葡萄糖氧化酶的发酵生产与发酵工艺的研究

Ｋｈａｔｔａｂ等人［７］报道利用紫外 诱变黑曲霉可以获得葡萄糖氧化 酶产量更高的生产菌株。而利用 同种高产酶的黑曲霉菌株的原生 质体融合技术可以达到更加突出 的效果。
２．２ 青霉菌发酵生产葡萄糖 氧化酶
工业化生产多采用黑曲霉， 其产酶水平较高。但青霉葡萄糖 氧化酶米氏常数小，反应速度 快，也引起人们较大的兴趣。
胡常英等人［６］以产葡萄糖氧 化酶的点青霉（ Ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ ｎｏｔａｔｕｍ）．８３１２为出发菌株，经紫外 线诱变处理，初筛、复筛得到了 一株（Ｎｏ Ｔ１１１）高产葡萄糖氧化酶 的菌株，连续 １２次对其传代试验， 该突变株遗传性状稳定，摇瓶产 酶水平达到 ５５．７Ｕ／ｍＬ，比出发株 （３６．２Ｕ／ｍＬ）提高了５３．９％。发酵液未 检出青霉素的成份。该诱变株的 建立和对所产酶的研究，为促进 青霉葡萄糖氧化酶工业化生产， 提高酶的应用质量，降低生产成 本提供了科学依据。
葡萄糖氧化酶的发酵生产
与发酵工艺的研究
宫艳艳，徐学明
（江南大学食品学院，无锡 ２ １ ４ ０ ３ ６ ）
摘 要：葡萄糖氧化酶是酶应用技术领域中一种非常重要的酶，作为国 家允许使用的酶制剂之一，它在食品、医药、饲料等行业中得到了广泛应用。 该文简要介绍了葡萄糖氧化酶及两种菌种的葡萄糖氧化酶的发酵生产，对发 酵工艺的影响进行了探讨，并展望了其在食品工业上的应用前景。
切关系，导致了它在科研、医药
和食品工业生产上广泛的应用。
２０ 世纪初 Ｍａｘｉｍｏｕ 在黑曲霉
培养物中发现吸氧酶系统。１ ９ ２ ４
年Ｍａｌｌｉａｒｄ发现了葡萄糖酸。１９２８
年，Ｍｕｌｌｅｒ 用黑曲霉菌丝体压制
进行葡萄糖酸形成的酶学研究，
探明在葡萄糖存在时能消耗氧，
并命名为葡萄糖氧化酶，把它归
入脱氢酶。以后许多研究者对该
３．３ 菌种质量的影响
发酵期间生产菌种生长的快 慢和产物的合成的多寡很大程度 上取决于菌种的质量。 ３．３．１ 接种菌龄
选择适当的接种菌龄十分重 要，太年轻或过老的菌种对发酵 不利。一般，接种菌龄以对数生 长期的后期，即培养液中菌接近 高峰时所需的时间较为宜。太年 轻的菌种接种后往往会出现前期 生长缓慢，整个发酵周期延长， 产物开始形成时间推迟。过老的 菌种虽然菌量较多，但接种后会 导致生产能力的下降，菌体过早 衰老。 ３．３．２ 接种量
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度增高，由于其分解代谢物的阻 遏作用而使产酶下降，而浓度降 低，由于影响菌体的生长也将使 产酶下降。菌干重与初糖浓度有 一定的关系，随初糖浓度增加，发 酵某一时刻，菌体干重也增加。
胡常英等人［ ６ ］ 报道，以点青 霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）Ｎｏ．８３１２为 出发菌株，经紫外线诱变处理，在 经初筛选定 ３ 株，测定其最佳产酶 的葡萄糖浓度，Ｎｏ Ｔ３３ 在葡萄糖 浓度为 ７％ 时产酶最佳，Ｎｏ Ｔ１１１ 适合葡萄糖浓度在 ６．８％￣８．０％ 之 间，此范围内酶产量高，Ｎｏ Ｔ１７８ 在葡萄糖浓度 ８％ 时表现好。对三 个突变株在不同葡萄糖浓度时产 酶进行比较分析，初步认为，Ｎ ｏ Ｔ１１１ 利用了较低的糖浓度（７％）， 而且产酶高，再增加糖浓度，产酶 能力均下降。说明高浓度碳源阻 遏了产酶，或者是影响酶向细胞 外渗透，也可能是酸浓度使蛋白 变性，影响了酶活力表达。
在葡萄糖氧化酶发酵生产 中，葡萄糖一方面作为菌体利用 的碳源，酶合成的诱导物，另一 方面其分解代谢物又能阻遏其生 物合成，因此，控制发酵培养基 中初糖浓度对产酶影响很大。
江洁等人［ ９ ］ 通过摇瓶实验确 定了自选青霉菌株Ｅ－Ｉ－Ｃ分批发酵 生产葡萄糖氧化酶的适宜工艺条 件。实验结果表明，发酵培养基 初糖浓度 ８％ 时产酶水平最高，浓
析液中的酶活包括在内），总产量 提高 ３０％￣５０％。膜发酵过程中 ｐＨ 值、ＮＨ －Ｎ 的变化较对照平稳。实
２
验证明用膜透析法可减缓发酵过 程中代谢物对葡萄糖氧化酶生物 合成的阻遇作用。
３ 发酵工艺对产酶的影响
３．１ 碳源的影响 ３．１．１ 碳源种类对产酶的影响
霉菌在碳源的需要上有非常 显著的选择性，不同的菌种有不 同的要求。
江洁等人［１０］在综合考虑初糖 浓度与残糖量、初始糖浓度与菌 干重的关系及摇瓶发酵与罐发酵 的差异的条件下，初定葡萄糖氧 化酶膜过滤发酵工艺中的初糖浓 度为 ６％。以后的罐发酵结果也表 明 ６％ 的初始葡萄糖浓度，在发酵 ３０ｈ 左右残糖量一般为 ２．０％ 左右， 菌体浓度达２０ｇ／Ｌ 左右，酶活为３０ × １６．６７ μ ｍｏｌ／ｓ·Ｌ，比较适合过 滤发酵的开始。
２ 不同菌种的葡萄糖氧化
酶的发酵生产
葡萄糖氧化酶广泛分布于动
收稿日期：２ ０ ０ ７ － ０ ６ － １ ３ 作者简介：宫艳艳（１９８３－ ），女，研究生，研究方向为食品科学。Ｅ － ｍ ａ ｉ ｌ ： ｇ ｏ ｎ ｇ ｙ ａ ｎ ｙ ａ ｎ ５ ５ ０ ５ ＠ ｓ ｉ ｎ ａ ． ｃ ｏ ｍ ． ｃ ｎ
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影响酶的合成，使代谢和细胞膜 透性发生变化［１１］。
江洁等人［１０］研究了培养基初 始 ｐＨ 值对菌体产酶的影响，发现 用 １０％ＨＣｌ 或 １０％ＮａＯＨ 调节消前培 养基 ｐＨ 值，发酵 ４８ｈ 后测其酶活， 以 ｐＨ 值 ７．７ 对产酶最为有利。
蔡静平等人［１２］在以黑曲霉生 产面包品质改良复合酶的研究中 发现，在起始 ｐＨ 值 ４￣７ 的培养基 上试验菌均能正常生长且可以产 生葡萄糖氧化酶和α － 淀粉酶，但 在 ｐＨ 值 ４ 和 ｐＨ 值 ７ 时，２ 种酶的 产率很低。相对而言，基质初始 ｐＨ 值对α － 淀粉酶酶产生的影响 相对温和，在初始 ｐＨ 值 ５．６￣６．５ 的 基质中均维持较高的产酶水平， 而葡萄糖氧化酶的产生对基质初 始 ｐＨ 值很敏感，在 ｐＨ 值 ５．６ 时菌 丝酶活达 ６．２９ｕ／ｇ，当 ｐＨ 值为 ６．５ 时迅速降至１．１７ｕ／ｇ。
１ 葡萄糖氧化酶简介
高纯度葡萄糖氧化酶为淡黄 色粉末，易溶于水，完全不溶于 乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、 乙二醇等。５０％ 丙酮、６６％ 甲醇能 使其沉淀，一般制品中含有过氧 化氢酶。分子量为１５００００ 左右，每 克分子酶含 ２ 克分子 ＦＡＤ。酶的最 大光吸收波长为 ３７７ｎｍ 和 ４５５ｎｍ。 在紫外光下无荧光，但是在热、酸 或碱处理后具有特殊的绿色。固 体酶制剂在 ０ ℃下保存至少稳定 两年，在 －１５℃下稳定 ８ 年。葡萄 糖氧化酶稳定的 ｐＨ 值范围为 ３￣４， 最适 ｐＨ 值为 ５ ，如果没有葡萄糖 等保护剂的存在，ｐＨ 值大于 ８ 或
关键词：葡萄糖氧化酶；发酵；发酵工艺
葡萄糖氧化酶（ Ｇ ｌ ｕ ｃ ｏ ｓ ｅ
Ｏｘｉｄａｓｅ，简称 ＧＯＤ）系统名为β －
Ｄ－葡萄糖：氧化还原酶（ＥＣ１．１．３．４）
它能专一地将β －Ｄ－ 葡萄糖氧化
成葡萄糖酸和过氧化氢［１］。葡萄
糖氧化酶是酶技术领域中一种非
常重要的酶，由于葡萄糖氧化酶
与生命重要物质葡萄糖和氧的密
酶的性质作了大量的工作，尤其
对葡萄糖氧化酶的辅基一黄素腺
嘌呤二核苷酸（ Ｆ Ａ Ｄ ） 作了深入的
研究，并给予详细的说明。Ｂｅｎｔｌｅｙ
Ｎｅｕｂｅｒｇａｒ 应用同位素 １８Ｏ ·Ｈ １８Ｏ
２
２
明确了在有过氧化氢酶存在下的 一系列试验。Ｋｅｉｌｉｎ等对黑曲霉的 葡萄糖氧化酶的动力学及其作用 形式也作了较详细的研究。１ ９ ６ １ 年国际生化协会酶委员会将该酶 的系统名称叫做（β－Ｄ－萄萄糖－氧 化还原酶（ＥＣ１．１．３．４）［１］。
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葡萄糖氧化酶的生产一般 都采用黑曲霉和青霉属菌株作 生产菌。中国生产采用点青霉 及黄色青霉，美国也采用此类 菌种。尼崎青霉系日本筛选的 生产常用菌，生机青霉系前苏 联生产使用菌株。Ｇｒｉｇｏｒｏｗ 等［５］ 报道胶霉属（Ｇｌｉｏｃｔａｄｉｕｍ）、拟青 霉属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）和帚霉属 （Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）的霉菌也能产 生葡萄糖氧化酶。
小于 ３ ，葡萄糖氧化酶将迅速失 活。葡萄糖氧化酶的作用温度为 ３０￣６０℃，该酶对 ＥＤＴＡ、ＫＣＮ 及 ＮａＦ 不受阻抑，但 ＨｇＣｌ２、ＡｇＣｌ、对氯 汞苯甲酸和苯肼对酶有阻抑［２］。
在有氧情况下，葡萄糖氧化 酶可以从某系统中除去葡萄糖， 在过量葡萄糖的存在下可除去 氧。基于此原理，葡萄糖氧化酶 能广泛应用于各类食品制造，器 械除氧防锈等方面。如：蛋品加 工中脱糖，防止褐变；果汁、啤 酒、食品罐头等的除氧；用于防 止虾肉、干鲜食品的氧化；生产 葡萄糖酸等。另外，鉴于葡萄糖 氧化酶作用的高度专一性，它也 被用于一些复杂生化体系中的葡 萄糖的定量测定。如：血液中葡 萄糖含量测定；制成糖尿试纸用 于临床诊断。
３．２ 初始 ｐＨ 值的选择
微生物生长环境的酸碱度对 其生长有很大影响。环境 ｐＨ 值影 响培养基中某些营养物的解离和 中间代谢物的解离，从而影响微 生物对营养物质的吸收、利用和 代谢物的分泌；环境 ｐＨ 值影响酶 分子和底物分子的离子带电状况， 妨碍两者的结合，甚至引起酶变 性，因而影响酶活力；环境 ｐＨ 值
Ｓｅｍａｓｈｋｏ 等人［８］研究了三个 青霉菌的突变菌株 ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ＢＩＭＦ－１５．３，ＮＭＭ９５．１３２，和 ４６．１ 的 生长影响因素以及葡萄糖氧化酶 的生产。研究显示，三个变异菌 株均能在分别以葡萄糖、木醇 糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、 甘油和甘露醇作为碳源的培养基 上生长并产生葡萄糖氧化酶。三 个突变菌株在以葡萄糖、蔗糖， 果糖为碳源的培养基上葡萄糖氧 化酶的产量最高。Ｐ． ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ＢＩＭＦ－１５．３ 在以木醇糖或甘露 醇为碳源时产酶反应活跃， 而Ｐ ． ｆ ｕ ｎ ｉ ｃ ｕ ｌ ｏ ｓ ｕ ｍ ４ ６ ． １ 在麦 芽糖为碳源时产酶反应活跃。 ３．１．２ 初始葡萄糖浓度对产酶 的影响
接种量的大小是由发酵罐中 菌的生长繁殖速度决定的。通 常，采用较大的接种量可以缩短 达到高峰的时间，使产物的合成 提前。这是由于菌种量多，菌种
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物、植物及微生物体内，由于在 动植物体中提取有一定局限性， 从酶量来说也不丰富，而霉菌在 一定条件下，产生葡萄糖氧化酶 的能力强，便于大规模生产葡萄 糖氧化酶的主要霉菌来源于黑曲 霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）和青霉菌 （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）。酶的生产方法可分 为提取法、发酵法以及化学合成 法。发酵法是 ２０ 世纪 ５０ 年代以来 酶生产的主要方法。它是利用细 胞，主要是微生物细胞的生命活 动而获得人们所需的酶［３］。
为了克服葡萄糖分解代谢产 物的阻遏作用，应用各种遗传学 手段提高微生物的生产性能是相 当重要的，当然通过培养方法、 培养装置的改进来提高发酵单位 也是可行的。在分批发酵过程 中，往往会出现培养基中必需养 分耗竭以及有毒的代谢产物的积 累等问题。为了克服这些不足，提 高菌体的生长量和代谢产物的分 泌，运用膜透析发酵是一种很有 前途的方法。储炬等人［７］用青霉属 Ｚ－Ｉ－Ｃ（系从土壤中分离获得）及其变 株研究了膜透析的发酵生产葡萄 糖氧化酶技术。研究结果表明，常 规发酵初期 ２４ｈ 内，糖耗较慢，随 着菌体浓度的提高，产酶和糖耗 速率加快。而膜发酵罐除了有部 分 Ｇ Ｏ Ｄ 透过膜外，发酵罐内的产 酶速率比对照提高将近一倍，分 别为５．５８×１６．０７μｍｏｌ／（ｓ·Ｌ·ｈ）和 ２．８５×１６．６７μｍｏ１／（ｓ·Ｌ·ｈ）（未将透
２．１黑曲霉发酵生产葡萄糖氧 化酶
刘建忠等人［ ５ ］ 研究了黑曲霉 葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶摇床 发酵过程的动力学，并建立了发 酵过程菌体生长、基质消耗及酶 合成的随时间变化的数学模型。 研究表明，Ｌ ｏ ｇ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ 方程、 Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ－Ｐｉｒｅｔ方程能够很好地分 别描述黑曲霉细胞的生长和发酵 产酶过程；葡萄糖氧化酶及过氧 化氢酶的发酵合成是生长耦联的。