cDNA文库的构建
时间：2006-9-10 来源：生命经纬
分为六个阶段：
阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链
阶段2：cDNA第二链的合成
阶段3：cDNA的甲基化
阶段4：接头或衔接子的连接
阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA
阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接
[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]
1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：
poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl
寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl
1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl
1mol/L KCl 3.5μl
250 mmol/L MgCl2 2μl
dNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L） 10μl
0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位
加H2O至 48μl
2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。
3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。
第二节 cDNA 文库的构建
cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA ,
cDNA）。 cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。 cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。
cDNA 文库的构建
cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：
第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；
第二，第一链 cDNA 合成；
第三，第二链 cDNA 合成；
第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。
图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图
一、 RNA 的分离
cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总 RNA 中所占比例很小，因此从总 RNA 中富集 mRNA 是构建 cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低 rRNA 和 tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。
目前纯化 mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与 mRNA 的 Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住 mRNA ，进而将 mRNA 从其它组分中分离出来的。 1．mRNA 的完整性
指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力， mRNA 的大小，总 mRNA 制剂指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。
2．mRNA 的丰度
高丰度 mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占 50-90% 。
低丰度 mRNA ：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有 mRNA 。
cDNA文库的构建方法与原理
蛋白质是细胞的功能分子：它们构成结构和调控分子，动力和泵蛋白，酶和受体。然而，如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列，或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。如果只限于将基因组DNA作为材料来源，由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质，那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。如果分析仅局限在编码序列，那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板，所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。不幸的是，现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。因此，产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA，由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。
1．基本原理
cDNA（Complementary DNA）是以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的顺序可代表mRNA序列。cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组，然后去转化克隆载体DNA的宿主细胞，从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。其过程可概括为：（1）通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA；（2）cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。
cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途：
首先，cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用，因为它们的增殖并不经过DNA中间体，研究这样的生物有机体，cDNA克隆是唯一可行的方法。
第二，cDNA基因文库的筛选简单易行，恰当选择mRNA的来源，使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的克隆达到很高的比例，简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。
Library construction
试剂
50*TAE 存储液，PH约8.5：
242g Tris 碱
57.1ml 冰醋酸
37.2gNa2EDTA.2H2O
加H2O至1000ml
1*TAE:
200ml 50*TAE
加H2O至10000ml
乙酸钠，3mol/l 存储于4C
将40.8gNaAc.3H2O溶于水，用乙酸调至PH5.2
补加水至100ml
溴化乙锭（EB），10mg/ml
在20mlH2O中溶解0.2g溴化乙锭，均匀后于室温避光保存
1%盐酸
300ml浓盐酸，加H2O至10000ml
第一日
配胶
配置一板1%琼脂糖凝胶
超声
1、 取4-5ug DNA 入 1.5mlEpperdorf管中，共4支
2、 4管DNA分别超声4秒、8秒、14秒、20秒（其中8、14、20秒分多个相同时间段进行，间歇时间为10秒，超声时应将变幅杆居中并伸入液面3mm）
3、 各取10ul 加入2ul 6*loading buffer，上样电泳（1%琼脂糖凝胶），至溴芬蓝泳动7cm，拍照，观察超声效果，8、14秒超声管的DNA片断量应以1.6-3.0kb处最多，而超声时间4、20秒的DNA片段量应以分别在4-10kb和1-1.6kb处最多
4、 根据电泳结果，对个别超声效果欠佳的样品要再次超声，具体时间应根据实际效果而定
注：请详细填写建库组工作日程表
纯化
5、 每管加1/10体积的3MnaAc和2倍体积预冷无水乙醇，-200C 30min
6、 离心：13000rpm,10min。（室温，利于DNA沉淀），去上清
7、 各管加1ml 70% 乙醇，颠倒数次
8、 离心：13000rpm,5min
9、 弃上清，离心机甩一下，吸去上清，置室温15min以使酒精挥发干净
10、 每管加20ul无菌纯水溶解DNA，收集四管中的样品于一管
末端补平
