pMD18 vector

TaKaRa Code：D103A pMD®18-T Simple Vector目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®18-T Simple Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD ®18-T Simple Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。

本载体由pUC18载体改建而成，它消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，再在pUC18载体的多克隆酶切位点处导入了Eco R V酶切位点，使用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

本载体尽管消除了LacZ 基因上的多克隆酶切位点，但不影响β-半乳糖苷酶的正常表达，因此，PCR 产物克隆后仍可以利用α-互补性进行蓝白菌落的筛选，挑选阳性克隆。

由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR 产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR 扩增引物上导入合适的酶切位点。

此时如果使用PCR 扩增引物导入的酶切位点进行DNA 酶切时，酶切反应将不会受到T 载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。

由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control 反应。

●制品内容pMD ®18-T Simple Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支 Control Insert（50 ng/μl） 10 μl×1支 Solution I*75 μl×2支** 使用时请于冰中融解。

pMD®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。

本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。

本载体与pMD®18-T Vector 相比，本制品的β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。

因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。

简而言之，就是一种可以将taq酶（注意：pfu不具备在产物两端加“A”碱基的能力）扩增的两端带有A碱基的产物连入这种载体，从而通过大肠杆菌扩增的载体，而且可以通过蓝白筛选来筛选阳性克隆，插入成功的为白，不成功为蓝。

图谱可以去takara上下说明书。

序列拼接* 为了保证测序结果的准确性，单基因短片段（700pd左右）测序一般应采用双向测序，然后将双向测序的结果拼接在一起，从而获得一致性序列。

线粒体基因组测序和DNA长片段测序一般是通过分段测序来完成的，最后也需要将测出的短片段拼接成一条完整的序列。

序列拼接可以在不同的软件中进行。

一、使用“组装批处理文件byLHM.pg4”进行拼接1. 在预定的位置建立一个文件夹“gap”，将需要使用的3个软件“组装批处理文件byLHM.pg4”、“V ector_primer4pMD18-T.vec_pri”、“pMD18-T_Vector.seq”拷贝到该文件夹下，再将需要拼接的测序文件拷贝到该文件夹下。

2. 双击运行“组装批处理文件byLHM.pg4”程序。

3. 在程序运行后出现的界面右侧点击“Add files”按钮，打开要拼接的序列文件。

为了保证拼接后输出的是正向序列，最好先添加上游引物序列，然后添加下游引物序列，因为在一般情况下软件将添加的第一条序列默认为正向参照序列；有时由于测序效果等因素的影响，有时即使首先添加的是上游引物序列，但拼接后仍然会以测序效果明显更好的下游引物序列为正向参照序列，此时需要按照后面介绍的方法将上游引物序列转换为正向参照序列再输出一致性序列。

4. 点击界面上方第二行的“Configure Modules”，在弹出的窗口左边的任务栏中点击“[x]Sequencing vector Clip”，再点击右边的“Browse”按钮，通过弹出的窗口打开“Vector_primer4pMD18-T.vec_pri”程序；点击左边任务栏中的“[] Cloning Vector Clip”，再点击右边的“Browse”按钮，通过弹出的窗口打开“pMD18-T_Vector.seq”程序；点击左下角的“Run”按钮，即开始数据处理，处理结果将自动保存到“gap”文件夹中。

5. 在“gap”文件夹中双击“AssMit_tmp.o.aux”文件，将鼠标移到弹出的“Contig Selector”窗口中的直线上，点击右键，选择“Edit Contig”，即弹出“Contig Editor”窗口，点击最右边的“setting”按钮，在下拉菜单中选择“By background colour”，即可显示比对结果的有差异碱基；双击某一序列，即可显示该序列的测序峰图，以检查核对该位点碱基的测序情况。

TaKaRa Code：D102ApMD®19-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®19-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD ®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。

本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control 反应。

本载体与pMD ®18-T Vector 相比，本制品的 β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。

因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。

●制品内容pMD ®19-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支 Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1支 Solution I*75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。

●保存： -20℃●纯度■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA 片段。

1.16S rDNA-V3高变区的扩增1) 细菌基因组总DNA16S rDNA-V3高变区的扩增，50 µL体系：10×缓冲液（不含Mg2 +） 5 µLdNTP(10 mmol L-1) 1 µL引物341F、517R(10 μmol L-1)各0.5 µLMg2 + (25 mmol L-1) 2.5 µL普通Taq DNA聚合酶 2.5 UBSA（牛血清白蛋白1 mg mL-1） 5 µLDNA模板100 ngddH2O 补至50 µL2) PCR 扩增条件为：94℃ 5 min94 ℃ 1 min65℃ 1 min 降1℃72℃ 1 min94℃ 1 min 10个循环65℃ 1 min 降1℃72℃1min94℃1min55℃1min 20个循环72℃1min72℃10 min2.变性梯度凝胶电泳（DGGE）PCR产物用基因突变检测仪分析，PAGE(聚丙烯酰胺)胶浓度为8%（w/v），变性梯度为40%～60% (100%的变性剂为100 mL溶液中含有42 g的尿素和40 mL的甲酰胺)。

a)配制40％变性溶液:试剂8％胶40％丙烯酰胺／二聚丙烯酰胺20 mL50×TAE 缓冲液 2 mL甲酰胺（去离子）16 mL尿素16.8 gddH2O 补至100 mLb)配制60％变性溶液:试剂8％胶40％丙烯酰胺／二聚丙烯酰胺20 mL50×TAE 缓冲液 2 mL甲酰胺（去离子）24 mL尿素25.2 gddH2O 补至100 mLc)按说明书组装梯度制胶器；d)在电泳槽中装入7 L 1×TAE 电泳缓冲液；e)取40%和60%变性溶液各15 mL，分别加入过硫酸铵（10%）150 µL，TEMED15 µL，混匀，灌胶；f)标记为低浓度（L）和高浓度（H）的注射器分别吸入全部40％和60％变性胶溶液，通过一系列连接装置，按说明书灌至自上而下浓度由低到高的连续梯度凝胶；g)小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时,并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60℃；h)PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，用注射针进样；i)电泳条件：60℃，40 V，20 min 预电泳；150 v，约7 h；j)电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。

TaKaRa Code：D101ApMD®18-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®18-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD®18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。

本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。

●制品内容pMD®18-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支Control Insert（50 ng/μl） 10 μl×1支Solution I* 75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。

●保存：-20℃●纯度■ Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。

●用途■ 进行TA克隆，克隆PCR产物。

■ 对克隆后的PCR产物使用Bca BEST TM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。

非致病性小肠结肠炎耶尔森菌ail基因克隆菌株的构建及其侵袭性研究吉芳坤;李中杰;邱海燕;肖玉春;景怀琦;段广才;王鑫【摘要】The aim of this study was to construct recombinant nonpathogenic Yersnia enterocolitica with three different nucleotide sequence of pathogenic Yersnia enterocolitica ail gene. These recombinant strains were analyzed by cloning expression and invasion assay. The PCR amplified coding region of ail gene was cloned into pMD18-T vector and expressed in nonpathogenic Yersnia enterocolitica Y40 with IPTG induction. The positive recombinant strains were then tested individually in the adhesion and invasion assays to HEP-2 and HT-29 cells to determine whether the polymorphisms of ail gene sequence could influence the ability of adhesion and invasion to epithelial cells. It was demonstrated that the ail gene of pathogenic Yersinia enterocolitica transcribed successfully in nonpathogenic Yersnia enterocolitica strain. However, the recombinant strains seemed to be unable to adhere or invade to either of tissue culture cell lines. In addition, the nonspecific adhesion, the inherent characteristics of nonpathogenic Yersnia enterocolitica, had a certain degree drop. The result showed that the ail gene could not confer on the the characteristics of invasion and adherence to nonpathogenic Yersnia enterocolitica, and also that the different nucleotide sequence of Yersnia enterocolitica ail gene has no difference in the ability of adhesion and invasiveness. These data support the hypothesis that the Y. enterocoliticastrains must have an additional factor to place Ail above the other surface structures to facilitate interactions with the mammalian cell surface; or there may be a factor in the cell surface of nonpathogenic Yersnia enterocolitica which are likely to affect the nature of their interaction with the cultured cells.%目的利用3种不同序列型致病性肠结肠炎耶尔森菌的ail基因构建非致病性小肠结肠炎耶尔森菌ail基因克隆菌株,并对其进行表达和侵袭性研究.方法将3种不同序列型ail基因连接到载体pMD18-T后转化入非致病性小肠结肠炎耶尔森菌Y40中.井以HEP-2和HT-29细胞做粘附侵袭实验.结果经PCR 和序列分析证实3种序列型ail基因正确与载体连接并成功转入非致病性小肠结肠炎耶尔森菌.结果表明ail基因在受体菌中成功转录,但并未赋予非致病性小肠结肠炎耶尔森菌粘附侵袭的能力,并且反常性降低了其非特异粘附效能.结论 3种不同序列型ail基因转入非致病性小肠结肠炎耶尔森菌后,并不能赋予其粘附侵袭的功能;在非致病性小肠结肠炎耶尔森菌上可能缺乏某种协同Ail蛋白作用的因子或者其膜表面结构上可能存在着某种影响重组Ail蛋白与组织细胞作用的因素.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2011(027)005【总页数】5页(P386-389,393)【关键词】小肠结肠炎耶尔森菌;ail基因;侵袭粘附特性【作者】吉芳坤;李中杰;邱海燕;肖玉春;景怀琦;段广才;王鑫【作者单位】郑州大学公共卫生学院,郑州,450001;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;中国疾病预防控制中心,北京,102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;郑州大学公共卫生学院,郑州,450001;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206【正文语种】中文【中图分类】R378.2小肠结肠炎耶尔森菌病是一种新的肠道传染病,呈世界性分布,是欧洲一些国家腹泻的主要病原,这些地区耶尔森菌引起的胃肠炎和严重腹泻比痢疾还多。