蛋白质组学及其技术发展

综述doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2010．01．034蛋白质组学及其技术发展王英超1，2，党源1，李晓艳2，王兴龙21．吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062；2．军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130062［摘要］蛋白质组学产生于20世纪90年代，发展至今已日趋成熟。

蛋白质组学是以生物体的全部或部分蛋白为研究对象，研究它们在生命活动过程中的作用、功能。

蛋白质组学较之前的基因组学对于生命现象的解释更直接、更准确，近年得到了快速发展，并受到世界各国学者的高度关注。

我们简要综述了蛋白质组学及其技术，并简单概述了这项技术在生命科学领域的应用。

［关键词］蛋白质组学；双向电泳；质谱；生物信息学［中图分类号］Q81［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2010)01－0139－06 Proteomics and the development of Proteomics TechniquesWANG Ying－Chao1,2,DANG Yuan1,2,LI Xiao－Yan1,WANG Xing－Long21．College of Animal Science and Veterinary Medicine,Jilin University,Changchun130062;2．Institute of Animal Science,Academy of Military Medical Sciences,Changchun130062;China［Abstract］Proteomics was born in the1990s,and became more and more mature．All or parts of proteins from organism were studied by proteomics．The fundamental role of proteins in supporting life was recognized．Proteomics was more directly and exactly to interpret the activity of life than genomics．So proteomics grew much faster and received so much attention from worldwide scientists in the near years．In this review,the definition of proteomics was first explained,the theories and the applications of many proteomics techniques were also introduced．［Key words］proteomics;two dimensional electrophoresis;mass spectrum;bioinformatics21世纪的生命科学研究是一个以“组学”为基本研究单位的高通量研究时代，主要包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、糖组学、酶组学等。

因为蛋白质是生物体行使其功能的基本单位，而蛋白质组学是在蛋白质的整体水平上对生物体进行研究，因此蛋白质组学的研究可能更好地帮助人们了解生命的本质，各器官的分子结构、功能及其行使该功能的机制等。

也因此，该理论及其技术受到各国学者的高度重视并得到了蓬勃的发展。

2001年的Science杂志已把蛋白质组学列为六大研究热点之一，蛋白质组学研究已成为21世纪生命科学的重要战略前沿[1]。

1蛋白质组学的定义1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组（proteome）这个概念，该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成，并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”[2]。

然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的，而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。

目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质[3]。

蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。

2从基因组到蛋白质组人类基因组学计划使我们对人类的基因组有了更深入的了解。

但是单从基因序列预测基因的功能还是比较困难的，因而产生了多种基于基因组序列下游分析的学科，主要包括转录组学、蛋白质组学、［收稿日期］2009－09－11［基金项目］国家重点基础研究发展计划（2006CB504400）［作者简介］王英超（1983－），男，博士研究生［通信作者］王兴龙，（E－mail）wangxl－2006＠163．com代谢组学等，统称为功能基因组学。

转录组学主要是对基因在不同情况下的转录及转录后加工进行研究；蛋白质组学主要是对蛋白质的加工、修饰以及蛋白质之间的相互作用进行研究；代谢组学则是关于定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学。

除了代谢组学是在生物体层面进行研究外，基因组学、转录组学和蛋白质组学均在分子水平上进行研究。

蛋白质组学是分子研究终点，也是对生物体性状的最直接反映，同时也是目前研究最多、成果较丰富的学科。

3蛋白质组学的分类根据研究目的的不同，可将蛋白质组学分为蛋白表达蛋白质组学、功能蛋白质组学、转录后加工蛋白质组学、结构蛋白质组学[4]。

表达蛋白质组学研究差异样品间蛋白表达量的变化，因此可以用表达蛋白质组学对整体或局部的蛋白表达情况进行比较、分析。

利用这种方法找到的信息可以鉴定信号转导中的特殊蛋白，还可以鉴定与疾病有关的蛋白等。

结构蛋白质组学的目的是描绘出蛋白质复合体的结构图，亦或描绘出存在于特殊细胞器上的蛋白图谱（又被称为细胞图谱[5]）。

结构蛋白质组学试图鉴定出一个蛋白复合物或一个细胞器的所有蛋白，测定它们的位置、特性，研究蛋白质间的相互作用。

例如对核孔复合体的研究[6]。

特异性地分离亚细胞器或蛋白复合体，可以很大程度地简化蛋白质组学分析[7]。

结构蛋白质组学所得到的信息可以帮助我们很好地理解细胞的整体结构，并且有助于解释某一特定蛋白的表达对细胞产生的特定作用。

功能蛋白质组学是一个宽泛的术语，包含许多详细的、直接的蛋白质组学方法。

有时为了进一步的分析，还需要使用亲和层析技术对特异性亚蛋白组进行纯化。

功能蛋白质组学的方法可以更好地分析、阐明被选择的蛋白组分的特征与功能，还可以提供关于蛋白质信号、疾病机制或蛋白类药物相互作用的重要信息。

4蛋白质组学技术蛋白质组学的发展有赖于一整套技术，这些技术按照其流程主要包括如下几类。

4．1蛋白质分离技术这类技术主要是电泳，其中应用最多的是双向电泳技术，其他还有SDS－PAGE、毛细吸管电泳等。

除了电泳外还有液相色谱，通常使用高效液相色谱（HPLC）和二维液相色谱（2D－LC）。

另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。

4．1．1双向凝胶电泳（two－dimensional gel elec-trophoresis，2DE）这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术，产生于20世纪70年代中叶[8－9]，但主要的技术进步（如实验的重复性、可操作性，蛋白质的溶解性、特异性等）是在近10年取得的。

双向电泳是通过蛋白质的等电点（pI）和相对分子质量的不同而将蛋白高通量地分离。

首先将制备好的样品进行等电聚焦电泳，在这个过程中需要使用固定pH梯度的干胶条。

这种胶条目前多为商业产品，是将pH 梯度凝胶固定在塑料支持模上，有不同pH值范围的胶条。

最常用的2种胶条是pH3～10和pH4～7的胶条。

当电场作用于胶条上时，存在于胶条内的带点的蛋白质便根据其所带电荷的正负而反向移动，在移动中蛋白的带电量逐渐减小，直到移动到该蛋白不带电时为止。

这时的蛋白质便迁移到了它的等电点处；然后将第一向电泳后的胶条经2次平衡后转移到第二向电泳SDS－PAGE，将蛋白按照相对分子质量的不同而分开[10－12]。

双向电泳之后的工作便是染色，主要分为考马斯亮蓝染色法和银染法、锌染法、Ruby荧光染色法，它们各有优缺点。

考马斯亮蓝染色法的优点是线性范围广，缺点是灵敏度低、需要大量的样品；银染法灵敏度高但线性范围窄，容易造成“火山口”效应；锌染法与银染法类似；荧光染色法相对于前几种来说具有灵敏度适中、线性范围广等优点，但其造价昂贵，需使用特殊仪器且操作复杂。

考虑到实验成本与后续质谱实验的特殊性，通常使用考马斯亮蓝染色法或经过修改的银染法（可以与质谱兼容）。

4．1．2双向荧光差异电泳（two－dimensional differ-ence gel electrophoresis，2D－DIGE）2D－DIGE分析系统是在传统双向电泳技术的基础上，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念，极大地提高了结果的准确性、可靠性和重复性。

在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，且软件自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，这样可以很好地去除样品的假阳性差异点。

DIGE技术可检测到表达差异小于10％的蛋白，统计学可信度达到95％以上。

利用Ettan DIGE技术还可以对微量（少到5μg）样品进行蛋白质组学分析。

2D－DIGE的具体操作过程与常规2DE的步骤相似，所不同的就是在样品制备时，在每份样品中预先分别加入不同的荧光染料，并且需要制作一个供其他样品比较的内参，另外在电泳后的凝胶显色时需要在特殊的荧光检测仪中进行。

4．1．3液相色谱高效液相色谱因具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广等特点，广泛应用于生产实践中。

高效液相色谱是利用高压输液泵驱使带有样品的流动相通过装填固定相的色谱柱，利用固液相之间的分配机理对混合物样品溶液进行分离的方法。

例如对奶粉中三聚氰胺的检测[13]。

二维或多维液相色谱，是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。

样品经过第一维的色谱柱进入接口中，通过浓缩、捕集或切割后被切换进入第二维色谱柱及检测器。

二维液相色谱通常采用两种不同的分离机理分析样品，即利用样品的不同特性把复杂混合物（如肽）分成单一组分，这些特性包括分子尺寸、等电点、亲水性、电荷、特殊分子间作用（亲和）等。

在一维分离系统中不能完全分离的组分，可能在二维系统中得到更好的分离，分离能力、分辨率得到极大的提高。

完全正交的二维液相色谱，峰容量是两种一维分离模式单独运行时峰容量的乘积。