中的广泛使用使抗病育种取得了突破性成就[5]。

在同期,我国和其它水稻主要产国如印度、印度尼西亚、马来西亚、泰国、孟加拉、南朝鲜、越南等也开展了水稻白叶枯病抗性育种研究。

多年的研究表明,水稻白叶枯病是一种寄主性较强的病害。

稻类对白叶枯病的抗性遗传所表现的寄主与病原菌之间的互作,符合典型的基因对基因的关系,也就是水稻白叶枯病菌的毒性是不同的,菌系在不同品种上致病力的差异表现为小种特异性差异,品种携有的主效抗病基因,与所控制的病原菌系是相匹配的。

而且,稻白叶枯病抗性基因有显性和隐性,单基因和多基因[1]。

从60年代末到70年代初,日本用当地菌系研究并命名3个显性抗病基因X a-1(抗日本菌群I)、X a-2(抗日本菌群Ⅰ、Ⅱ)、X a-3(抗日本菌群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。

IRRI用菲律宾小种1鉴定并命名了X a-4、x a-5、X a-6、X a-7、x a-8、x a-9和X a-10等7个抗病基因[6]。

近年来日本菌群已扩展为5个,菲律宾生理小种已扩展到9个。

9在中国方中达等(1990)研究中国各地835个菌系在5个鉴别品种(IR26、Jaw a14、南粳15、Tetep和金刚30)上的反应,将供试菌系分为7致病型(Ⅰ—Ⅶ)[7]。

由于不同国家地区所用的鉴别系统和菌系不同,其鉴定的抗性基因缺乏可比性。

为此日本与IRRI从1982年开始合作,采用统一的方案,利用近等基因系建立了一套国际水稻白叶枯病单基因鉴别系统,对早期命名的21个白叶枯病抗性基因进行整理和统一鉴定[8]。

我国有关单位于也于1991年起开始,共同协作,制定了统一的研究方案,与国际标准接轨,鉴定和分析了地方资源和外引品种的抗性基因[9]。

本文将国际上统一鉴定的稻白叶枯病抗性基因及有关资料列于表1。

由于等位性测定X a-6和x a-9与X a-3系同一位点,且抗性反应类似,不再单独列出。

因此,目前国际上统一鉴定的白叶枯病抗性基因共有19个[10]。

新的白叶枯病抗病基因还在不断地发掘和鉴定,新基因的命名序号已排至23个(章琦,私人通讯)。

表1　白叶枯病抗性基因抗性基因鉴别菌系鉴别品种代表品种染色体定位(紧密连锁标记)X a-1T1(T7174)IRRB1Kogyoku,Java144(Y5212)已克隆X a-2T2(T7147)IRBB2Rantai Em as2,T etep4X a-3T3(T7133)IRBB3Wase Aik oku311(G181)X a-4P1(PXO61)IRBB4T KM6,IR20,IR2211(G181,M55) x a-5P1IRBB5DZI92,IR1545-3395(RG556,RG207)X a-7P1IRBB7DV85x a-8P1IRBB8P1231129X a-10P2IRBB10Cas20911X a-11T1,T2,T3IRBB11RP9-3,IR8X a-12T3Kogyoku,Java144x a-13P6(PXO99)IRBB13BJ1,Ch insurah BoroⅡ8(RZ28,RG136)X a-14P5(PXO112)T N1T aichu ng NativeⅡx a-15日全部菌系,菲P1-P6M41M41(Harebare诱变体)X a-16T5T etep T etep X a-17T2Asominori As ominoriX a-18BM8417,BM8429T oyonish kiIR24,M ilyang23,Toyonis hkix a-19菲P1-P6XM5XM5 (IR24诱变体)x a-20菲P1-P6XM6XM6 (IR24诱变体)X a-21P6(PXO99)IRBB21O.L ong istaminata 11(RG103,B7/B8),已克隆10 近年来,对白叶枯病原菌的分子生物学研究也取得了许多进展,已从X oo病原菌中分离出无毒基因avrx a-5,avrX a-7和av rX a-10[11,12,13]。

无毒基因的克隆证实了X oo与寄主的互作遵循基因对基因的分子机制。

同时,由于无毒基因只在携带相应抗病基因品种上激发抗性反应,用无毒基因鉴定抗性基因更准确,更科学。

2　白叶枯病抗性基因的定位与克隆近年来,采用形态标记和分子标记已把几个白叶枯病抗性基因定位在染色体上。

其中X a1、X a2和X a12定位在第4号染色体短臂上[14,15],X a3、X a4、X a10和X a21定位在第11号染色体短臂上[14,16],x a5定位在第5号染色上[17],x a13定位在第8号染色体上[18]。

在遗传作图的基础上对抗性基因进行了物理作图[19～22]。

进而Song等(1995)采用染色体登陆战略克隆了X a21[23],Yoshim ura等(1998)采用典型的定位克隆战略克隆了X a1[24]。

本文将已定位的白叶枯病抗性基因及其紧密连锁的分子标记列于表中。

并对X a21和X a1两个基因的定位克隆过程进行论述。

X a21最早是在1977年由印度育种学家S.Dev adath等人在非洲马里的长药野生稻中发现的。

菲律宾国际水稻研究所(IRRI)的Khush GS等用长药野生稻与载培品种IR24杂交,回交转育成IR24为遗传背景的籼稻近等基因系IRBB21[25,26]。

X oo抗性鉴定表明, IRBB21对印度和菲律宾所有的生理小种都有抗性。

1990年Khush等人将这一来源于长药野生稻的抗性基因命名为X a21。

Ro nald等[16]利用近等基因系IRBB21与轮回亲本IR24杂交产生的包含386个体的F2群体对X a21基因定位。

在测试了123个RFLP 标记和985个RAPD标记后,获得了三个与X a21基因共分离的分子标记RG103、PAPD818和RAPD248,从而将X a21基因定位在第11号染色体,与三个标记的图距不超过1.2CM。

进一步通过脉冲场电泳进行物理作图,结果表明包含X a21位点与三个紧密连锁标记的渐渗区段大约为800kb。

X a21基因精细定位的完成,为该基因的克隆提供了条件。

进一步地对紧密连锁的分子标记测序发现,RG103含有已知抗性基因共有的LRR结构域。

据此推测RG103为抗性基因或其家族成员的一部分,因此Song等[23]利用RG103作探针从IRBB21细菌人工染色体(BAC)和粘粒文库中筛选出7个同源克隆。

对这些同源克隆亚克隆,并用基因枪转化感病水稻品种台北309,结果表明发现一个9.6kb K p nI片段里含有完整的白叶枯病抗性基因X a21。

序列分析证明,9.6kb Kp nI片段包含一个3075bp的开放阅读框。

No rthern分析证明了该序列的表达,从而确定了X a21基因。

其后不久,Song等[27]还对X a21基因家族的其它成员进行了研究,Wang等[28]克隆了X a21基因家族的另一抗性基因X a21D,该基因具有对白叶枯病的部分抗性。

X a21基因编码一个由1025个氨基酸组成的受体类似的激酶。

与其它植物抗性基因不同, X a21基因产物包含胞外富含亮氨酸-的重复(LRR)结构域和胞内丝氨酸-苏氨酸激酶(STK)结构域两部分。

LRR区是由23个不完全的富含亮氨酸的重复单位组成,参与蛋白质-蛋白质的相互作用,与病原菌的识别有关; ST K结构域含有15个保守氨基酸,是典型的信号分子。

整体上看X a21产物是一个具有激酶活性的跨膜受体。

由于它是唯一一个包含两个结构域的抗性基因,因此属于新的一类(第四类)抗性基因,它的结构对于研究植物抗性基因的作用机制具有重要意义。

X a1的克隆采用了典型的以图谱为基础的克隆战略[24]。

通过遗传作图和物理作图,X a1被定位在一个340kb的YAC克隆,Y5212上[20]。

分离这个区段的cDNA进行精细遗传定位和序列分析,揭示出一个与已知NBS-LRR 类抗性基因同源,具有5406bp的编码序列。

转基因实验证实该序列具有对X oo小种1的抗性,是X a1基因。

11X a1编码的产物与X a21显著不同。

X a1基因产物的结构包含氨基端NBS区和羧基端的LRR,没有明显的跨膜结构域。

因此X a1基因属于NBS-LRR类(第一类)抗性基因,推测X a1蛋白与病原体无毒基因编码的配体的相互作用可能发生在胞质内,类似于抗生基因RP S2和RPM1。