免疫胶体金标记手册

浙江大学电子显微镜室 浙江大学生物技术研究所 胶体金免疫标记技术培训班

技术资料 胡东维 洪 健 徐 颖 浙江大学 ２001年10月 一、胶体金得制备 根据不同得制备方法,可以制备出直径１-500nm得胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3－3０nm范围内。 在氯化金(HAuＣl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量得还原剂,可以控制所产生得粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂与还原核得数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金得还原也就从更多得还原中心开始,因此产生得胶体金粒子数量越多,但体积也越小、粒子直径每增加一倍,数量减少为原来得1／8。 以柠檬酸钠与单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3～1６nm得胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备得胶体金粒子直径范围较窄,而且残留得多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子得结合。此时在溶液中添加0、１～0.2%得H2Ｏ２能够去除这些残基、双标记或制备5—10 ｎm得胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂,可以制备1２~150 nm直径得胶体金。但制备大体积得胶体金时,胶体金粒子得误差也同时增加、因此做单标记时,建议使用该方法制备１2—１6 ｎm直径得胶体金、 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 ｎm得胶体金,它避免了单宁酸残基得问题,但所形成得金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备得残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(０、５g或1ｇ),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用得可以用1.５ ml试管分装为1 ml保存(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用０.２２ m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。 制备好得胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-２个月、当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～１6 nm胶体金

(1) 取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水与1 ml １%氯化金,预热至60~70℃。 (2) 取一5０ ml烧杯,加入4 ml １％柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量得单宁酸及等量得2５ mM Ｋ２CO3。预热至6０～７0℃、K2CO３得作用就是保持溶液得中性pH。因此如果单宁酸得量少于0.５ ml时,对ｐH得影响不大,Ｋ2CO3可以省略、 (3) 将上两种溶液迅速混合并充分混匀,加热至沸并保温1０分钟、自然冷却。 柠檬酸钠(ml) 单宁酸(l) 胶体金(nm) 4 500０ 3 4 2０00 4 4 5０0 6 4 120 ８ 4 70 １0 ４ 10 １6 2、白磷还原法制备5 ｎｍ胶体金 (1) 取25０ ml三角瓶一个,加7９ ml双蒸水,1 mｌ 1％氯化金,并用0、25 Ｍ K２CＯ3将溶液调至中性(pH7。0)。 (2) 取０、2 ｍｌ饱与磷/乙醚溶液加到1、5 ml试管中,再加0.8 ml乙醚,混匀。取0。７ ml加入溶液(１)中(磷有毒且易燃,操作请带手套,多余得磷溶液用CuSO4进行中与)、 (3) 室温下轻轻摇匀15 min,然后加热沸腾并保持5 mｉn,自然冷却、 3、柠檬酸三钠法制备12－30 nｍ胶体金(Frｅns, 1973)

(1) 取250 mｌ三角瓶一个,加１0０ ｍl双蒸水及１ ml 1%氯化金,加热沸腾; (2) 取不同量得1%柠檬酸钠加入上述溶液中、混匀,再保持沸腾３０ ｍｉｎ,溶液颜色首先变黑,再逐渐变红,粒子体积较小时,溶液呈桔红色,而粒子体积较大时,则颜色偏向紫色。

注 意: (1) 由于使用试剂质量及其它方面可能存在得误差,以及制备过程中得其它问题,胶体金粒子得大小及一致性与理论值可能有偏差,因此,在制备完成后必须进行镜检、如出现粒子体积偏差太大,粒子凝聚,粒子边缘不清晰等问题,须重新制备。 (2) 胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中;也可保存在室温下,一般可保存１—2个月。但决不可保存在

柠檬酸钠(ml) 胶体金(nm) 5 12 4 16 3 24 2、8 30 0℃以下,否则金粒子发生凝聚。 二、蛋白-金复合体得制备

一般认为胶体金粒子表面为一层AuCｌ2,因此,粒子表面带有负电荷,这种负电荷粒子之间相互排斥,形成稳定悬浮得胶体金溶液。 金颗粒表面可以包被一层生物大分子(如蛋白)来稳定与保护这些粒子,以免受外来电解质得影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白得吸附作用取决于pH值,这就是因蛋白得净电荷取决于溶液得pH值,在ｐH=pI时为中性。由于在pＨ=pI时蛋白溶解度最小,因此这时它水化程度最小,最溶液吸附到疏水得金粒子表面、但在实际得胶体金探针制备中,一般胶体金调整为pＨ=PI+0.5,这样蛋白带正电,有利于结合更稳定、 胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理,其目得在于(1)去除高浓度得盐分,高浓度得盐分往往干扰蛋白与胶体金得吸附结合,或导致胶体金粒子得凝聚,这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。(2)使蛋白分子尽量分散为单体,冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子,可同时与多个胶体金粒子结合,影响标记得灵敏度与定量分析。(3)使蛋白具有适当得分子量。蛋白分子量过小(30 ｋＤ),形成得蛋白复合体往往就是不稳定,可短时间内失活。而分子量过大时,被认为影响探针得灵敏度,特别就是已知蛋白得结构与活性中心得情况下,去除对活性武影响得结构部分就是提高标记灵敏度,延长探针寿命(防止凝集)得有效办法、把分子量过小得蛋白与其它蛋白(如ＢSA,牛血清蛋白等)结合后,能制备出稳定性更佳得探针。 当蛋白前处理完成后,接着要确定胶体金与蛋白结合得最佳pH值。对于理化性质不确定得蛋白这一步尤为重要。过量得蛋白与不同pH值得胶体金结合后,只有某一特定pH值能够形成结合最稳定得探针。在高浓度电解质(如NaCl)作用下不会凝聚。不同蛋白得适宜pH范围得宽窄大不相同。一般选择最小适宜pH值为最佳ｐH值。但有些探针得实际情况并不完全如此,最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。 在确定最佳pH值后,最后要确定最小蛋白量,即能够形成稳定探针得蛋白得最小量。如果在制备探针时加入太多得蛋白,不仅造成浪费,而且更为严重得就是容易造成探针凝聚,并严重影响标记活性。因为探针溶液中得游离蛋白容易抢先与标记位点结合,起到“封闭”(Blｏｃkｉng)作用,而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少得情况下要特别注意。 这里需要特别指出得就是,使用不同直径得胶体金与同一蛋白结合时,除了蛋白量完全不同外,往往最佳pH也有一定变化。 因此,在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。 1、抗血清得前处理

一般抗血清中IｇG得含量为１0－２5％,而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想、因此需去除其中多数杂蛋白、但处理环节不宜太繁, 在实验室设备与经验缺乏得情况下更就是如此,否则会导致IgG活性得大幅降低、如果您得实验室在蛋白纯化方面有很强得技术支持,高度纯化后效果会更好、 大量工作表明,只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性得IｇＧ蛋白。其基本步骤如下: (1) 取抗血清０。2 ｍl; (2) 加生理盐水(０、85％ NaCl)0、3 ｍl,混匀; (3) 逐滴加入饱与 (NＨ4)２ＳO4 0。5 mｌ,充分振荡混匀,４℃静置1 h; (4) 10000 rｐm／min离心２０ ｍin,弃上清; (5) 加0。5 ml生理盐水重悬浮,混匀; (6) 逐滴加0.25 ｍl饱与 (NＨ4)２SO4,充分振荡混匀,4℃静置1 h; (7) １0000 rpm/ｍｉn离心20 min,弃上清; (8) 重复5~8步骤一次; (9) 加生理盐水０.5 ml重悬浮,混匀; (10) 生理盐水中透析12～24 h; (11) 在0。2 M pＨ ９.0硼酸缓冲液透析1２~24 h; (12) 分装,即将使用时4℃保存,备用-20℃保存、 为最大限度保持抗体活性,整个过程应在4℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存得血清,将生理盐水透析改为3 M KCＮＳ透析,促使聚合得多聚体解聚、如果抗血清效价较低时,不宜准备胶体金探针。 ２、亲与纯化抗体得处理

亲与纯化抗体多就是一些商品化得通用抗体,即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人得抗体。这些抗体一般有两个问题,一就是IgG分子往往聚集为多聚体分子,二就是往往含有较多得盐分。因此前处理得目得在于脱盐与解聚。 其基本步骤如下: (1) 将亲与纯化抗体用生理盐水稀释为0。5—1 ｍg/ml浓度 (2) 在3 M ＫCNＳ(硫氰酸钾)溶液中透析１2 h (3) 在2 mMol pH ９。０得硼酸缓冲液中透析1２ h(更换透析液数次) (4) 分装备用 其它蛋白可参考此方法进行、但注意后一种透析液得pＨ值应与交联时ｐＨ值一致。在实际运用中,一般省略去3Ｍ ＫCＮS透析这一步,特别就是当蛋白分子量较小,且为非糖蛋白时。我们建议在制备通用探针(如二抗ＩgG,Prｏtein A,Prｏtein G,Ｓｔrｅptaviｄiｎ)等时,严格使用该方法,而制备直接标记探针时,也可以忽略处理步骤。 3、IｇＧ Ｆab片段得制备

一般来说体积较小得探针具有相对较高得标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中得扩散运动;在胶体金直径一定时,蛋白分子量越小,金表面吸附得蛋白分子越多,活性位点也越密集,也容易于靶位点结合、