质粒DNA的提取和纯化一、实验目的掌握碱法小量提取质粒DNA。
二、实验内容质粒DNA的小量提取。
三、实验原理所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。
碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。
离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。
四、实验方法与步骤㈠细菌培养和收集将带有pUC19质粒的大肠杆菌接种在LB固体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃培养12～24小时。
在超净工作台中用无菌的牙签挑取平板培养基上的单菌落接种到25ml LB液体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃振荡培养（220rpm）约18小时至对数生长后期（OD600=0.6）。
㈡碱法小量提取质粒DNA1、将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，于4℃12000rpm离心30秒，弃去上清液，将剩余的培养物贮存于4℃。
重复3次，以得到较多的细菌沉淀（视具体情况而定）。
2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。
3、加入100μl用冰预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。
4、加入200μl现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴2～5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴2～5分钟。
6、4℃,12000rpm离心10分钟。
将上清液转入另一只1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10分钟。
实验报告DNA提取与纯化实验报告：DNA 提取与纯化一、实验目的本次实验的主要目的是掌握从不同生物样本中提取和纯化 DNA 的方法，并对提取的 DNA 进行质量检测和分析。
通过实验，深入了解DNA 的结构和性质，熟悉分子生物学实验的基本操作流程，为后续的基因分析和研究工作奠定基础。
二、实验原理DNA 存在于细胞核内，与蛋白质等成分结合形成染色质。
在提取过程中，需要通过裂解细胞，去除蛋白质、脂质和其他杂质，使 DNA得以释放和分离。
常用的裂解方法包括物理方法（如研磨、超声破碎）和化学方法（如使用去污剂、蛋白酶 K 等）。
之后，利用乙醇或异丙醇等有机溶剂沉淀 DNA，使其从溶液中析出。
纯化DNA 则通常采用层析柱或磁珠吸附等方法，去除残留的杂质，获得高纯度的 DNA 样品。
三、实验材料与设备（一）实验材料1、新鲜的动物肝脏组织2、植物叶片3、细菌培养液（二）实验试剂1、细胞裂解液（含去污剂、蛋白酶 K 等）2、乙醇、异丙醇3、氯化钠溶液4、 TE 缓冲液（TrisEDTA 缓冲液）5、琼脂糖6、溴化乙锭（EB）（三）实验设备1、离心机2、移液器3、恒温水浴锅4、紫外分光光度计5、电泳仪及电泳槽四、实验步骤（一）动物肝脏组织 DNA 的提取1、称取约 05g 新鲜的动物肝脏组织，放入研钵中，加入液氮充分研磨至粉末状。
2、将研磨后的粉末转移至离心管中，加入 5ml 细胞裂解液，轻轻混匀，置于 55℃水浴锅中保温 1 小时，期间每隔 15 分钟轻轻颠倒混匀一次。
3、加入等体积的饱和氯化钠溶液，充分混匀，12000rpm 离心 10分钟，将上清液转移至新的离心管中。
4、向上清液中加入 2 倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，可见白色絮状沉淀出现，即为 DNA。
5、用移液器将 DNA 沉淀吸出，放入新的离心管中，用 70%乙醇洗涤 2 次，室温干燥后，加入适量的 TE 缓冲液溶解 DNA，置于－20℃保存备用。
（二）植物叶片 DNA 的提取1、取新鲜的植物叶片约 2g，洗净擦干，剪碎放入研钵中，加入液氮充分研磨至粉末状。
实验四质粒DNA的提取，纯化与鉴定DNA体外重组技术【实验原理】是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组分子转入受体细胞，并筛选出能表达重组DNA 的活细胞，加以纯化、扩增，成为克隆。
【实验步骤】1.分离或合成感兴趣的目的基因及载体---分2.构建、改造作为载体的DNA------------切3.目的基因与载体DNA在体外重组--------接4.重组DNA引入受体细胞----------------转5.阳性重组子的筛选、鉴定、扩增-------筛【注意事项】目的基因的获得：1.从染色体DNA中直接分离2.人工合成3.由mRNA逆转录合成cDNA4.从基因组文库中筛选目的基因5.PCR获得载体的选择：1.能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA片段一同扩增；2.有合适的限制性酶切位点便于进行克隆；3.有一定的筛选标记，易于识别和筛选；4.载体分子应尽量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制；5.表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件；6.生物安全性好。
质粒DNA的提取【实验原理】质粒是细胞质中独立于染色体之外的能自主复制的遗传单位。
基因工程中的质粒一般是指细菌质粒，它可以随着细菌的细胞分裂将自己的遗传特性稳定的遗传给后代细胞。
质粒中除了复制、转录等相关的必需序列外，有一些DNA区段对于细菌来说并非必需序列，通过体外操作以目的基因取代这些非必需区段，这种改造的质粒就成为外源基因载体。
按照质粒载体的用途和其外源DNA的遗传信息能否表达可分为中间克隆载体（如pMD18-T）和表达载体（如pET-X、pBI121等）。
克隆载体所连接的的DNA片段一般没有启动子，因而不能转录，主要用于目的片段的大量制备。
表达载体按照宿主的不同有各种各样的原核表达载体（如大肠杆菌）和真核表达载体（如酵母、动物和植物），目的基因在载体上有完整的启动子和终止子调控，可以在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。
一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳二、实验原理：1.质粒DNA的提取：质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。
除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。
（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。
与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。
进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。
SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。
（2）四种溶液作用及原理：①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。
