利用SLAF-seq技术开发新寡核苷酸探针鉴定小麦背景中的黑麦染色体

抗病小黑麦异染色体系的创制与鉴定小黑麦（Triticum timopheevii Zhuk.）是一种具有较强抗病性的小麦近缘物种，其对于抗病性的研究与利用一直备受关注。

小黑麦作为野生近缘种，其遗传背景相对复杂，同时其异染色体的研究在很长一段时间内并不够深入。

对小黑麦异染色体系进行创制与鉴定，对于深入挖掘小黑麦的遗传资源以及其抗病性基因的开发具有重要意义。

一、小黑麦的抗病性及其基因资源小黑麦作为野生近缘种，其抗病性水平相对较高，在小麦抗病育种中具有极大的潜力。

其主要表现在对于小麦锈病、白粉病、赤霉病等多种病害的高抗性。

由于小黑麦与小麦属于不同的染色体组，因此通过小黑麦与小麦的杂交，可以将小黑麦的抗病性相关基因导入到小麦中，从而提高小麦的抗病性。

二、小黑麦异染色体系的创制小黑麦是一种具有2n=4×=28条染色体的四倍体植物，其基因组包括了A、B两个亚基因组，分别对应着小麦的A、B两套染色体。

小黑麦还含有数条来自于野生千粒的球小麦的小染色体，即小黑麦的异染色体。

为了创制小黑麦的异染色体系，首先需要利用小黑麦与小麦进行杂交，得到相应的杂种后代。

然后通过染色体分析与分离技术，将小黑麦的异染色体与小麦的染色体分离开来。

通过对分离的异染色体进行鉴定、标记以及遗传分析，建立小黑麦的异染色体系。

针对小黑麦异染色体系的创制，需要综合运用细胞学、分子遗传学、分子生物学等多种技术手段，通过对异染色体的观察与分离，挖掘出小黑麦的抗病性相关基因，从而为小麦抗病育种提供一定的理论与技术支持。

小黑麦的异染色体系统在育种实践中具有重要的应用价值，因此对其进行准确鉴定是十分必要的。

通过对异染色体进行鉴定，可以帮助我们确定小黑麦的染色体组成，明确其遗传属性，为其在小麦抗病育种中的应用提供科学依据。

小黑麦的异染色体鉴定主要包括两个方面，一是对其异染色体的数量、形态、大小等进行观察与描述，二是通过染色体标记技术，对异染色体进行特异性标记。

摘要黑麦5R染色体带有小麦条锈病抗性基因，具有育种价值。

本研究利用SLAF-sequence测序技术和小麦-黑麦MA1R Ku-MA7R Ku单体附加系开发黑麦5R Ku染色体特异分子标记，利用非变性荧光原位杂交（ND-FISH）技术鉴定小麦-黑麦5R Ku(5B)代换系及黑麦5R Ku缺失系，并考察它们的条锈病抗性；利用5R Ku缺失系对5R Ku特异标记和条锈病抗性基因进行染色体区段定位；另外，对获得的5R Ku(5B)二体代换系的染色体的减数分裂行为进行了观察，对其自交后代进行了ND-FISH鉴定，结果如下：1.开发了114对5R Ku染色体特异分子标记；2.使用小麦-黑麦二体附加系DA1R I-7R I、DA1R Ki-7R Ki和单体附加系MA1R PI613196-7R PI613196及其黑麦亲本对5R Ku特异分子标记进行多态性验证，其中100个标记具有多态性；3.鉴定出了5R Ku(5B)二体代换系、5RL Ku(5B)双端体代换系、5RS Ku(5B)单端体代换系、5RS Ku.5BL易位系以及4种5R Ku缺失系。

根据探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pSc200和Oligo-pSc250的信号位点以及缺失系的断裂位点，将5R Ku染色体分为S1、S2.1、S2.2、L1.1、L1.2、L2.1、L2.2、L3.1和L3.2九个区段。

4种5R Ku缺失系分别缺失了S1-S2.1、L1.2-L3.2、L2.2-L3.2和L3.2区段。

因此将这4种缺失系分别命名为DEL5RS S1-S2.1、DEL5RL L1.2-L3.2、DEL5RL L2.2-L3.2和DEL5RL L3.2。

利用这些缺失系，将5R Ku特异分子标记分别定位到S1-S2.1、S2.2、L1.1、L1.2-L2.1、L2.2-L3.1和L3.2六个区段；4.对所获得的材料进行了条锈病的抗性鉴定，结果表明：5R Ku单体附加系、5R Ku(5B)二体代换系、5RL Ku(5B)双端体代换系、DEL5RS S1-S2.1缺失系、DEL5RL L2.2-L3.2和DEL5RL L3.2中抗条锈病，5RS Ku.5BL易位系、5RS Ku(5B)单端体代换系和DEL5RL L1.2-L3.2缺失系都高感条锈病，因此将抗条锈病基因初步定位到L1.2-L2.1区段；5.5R Ku(5B)二体代换系的减数分裂中期I有5R Ku单价体的出现，后期I和末期I 都能观察到落后小麦染色体；在其自交后代中，发现了1A/1B、5A/5D、1B/1D、4B/7D、4B/4D等小麦染色体间的易位及5R/6A易位染色体，小麦染色体间的易位频率为5.94%，小麦与黑麦染色体的易位频率为0.50%。

小麦条锈病抗性基因定位及分子标记技术研究进展作者：杨芳萍曹世勤郭莹杜久元鲁清林吕迎春白斌周刚张文涛马瑞何瑞来源：《寒旱农业科学》2024年第01期摘要：条锈病流行对小麦生产造成巨大损失，选育和种植持久抗性品种是防治小麦条锈病最经济有效的策略。

为达到多基因聚合培育持久抗病品种的目标，必须不断发掘抗病种质、解析其抗病遗传机制并开发分子标记。

基于文献，对条锈病抗性基因发掘涉及的抗病性、分子标记、基因定位方法和定位进展及其在育种中的应用进行了综述，明确了小麦条锈病基因定位涉及技术的现状、局限性及优势，从而为后续的条锈病抗性基因发掘、多基因聚合和持久抗性小麦品种的选育与生产布局提供技术指导，以降低西北麦区和小麦主产区条锈病流行的频率，进一步促进国家粮食安全。

关键词：小麦；抗条锈基因；分子标记；连锁和关联分析；测序技术；育种应用中图分类号：S512.1 文献标志码：A 文章编号：2097-2172（2024）01-0001-10doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.01.001Research Progresses on Mapping of Wheat Stripe RustResistance Genesand Molecular MarkersYANG Fangping 1， 2， CAO Shiqin 2， GUO Ying 2， DU Jiuyuan 2， LU Qinglin 2， LV Yingchun 3， BAI Bin 2，ZHOU Gang 2， ZHANG Wentao 2， MA Rui 2， HE Rui 2（1. Institute of Agricultural Economics and Information， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;2. Wheat Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;3. Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu730070， China）Abstract： The epidemics of stripe rust cause significant yield losses in wheat production. Breeding and cultivation of durably resistant varieties are the most cost-effective strategy forcontrolling wheat stripe rust. To achieve the goal of breeding durably resistant varieties through multi-gene pyramiding， it is necessary to continuously explore disease-resistant germplasms， decipher their resistant genetic mechanisms and develop molecular markers. This paper summarized the research progresses of stripe rust resistance， molecular markers， gene mapping methods， and their application in breeding related to the identification of stripe rust resistant genes to further clarify the status， limitations， and advantages of association mapping technologies for mapping of stripe rust resistance genes. This paper aims to provide technical guidance for the subsequent discovery of stripe rust resistance genes， multi-gene pyramiding， and the breeding and production arrangement of durably resistant wheat varieties to reduce the frequency of stripe rust epidemics in the northwestern wheat region and major wheat producing areas to further guarantee national food security.Key words： Wheat; Resistance gene to stripe rust; Molecular marker; Linkage and association analysis; Sequencing technique; Breeding application小麦是世界上分布最广、种植面积最大、总贸易额最多的粮食作物，为人类提供了20%的热量和25%的蛋白质。

基于纤毛鹅观草特异的卫星重复序列开发寡核苷酸探针程梦豪;Miroslava Karafiatova;孙昊杰;Kate Arina Holušva;Jaroslav Dolezel;宋新颖;王海燕;王秀娥【期刊名称】《南京农业大学学报》【年(卷),期】2022(45)3【摘要】[目的]本文旨在开发纤毛鹅观草特异的寡核苷酸(oligonucleotide,oligo)探针,进一步完善纤毛鹅观草染色体鉴定技术。

[方法]利用前期选育的普通小麦-纤毛鹅观草异附加系DA2S^(c)L和DA6S^(c),通过流式分拣和基因组二代测序获得纤毛鹅观草染色体6S^(c)和染色体臂2S^(c)长臂的基因组序列,利用Repeatexplorer2/TAREAN软件从中鉴定出卫星重复序列并设计成oligo探针,通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)分析所开发oligo探针的应用价值。

[结果]从6S^(c)和2S^(c)L基因组序列中共鉴定出11个卫星重复序列并开发成11个oligo探针,oligo-FISH结果表明,其中6个探针可以在纤毛鹅观草染色体上产生明显杂交信号,而在小麦染色体上未产生明显杂交信号,可用于特异鉴定小麦背景中的纤毛鹅观草染色体或片段。

对1套普通小麦-纤毛鹅观草异附加系oligo-FISH分析发现,oligo-2S^(c)L^(-1)63和oligo-6S^(c)-111仅在S^(c)基因组染色体上产生明显信号,可作为纤毛鹅观草S^(c)组特异探针;将oligo-2S^(c)L-161和oligo-2S^(c)L-163组合,对1整套二体异附加系进行双色oligo-FISH,构建了纤毛鹅观草染色体的oligo-FISH核型。

[结论]本研究提供了纤毛鹅观草重复序列组成的初步信息,开发的探针能特异鉴定纤毛鹅观草染色体,阐明纤毛鹅观草2个基因组的来源和分化,对推动纤毛鹅观草优异基因的转移和利用有重要意义。

麦类作物学报　２０２３，４３（６）：６７８－６８４ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｉｔｉｃｅａｅＣｒｏｐｓｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９ １０４１．２０２３．０６．０２网络出版时间：２０２３ ０５ ２４网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ２／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０２３０５２３．０９３４．００４．ｈｔｍｌ聚合７犗犈亚基１犅／１犚易位系材料的创制及其品质研究收稿日期：２０２２ ０５ ０７ 修回日期：２０２２ ０９ １４基金项目：河北省重点研发项目（２０３２６３４８Ｄ）；河北省农林科学院基本科研业务费项目（２０２１１１０２０５）第一作者Ｅ ｍａｉｌ：５９８３００２８９＠ｑｑ．ｃｏｍ（姚楚玄）；１３７７３７４９２３＠ｑｑ．ｃｏｍ（张磊，与第一作者同等贡献）通讯作者：柴建芳（Ｅ ｍａｉｌ：ｃｈａｉ８７６５２１３０＠１６３．ｃｏｍ）姚楚玄１，２，张磊１，秘彩莉２，周硕１，董福双１，刘永伟１，杨帆１，焦博１，柴建芳１（１．河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所／河北省植物转基因中心，河北石家庄０５００５１；２．河北师范大学生命科学学院，河北石家庄０５００２４）摘　要：为提高小麦１Ｂ／１Ｒ易位系的加工品质，本研究选用高分子量麦谷蛋白亚基组成为１／７＋９／２＋１２的小麦１Ｂ／１Ｒ易位系品种科农１９９为母本，与高分子量麦谷蛋白亚基组成为１／７ＯＥ＋８ ／５＋１０的强筋春小麦品种津强６号杂交，利用分子标记在Ｆ４代株系中筛选到一个７ＯＥ亚基基因与黑麦碱基因聚合在同一条染色体上的１Ｂ／１Ｒ易位系材料。

ＰＣＲ结果显示，该聚合材料和非聚合材料在Ｇｌｕ Ａ１和Ｇｌｕ Ｄ１位点没有差异。

在温室种植条件下，对这些聚合材料和非聚合材料及其亲本进行麦谷蛋白溶胀指数（ＳＩＧ）测定，结果表明，与１Ｂ／１Ｒ易位系亲本科农１９９比较，聚合５＋１０优质亚基后ＳＩＧ值显著提高，聚合７ＯＥ优质亚基后，ＳＩＧ值进一步显著提高，部分聚合材料达到了强筋亲本津强６号的水平。

麦类作物学报 2024,44(1):46-55J o u r n a l o fT r i t i c e a eC r o ps d o i :10.7606/j.i s s n .1009-1041.2024.01.06网络出版时间:2023-12-08网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1359.S .20231206.1722.002黑麦M I K C 型M A D S -b o x 家族基因的鉴定和表达分析收稿日期:2023-06-19 修回日期:2023-09-28基金项目:中央引导地方科技发展资金项目(236Z 6303G );河北省科技厅重点研发项目(21326340D );河北省高校基本科研业务费项目(2022J K 04)第一作者E -m a i l :180********@163.c o m (汪凯旋)通讯作者E -m a i l :t x a m e u px @163.c o m (魏莱)汪凯旋,车永和,杨赟杰,杨静,杨燕萍,魏莱(河北科技师范学院农学与生物科技学院/河北省作物逆境生物学重点实验室,河北秦皇岛066000)摘 要:M I K C 是MA D S -b o x 蛋白家族中一类保守的转录因子家族,参与调控植物的开花时间和花器官发育㊂通过对黑麦M I K C 基因家族的分析,为研究黑麦各时期组织器官的功能奠定基础㊂利用P F a m 和B L A S T P 两种方法确定黑麦M I KC 家族共47个蛋白序列,将以上蛋白序列利用T B t o o l s 软件进行理化性质㊁进化关系㊁保守基序和基因结构㊁共线性及聚类分析等生物信息学分析㊂将黑麦47个M I K C 基因分为12个亚家族,共线性分析发现黑麦与小麦的共线性基因多于黑麦与水稻间的共线性基因,说明黑麦与小麦的亲缘关系更近㊂聚类结果结合黑麦物种内共线性分析发现,S c M I K C 31基因仅在穗子表达,于其他植物组织器官及发育时期均无表达,选用课题组材料进行R N A -s e q 验证,结果与生物信息学结果一致,推测S c M I K C 31基因为黑麦中与开花有关的基因㊂以上结果说明M I K C 家族基因在黑麦中存在功能分化,为进一步研究该家族基因的功能提供信息参考㊂关键词:生长因子;黑麦;进化分析;表达分析;M I K C 基因中图分类号:S 512.5;S 330 文献标识码:A 文章编号:1009-1041(2024)01-0046-10I d e n t i f i c a t i o n a n dE x p r e s s i o nA n a l y s i s o fM I K C M A D S -B o xG e n e F a m i l y i nR ye W A N G K a i x u a n ,C H EY o n g h e ,Y A N GY u n j i e ,Y A N GJ i n g ,Y A N GY a n p i n g,W E IL a i (C o l l e g e o fA g r o n o m y a n dB i o t e c h n o l o g y ,H e b e iN o r m a lU n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y /H e b e iK e y L a b o r a t o r yo fC r o p S t r e s sB i o l o g y ,Q i n h u a n gd a o ,He b e i 066000,C h i n a )A b s t r a c t :M I K C i s a c o n s e r v e d t r a n s c r i p t i o nf a c t o r f a m i l y i n t h eMA D S -b o x p r o t e i n f a m i l y,i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o no f f l o w e r i n g t i m ea n df l o r a l o r g a nd e v e l o p m e n t i n p l a n t s .T h ea n a l ys i so f t h e M I K C g e n e f a m i l y i n r y e l a y s t h e f o u n d a t i o n f o r t h e s t u d y o f t h e f u n c t i o n o f t h e r y e t i s s u e s a n d o r g a n s a t v a -r i o u s s t a g e s .P F a m a n dB L A S T P m e t h o d sw e r eu s e dt o i d e n t i f y 47p r o t e i ns e q u e n c e so f r ye M I K Cf a m i l y ,a n dT B t o o l s s o f t w a r ew a s u s e d t o c o n d u c t p h y s i c o -c h e m i c a l p r o p e r t y,e v o l u t i o n ,c o n s e r v a t i v e m o t i f a n d g e n e s t r u c t u r e ,c o l l i n e a r i t y ,c l u s t e r a n a l y s i s o f t h e a b o v e p r o t e i n s e qu e n c e s a n d o t h e r b i o i n -f o r m a t i c s a n a l y s i s .T h e 47M I K C g e n e s i n r y ew e r e d i v i d e d i n t o 12s u b f a m i l i e s .T h e c o l l i n e a r i t y a n a l -y s i s s h o w e d t h a t t h e c o l l i n e a r i t yg e n e sb e t w e e nr y e a n dw h e a tw e r em o r e t h a nt h e c o l l i n e a r i t yge n e s b e t w e e n r y e a n d r i c e ,i n d i c a t i n g t h a t t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n r ye a n dw h e a tw a s c l o s e r .T h e c l u s t e -r i n g r e s u l t s c o m b i n e dw i t h t h e c o l l i n e a r i t y a n a l y s i sw i t h i n r y e s pe c i e sf o u n d t h a t S c M I K C 31g e n ew a s o n l y e x p r e s s e d a t th e s pi k e ,a n d i tw a s n o t e x p r e s s e d i no t h e r p l a n t t i s s u e s a n do r g a n s a n d a t t h e d e -v e l o p m e n t a l s t a g e .M a t e r i a l s f r o mt h e r e s e a r c h g r o u p w e r e s e l e c t e d f o rR N A -s e q a n a l ys i s ,a n d t h e r e -s u l t sw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h eb i o i n f o r m a t i c sr e s u l t s .T h e r e f o r e ,i tw a ss p e c u l a t e dt h a t S c M I K C 31g e n e i s a f l o w e r i n g r e l a t e d g e n e i n r y e .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h eM I K C f a m i l y ge n e s h a v ef u n c t i o n -a l d i f f e r e n t i a t i o n i n r ye ,w h i c h p r o v i d e i nf o r m a t i o na n d r e f e r e n c e f o r f u r t h e r r e s e a r c ho n t h e f u n c t i o no f t h i s f a m i l yg e n e.K e y w o r d s:G r o w t h f a c t o r s;R y e;R e v o l u t i o n a r y a n a l y s i s;E x p r e s s i o na n a l y s i s;M I K C g e n eM I K C是MA D S-b o x蛋白家族中一类具有MA D S和K-b o x结构域的植物特异转录因子㊂研究发现,MA D S-b o x转录因子在调控植株的生长发育,尤其是在花器官形成中发挥重要作用㊂MA D S-b o x分为M I K C型和M I K C C型两类[1-2]㊂目前有关M I K C家族的研究已在茄子[3]㊁甘蓝型油菜[4]㊁玉米[5]㊁小麦[6]㊁花生[7]㊁番茄[8]㊁鹅掌楸[9]等植物上开展和报道㊂按照系统进化分类,M I K C类MA D S-b o x转录因子家族可分为s u p p r e s s o r o f o v e r e x p r e s s i o n o f c o n s t a n s(S O C)㊁s e p a l l a t a/a g a m o u s-l i k e g e n e 2(S E P/A G L2)㊁a g a m o u s-l i k e g e n e17(A G L17)㊁s h o r t v e g e t a t i v e p h a s e(S V P)㊁p i s t i l l a t a(P I)㊁a p-e t a l a3(A P3)㊁g n e t u m g n e m o n m a d s13 (G GM13)㊁a g a m o u s-l i k e g e n e6(A G L6)㊁a g a-m o u s-l i k e g e n e12(A G L12)㊁a g a m o u s(A G)和s q u a m o s a/a p e t a l a1(S Q U A/A P1)亚家族[10]㊂编码M I K C蛋白的基因在不同的物种中具有不同的名称,在拟南芥和温带植物(小麦㊁大麦)中,含有名称相同但所示基因不同的春化基因,如V R N1和V R N2,参与了春化的遗传网络[11],春化介导开花的遗传路径在不同植物中存在明显的差异㊂例如,F L C为拟南芥的开花抑制基因,当其在春化过程中受到抑制时,则会启动春季花的转变㊂在拟南芥中,控制开花转变的基因不仅有F L C亚家族的基因,S V P和S O C亚家族的基因也和其开花转变有关㊂相反,温度升高时诱导开花促进基因V R N1保持较高的转录水平,从而为小麦和大麦春季开花提供保障㊂在小麦中, V R N1编码一个类似A P1的MA D S-b o x转录因子,在春化过程中被诱导,促进营养发育到生殖发育的转变㊂V R N2编码一种锌指蛋白,是一种开花阻遏因子,可以延迟开花直到植物春化㊂V R N3编码一种聚乙醇结合蛋白,它的表达受光周期和春化的介导,并加速开花㊂水稻MA D S-b o x基因家族也具有调控开花的作用[12]㊂黑麦(S e c a l e L.,2n=2x=14)是一种二倍体生物,隶属于小麦族(小麦科)小麦亚族(T r i t i c i-n a e),是小麦的近缘物种之一,其M I K C基因家族先前未被研究㊂本研究中,采用多种生物信息学方法对黑麦基因组的M I K C基因家族进行了分析,为进一步探索编码M I K C蛋白的基因功能奠定了基础㊂首先,从基因组筛选得到黑麦中编码M I K C蛋白的基因㊂其次,对这些基因的理化性质有关数据进行了处理,然后对其进行系统发育分析㊂最后,分析了它们在正常生长条件下不同发育阶段根㊁叶和穗子等不同组织的表达谱㊂本研究结果不仅对黑麦M I K C家族的功能研究提供基础,还可以为通过基因改善黑麦的春冬性研究提供参考㊂1材料及方法1.1黑麦M I K C家族基因鉴定本研究采用两种方法鉴定威宁黑麦(W e i n i n g r y e)M I K C家族成员㊂第一步,通过P F a m下载M I K C 蛋白的M A D S(P F00319)和K-b o x(P F01486)结构域的H MM模型,利用H MM E RV3.0程序搜索黑麦蛋白㊂第二步,从P l a n t T F D B下载拟南芥M I K C 蛋白序列,以拟南芥M I K C蛋白为参考序列,于N C B I中对黑麦全基因组蛋白质进行本地B l a s t p,得到候选蛋白序列㊂两个结构域都包含的蛋白为黑麦M I K C蛋白,结合上述两种方法,对所有鉴定出来的蛋白序列在N C B I中C D D[13]在线网站确定保守结构域,最终得到确切的黑麦M I K C蛋白,在E x P A S y网站对蛋白的等电点等理化性质进行分析㊂1.2黑麦M I K C蛋白系统进化分析利用从P l a n t T F D B(h t t p://p l a n t t f d b.c b i.p k u.e d u.c n/)下载的76个拟南芥和51个小麦的M I K C蛋白序列,以及鉴定出来的黑麦M I K C蛋白序列,基于M E G A[14]的邻近法构建物种间系统进化树,1000次B o o t s t r a p抽样,分析其系统发育关系㊂1.3基因结构、保守基序和黑麦的共线性分析利用G E N ES t r u c t u r eD i s p l a y S e r v e分析外显子-内含子结构[15]㊂用M E M E进行保守基序分析,默认参数,参数设置为基序长度(最长100个氨基酸),最大基序数量设置为10,利用T B t o o l s中的G e n eS t r u c t u r eV i w e r进行可视化[16-17]㊂用M C-S c a n X获取M I K C家族种间共线性关系,并利用T B t o o l s软件D u a l S y n t e n y P l o t程序对物种间的结果可视化㊂㊃74㊃第1期汪凯旋等:黑麦M I K C型MA D S-b o x家族基因的鉴定和表达分析1.4黑麦M I K C基因表达分析及验证在小麦多组学网站W h e a t O m i c s[18]数据库(h t t p://w h e a t o m i c s.s d a u.e d u.c n/)下载威宁黑麦(W e i n i n g r y e)不同组织的转录表达谱数据,通过T B t o o l s软件绘制黑麦M I K C基因的表达热图㊂为验证以上生物信息学所分析的黑麦M I K C 基因表达量的变化,大田种植3个春秋播农艺性状差异较大的冬性㊁半冬性黑麦品系89R66㊁90R32㊁90R2用于试验验证,试验材料由河北科技师范学院收集保存,所选材料均设春化组和非春化组2个处理㊂春化组材料于河北科技师范学院昌黎校区实验室内催芽处理后,移到4ħ冰箱进行为期40d的春化处理,非春化组材料于春化组结束春化前3d进行催芽处理,(23ʃ1)ħ室温放置,当两组材料处于相同生长时期时,于2023年3月移栽到河北科技师范学院施各庄农场进行大田种植㊂待植株生长到孕穗期时,植株长势出现明显差异,成熟期的结实率也出现较大差异(表1),3个材料的2个处理组均选6次重复于幼穗处取样,取下的样品做好标记并迅速放到液氮中急速冷冻,用于R N A-s e q测序㊂表1黑麦结实率统计表T a b l e1S t a t i s t i c s o f r y e s e t t i n g r a t e材料名称M a t e r i a l n a m e结实率S e t t i n g r a t e/%春化处理V e r n a l i z a t i o n非春化处理N o n-v e r n a l i z i n g89R6672.0353.5590R3265.6742.3190R270.3835.302结果与分析2.1黑麦M I K C型M A D S-b o x蛋白氨基酸分析黑麦7条染色体上均有M I K C基因分布(表2)㊂黑麦M I K C型MA D S-b o x蛋白的等电点范围5.04(S c M I K C36)~9.5(S c M I K C32),其中有11个蛋白等电点小于7,所有蛋白中既有酸性蛋白,又有碱性蛋白,均为亲水蛋白;平均分子量范围22303.6k D(S c M I K C17)~34117.38k D(S c-M I K C20);氨基酸数量范围196(S c M I K C17)~ 298(S c M I K C20)a a;脂溶指数66.05~93.28,其中有25个蛋白的脂溶指数超过80,属于嗜热型蛋白㊂脂溶指数较高使得蛋白可以较好地适应各种环境㊂2.2黑麦M I K C型M A D S-b o x基因家族系统进化分析为确定黑麦M I K C基因家族和其他物种M I K C基因家族之间的关系,利用M E G A软件对黑麦㊁小麦和拟南芥3个物种共174个M I K C蛋白质序列采用N e i g h b o r-j o i n(N J)法构建家族系统发育进化树(图1),再根据小麦中编码M I K C 蛋白的基因对黑麦中编码M I K C蛋白的M I K C 基因进行分类㊂分析结果显示,黑麦M I K C基因家族共分成12个亚家族㊂其中,属于C GM13㊁A P3㊁S V P㊁A G L17㊁A G L12㊁A G L6㊁S E P/A G L2㊁F L C㊁S O C㊁S Q U A/A P I㊁A G㊁P I亚家族在黑麦中编码M I K C蛋白的基因分别有8㊁2㊁3㊁5㊁2㊁1㊁10㊁0㊁5㊁4㊁4和3个,黑麦S E P/A G L2亚家族中编码M I K C蛋白的基因最多,A G L6亚家族中编码M I K C蛋白的基因最少,无F L C亚家族㊂2.3黑麦M I K C型M A D S-b o x蛋白质保守基序、基因结构和共线性分析为进一步了解M I K C蛋白质保守基序,使用M E M E在线工具对黑麦M I K C家族成员进行分析㊂用M E M E软件预测得到黑麦M I K C蛋白的10个m o t i f(图2),分析结果发现,M I K C蛋白包含m o t i f1㊁m o t i f2㊁m o t i f4和m o t i f6,经验证以上4个m o t i f中含有MA D S-b o x㊁I(i n t e r v e n i n g)区㊁K(k e r a t i n)区和C末端(C-t e r m i n a l)保守结构域㊂不同亚家族K区结构域包含的基序略有不同㊂MA D S位于MA D S-b o x的N末端,为大约60个氨基酸组成的高度保守结构,可以与特异D N A 结合[19];紧接其后为I区,由序列保守性较低的区域构成,大约含有30个氨基酸,对MA D S-b o x 转录因子与D N A的特异结合起到决定性作用;K 区是一个中度保守区域,由大约70个氨基酸构成具有3个α螺旋组成的c o i l e d-c o i l结构,主要参与蛋白质间的相互作用;C末端主要由疏水氨基酸组成,是最不保守的区域,在转录激活中起作用[20]㊂为了解M I K C基因结构,根据其系统发育关系,比较了M I K C基因的内含子和外显子,利用软件T B t o o l s对黑麦M I K C基因进行结构分析(图3)㊂基因结构分析表明,M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因结构比较保守,黑麦M I K C家族基因大部分包含外显子和内含子㊂植物中大部分M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因由7个外显子组成,也有少数基因由8个外显子组成㊂图3结果显示,其中10个基因符合植物中编码M A D S-b o x蛋白的基因的典型结构,即7个外显子㊂每个基因的长度不同,可能与黑麦在进化过程中的染色㊃84㊃麦类作物学报第44卷表2 黑麦M I K C 基因及其蛋白质理化特征T a b l e 2 R y eM I K C g e n e s a n d t h e i r p r o t e i n p h ys i c o -c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s 基因名称N a m e基因I DG e n e等电点p I 平均分子量MW /k D 氨基酸数N o .o f a m i n o a c i d 脂溶指数A l i ph a t i c i n d e x 亲水性总平均值G R A V YS c M I K C 01S c WN 1R 01G 047800.36.9130814.6426883.69-0.745S c M I K C 02S c WN 6R 01G 221300.18.9027224.9524184.61-0.679S c M I K C 03S c WN 4R 01G 486200.19.0724139.5121482.99-0.633S c M I K C 04S c WN 7R 01G 163800.18.2727263.7423874.16-0.829S c M I K C 05S c WN 5R 01G 632300.17.6323997.6321391.55-0.406S c M I K C 06S c WN 2R 01G 176500.18.8430080.7026778.16-0.884S c M I K C 07S c WN 4R 01G 225600.18.7428518.4024675.28-0.825S c M I K C 08S c WN 1R 01G 361700.19.3827151.0723372.83-0.862S c M I K C 09S c WN 7R 01G 377700.18.7425984.4322972.88-0.648S c M I K C 10S c WN 5R 01G 619100.18.9923882.3321381.08-0.615S c M I K C 11S c WN 7R 01G 497600.15.4225338.4422584.13-0.570S c M I K C 12S c WN 4R 01G 449900.18.8325994.6722993.28-0.607S c M I K C 13S c WN 1R 01G 219700.19.3827151.0723372.83-0.862S c M I K C 14S c WN 2R 01G 360300.19.0027480.2324090.17-0.672S c M I K C 15S c WN 2R 01G 493000.17.7928071.2624179.67-0.615S c M I K C 16S c WN 4R 01G 610800.18.2528316.1625980.46-0.554S c M I K C 17S c WN 3R 01G 376600.18.8822303.6019684.13-0.531S c M I K C 18S c WN 3R 01G 125800.35.2524317.4721784.56-0.531S c M I K C 19S c WN 7R 01G 305000.16.5325210.1222493.21-0.283S c M I K C 20S c WN 3R 01G 210900.39.0634117.3829870.70-0.737S c M I K C 21S c WN 7R 01G 163700.18.2428502.1124878.27-0.782S c M I K C 22S c WN 7R 01G 129600.16.4028263.9524780.97-0.725S c M I K C 23S c WN 5R 01G 122300.19.0328421.4425488.86-0.443S c M I K C 24S c WN 1R 01G 171500.19.3030399.2626767.64-0.810S c M I K C 25S c WN 4R 01G 197800.17.7926304.2222777.71-0.580S c M I K C 26S c WN 5R 01G 450800.18.9227789.6324479.18-0.765S c M I K C 27S c WN 5R 01G 314800.18.9929056.0425276.67-0.809S c M I K C 28S c WN 6R 01G 087300.16.4528474.2325380.63-0.514S c M I K C 29S c WN 5R 01G 466000.18.7227730.7624078.42-0.671S c M I K C 30S c WN 5R 01G 315200.18.9929056.0425276.67-0.809S c M I K C 31S c WN 3R 01G 493600.17.1324070.5520984.45-0.716S c M I K C 32S c WN 1R 01G 359300.19.5027697.3725183.78-0.469S c M I K C 33S c WN 5R 01G 450700.18.9227789.6324479.18-0.765S c M I K C 34S c WN 4R 01G 392300.18.5032681.7428569.12-0.929S c M I K C 35S c WN 6R 01G 060000.19.0425516.0422366.05-0.759S c M I K C 36S c WN 7R 01G 509800.15.0424757.8122179.95-0.461S c M I K C 37S c WN 2R 01G 279900.29.1431520.6927570.00-0.906S c M I K C 38S c WN 5R 01G 450900.18.9428220.2624776.23-0.688S c M I K C 39S c WN 6R 01G 055600.17.7928071.2624179.67-0.615S c M I K C 40S c WN 6R 01G 211900.18.9029583.4526072.88-0.755S c M I K C 41S c WN 6R 01G 259400.18.9027224.9524184.61-0.679S c M I K C 42S c WN 1R 01G 257800.29.3925844.6223086.13-0.692S c M I K C 43S c WN 4R 01G 329500.15.7325233.4422682.04-0.549S c M I K C 44S c WN 4R 01G 392800.18.5326251.7122778.63-0.785S c M I K C 45S c WN 7R 01G 276300.16.4528288.0125280.95-0.513S c M I K C 46S c WN 6R 01G 261400.15.6425412.5722887.28-0.605S c M I K C 47S c WN 7R 01G 097500.16.7825668.1222886.49-0.589㊃94㊃第1期汪凯旋等:黑麦M I K C 型MA D S -b o x 家族基因的鉴定和表达分析图1 黑麦(S c )与拟南芥(A t )和小麦(T a )M I K C 蛋白的系统进化分析F i g .1 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o fM I K C p r o t e i n s i n r ye (S c ),A r a b i d o p s i s (A t ),a n dw h e a t (T a)图2 黑麦M I K C 蛋白的保守基序F i g .2 C o n s e r v a t i v em o t i f s o f r yeM I K C p r o t e i n s 体片段交换有关㊂MA D S -b o x 家族基因是在进化过程中通过基因重复事件产生的[20]㊂由黑麦分别与小麦和水稻间的共线性结果(图4)可知,黑麦与水稻间共有35对共线性基因,其中4R L 和5R L 与水稻的共线性基因最多㊂黑麦与小麦间共有90对共线性基因,其中4R L 与小麦7A ㊁7B ㊁7D L 的共线性基因最多,7R L 与小麦4A ㊁4B ㊁4D L 的共线性基因最多,㊃05㊃麦 类 作 物 学 报 第44卷说明黑麦4R L与小麦7A㊁7B㊁7D L的亲缘关系更近,黑麦7R L与小麦4A㊁4B㊁4D L的亲缘关系更近㊂有研究表明,黑麦4R L与7R L两条染色体出现非同源染色体间的易位现象,推测这是导致黑麦的4R L和7R L与小麦染色体间出现反向对应关系的主要原因[22]㊂根据3个物种的共线性基因数量可知黑麦与小麦的亲缘关系较水稻更近㊂利用T B t o o l s软件对黑麦进行物种内的潜在共线性分析发现(图5),黑麦M I K C家族基因在每条染色体上均有分布,且分布不均㊂其中5R L 和7R L上含有的编码M I K C蛋白的基因最多,各有9个㊂共有3个同源基因对,即S c M I K C37和S c M I K C33,S c M I K C31和S c M I K C08,S c M I K C42和S c M I K C10㊂根据小麦的亚家族分析可知,以上3对基因分别属于同一个亚家族,即S Q U A/A P I㊁P I和S O C㊂这些同源基因的序列相似性表明它们可能具有相似的功能㊂2.4黑麦M I K C基因的组织表达分析为了研究M I K C基因的表达特征,在W h e a t-O m i c s网站下载来源于威宁黑麦(W e i n i n g r y e)的图3黑麦M I K C的基因结构F i g.3M I K C g e n e s t r u c t u r e s o f r ye图中蓝色线条表示物种间的基因存在共线性关系㊂T h e b l u e l i n e s i n t h e f i g u r e i n d i c a t e t h a t t h e r e i s a c o l l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n g e n e s.图4黑麦M I K C基因与水稻和小麦基因组的共线性关系F i g.4C o l l i n e a r i t y r e l a t i o n s h i p b e t w e e n r y eM I K C g e n e s a n d r i c e a n dw h e a t g e n o m e s㊃15㊃第1期汪凯旋等:黑麦M I K C型MA D S-b o x家族基因的鉴定和表达分析R N A -s e q 数据,利用T B t o o l s 软件H e a t M a p 程序分析了M I K C 基因在抽穗期采集的根㊁茎㊁叶㊁穗样,以及开花后10㊁20㊁30和40d 采集的籽粒样品㊂根据组织器官和发育时期表达的特征(图6),M I K C 家族基因可分为11个亚族㊂编码S E P /A G L 2㊁A G L 6㊁A G ㊁C GM 13蛋白的基因(除S c M I K C 11)以及S c M I K C 17基因,上述基因在穗子处均有较高表达量,在开花后10和20d 采集的籽粒中也有表达,但表达量低于穗子,总的来说,4个亚族基因整体在穗部的表达量较高,但在其他部位无表达;S c M I K C 09㊁S c M I K C 35和S c -M I K C 31㊁S c M I K C 13等4个基因在穗子处的表达量高,其他部位和生长时期均无表达㊂利用R N A -s e q 数据分析不同基因在黑麦中的表达模式,黑麦表达结果如图7所示㊂经筛选,共选出18个具有差异表达的基因,其中17个M I K C 基因均出现了不同程度的上调表达,1个基因下调表达,其余基因未出现明显的表达差异㊂ 图中红色线条表示黑麦物种内染色体间的共线性基因对㊂T h e r e d l i n e s i n t h e f i g u r e r e p r e s e n t c o l l i n e a r g e n e p a i r sb e -t w e e nc h r o m o s o m e sw i t h i n r y e s pe c i e s .图5 黑麦47个M I K C 基因的染色体分布和染色体间关系F i g.5 C h r o m o s o m a l d i s t r i b u t i o na n d i n t e r c h r o m o s o m a l r e l a t i o n s h i p of 47S c M I K Cg e n es 10D A F ㊁20D A F ㊁30D A F ㊁40D A F :花后10㊁20㊁30及40d 采集的籽粒㊂10D A F ,20D A F ,30D A F ,a n d40D A F i n d i c a t e s e e d c o l l e c t e d 10,20,30,a n d 40d a y s a f t e r f l o w e r i n g ,r e s p e c t i v e l y.图6 M I K C 基因在黑麦不同组织器官中的表达F i g .6 E x p r e s s i o no fM I K C g e n e s i nd i f f e r e n t t i s s u e s a n do r g a n s o f r ye ㊃25㊃麦 类 作 物 学 报 第44卷1~6代表6个生物学重复,T代表实验组,C K代表对照组㊂1-6i n d i c a t e6b i o-r e p l i c a t e s,T m e a n s t r e a t m e n t,C K m e a n s c o n t r o l.图7M I K C基因在黑麦幼穗中的表达F i g.7E x p r e s s i o no fM I K C g e n e s i n y o u n g e a r s o fR y e3讨论黑麦是小麦的三级基因源,是小麦育种中重要的遗传资源[23],黑麦属植物基因可以增加小麦的遗传变异来源,为创制优良的新品种提供可能㊂花器官发育影响黑麦产量和质量㊂M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因在植物发育过程中起核心作用㊂豆科[24]㊁大麻[25]㊁甘蓝型油菜[26]㊁杉木[27]㊁玫瑰[28]㊁西瓜[29]㊁辣椒[30]㊁菊花[31]等生物的M I K C型MA D S-b o x基因家族鉴定和表达分析已完成㊂本研究利用生物信息学方法在黑麦基因组中鉴定出M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因共47个,基因数目多于小麦和水稻,比拟南芥此类型基因少29个㊂通过生物信息学相关软件对黑麦47个M I K C转录因子的编码序列进行分析,获得黑麦各个转录因子的蛋白理化性质㊁系统进化树㊁基因结构㊁保守基序㊁共线性和聚类分析等信息㊂这是国内外首次开展黑麦M I K C基因家族生物信息学分析的报道,为黑麦M I K C基因家族的序列克隆和功能验证等研究提供理论基础,也为进一步探索M I K C基因家族在黑麦生长发育以及春化过程中所扮演的角色提供思路㊂编码F L C蛋白的基因通过参与春化途径控制拟南芥的春化和开花转变,其同源基因也在小麦春化过程中起重要作用㊂黑麦M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因可进一步分为11个亚家族,但本次分析未发现F L C亚家族成员㊂其原因可能是所选用的威宁黑麦(W e i n i n g r y e)参考基因组测序不完整㊂另外,黑麦中相关的基因与小麦和拟南芥同源性较差㊂小麦与拟南芥编码F L C蛋白同源的春化相关基因,如T a A G L24和T a A G L33[32],与黑麦编码M I K C蛋白的基因同源率分别为50%和51%,推测由于同源性较低,黑麦F L C亚家族未归类到基因㊂同源性较低这种现象可能是黑麦的异花授粉与小麦的自花授粉方式不同,在长期进化中表现的差异㊂在拟南芥中,控制开花转变的基因不仅有F L C亚家族, S V P和S O C亚家族基因也和其开花转变有关㊂F L C亚家族的缺失不仅限于黑麦,在高粱㊁水稻㊁黄瓜等植物的MA D S-b o x基因家族中同样没有F L C亚家族成员㊂M I K C型编码MA D S-b o x蛋㊃35㊃第1期汪凯旋等:黑麦M I K C型MA D S-b o x家族基因的鉴定和表达分析白的基因也对植物生长发育起调控作用㊂不同亚家族中编码MA D S-b o x蛋白的基因表达模式不同[33]㊂陆地棉中M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因调控胚胎发育和控制开花时间㊂高粱中的M I K C型编码MA D S-b o x蛋白的基因同样在花发育和胚胎发育过程中表达[34]㊂基因结构分析发现,该类家族基因非常保守㊂MA D S-b o x不同亚类间基因结构较为保守,所含m o t i f相似,揭示亚类功能的保守性㊂保守基序分析发现m o t i f1㊁m o t i f2㊁m o t i f4和m o t i f6在所有M I K C蛋白中都有㊂全基因组复制事件是许多植物基因进化和扩展的关键驱动因素㊂物种间的共线性分析发现,黑麦与小麦间的共线性基因数多于黑麦与水稻的共线性基因数,证明黑麦与小麦的亲缘关系较黑麦与水稻的亲缘关系更近;根据发表的R基因组序列,1R与小麦共线性最好,但由于黑麦的4R L与7R L之间发生了非同源染色体间的易位,导致不同物种间中黑麦与小麦的共线性出现反向对应㊂黑麦的4R L与小麦和水稻的共线性基因均最多,说明4R L与其他2个物种的基因组重叠最多㊂聚类分析发现,黑麦中编码M I K C蛋白的基因整体在穗子表达量最高,其次是开花后10d采集的籽粒,其他植物组织器官及发育时期也有表达,但表达量较低㊂编码S E P/A G L2㊁A G L6㊁A G㊁C GM13蛋白的基因(除S c M I K C11)以及S c-M I K C17基因在穗子中均有较高表达,在开花后10和20d采集的籽粒中也有表达,但表达量低于穗子,总的来说,4个亚族基因整体在穗部的表达量较高,但在其他部位无表达;编码A G L17蛋白的基因和S O C中的S c M I K C05基因在根部表达量高,其他部位和生长时期均无表达;而A P3亚家族中的S c M I K C09㊁S c M I K C35基因和P I亚家族中的S c M I K C31㊁S c M I K C13基因在穗子的表达量高,其他部位和生长时期均无表达㊂本研究根据转录组数据得出,经春化处理后,部分基因出现不同程度的响应,其中有17个基因出现上调表达,1个基因出现下调表达,其余29个基因未出现明显的表达差异,推测这些具有表达差异的基因在黑麦春化过程中发挥重要作用,与聚类分析中数据库分析结果一致㊂而29个未具有差异表达的基因中可能仍存在与黑麦春化有关的基因,这些基因通过碱基结构的改变等其他方式引起性状差异,无法通过转录组数据检测出表达量差别,具体原因有待通过基因测序等方法进行鉴定㊂通过本次生物信息学分析发现,利用自W h e a t O m-i c s网站上下载的R N A-s e q数据进行聚类分析时, S c M I K C09㊁S c M I K C35㊁S c M I K C31和S c M I K C13等4个基因在穗子的表达量较高,而其他部位和生长时期均无表达;再结合物种内共线性分析发现,黑麦中存在3对同源基因且每对各属于一个亚家族,其中S c M I K C31基因仅在穗子表达,且表达量高;通过R N A-s e q进行验证分析发现,S c-M I K C31基因出现上调表达现象,此基因在黑麦中的表达模式与S O C亚家族基因在拟南芥中与其开花转变有关的基因的表达模式相似,本次R N A-s e q验证结果与生物信息学所得结论一致,初步推测S c M I K C31基因为黑麦中与春化开花有关的基因㊂以黑麦为研究对象,在黑麦的基因组中,共鉴定出47个编码M I K C蛋白的基因,并对这些基因进行了理化性质㊁进化树㊁基因结构㊁基因保守基序㊁共线性㊁聚类分析等生物信息学分析,并利用课题组材料做转录组测序进行验证,较为全面㊁系统地鉴定了黑麦M I K C基因家族㊂结合生物信息学分析和R N A-s e q验证结果一致发现,S c-M I K C31基因仅在穗子处表达量高,因此推测该基因为黑麦中与春化开花有关的基因㊂参考文献:[1]A L V A R E Z-B U Y L L AER,L I L J E G R E NS J,P E L A ZS,e t a l. 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摘要小麦（Triticum aestivum L., AABBDD, 2n=42）属于世界重要的三大粮食作物之一，迄今已有8000年以上的栽培历史，在世界农业的生产与发展中占有举足轻重的地位。

小麦的近缘物种蕴含着丰富的优良基因资源，适用于小麦基因组的遗传改良，其中应用最成功的当属小麦-黑麦1RS.1BL易位系。

但是1RS.1BL易位系小麦在长期的定向选育过程中遗传基础狭窄，并且自1990年以来产生的新的病原生理小种类型使得大多数的1RS.1BL易位系抗性逐渐减弱甚至丧失，已经不能满足现代农业的需求。

因此当1RS染色体失去抗性时，很快便会被小麦育种计划所淘汰，但是不可否认1RS.1BL易位系能使小麦产量潜力增加约5%，为人类做出了巨大贡献。

将黑麦的多样性引入小麦，创制1RS.1BL易位系的多样性，从而再利用1RS.1BL易位系的多样性，解决目前在小麦遗传改良中遇到的困难，是进一步利用1RS染色体的可行方法，并且创制新的小麦-黑麦易位系也迫在眉睫。

“川农”号系列小麦是我国西南地区自2000年以来最主要的栽培品种，具有抗病性好、高分蘖数、延绿性等优异的农艺性状，对它们的染色体结构的分析能够对我国西南麦区的小麦育种提供更多的信息。

本实验主要采用非变性荧光原位杂交（ND-FISH）结合5种寡核苷酸探针（Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1、Oligo-Ku、Oligo-pSc200、Oligo-pSc250）对21个“川农”号小麦品种（系）染色体信号多态性及来源进行分析，并且对3个性状优良的“川农”号小麦品种（川农23、川农25、川农27）与不同黑麦品种（智利黑麦、秦岭黑麦、威宁黑麦、荆州黑麦）自由组合杂交后代进行纯合子代的筛选。

最终得到了以下的一些创新性结果：1．建立了“川农”号小麦品种（系）的标准核型，为西南地区小麦育种提供助力。

2．寡核苷酸探针Oligo- pSc119.2 -1和Oligo- pTa535 -1在小麦染色体上具有高度的多态性。