华南师范大学实验报告
令狐文艳
液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯
一、实验目的
1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法；
2、
了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术。
二、实验原理
高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
三、主要仪器和试剂
主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测器，
Phenomenex ODS 柱]；10μL微量注射器
试剂：苯标准溶液：10.0μL/mL；
甲苯标准溶液：10.0μL/mL；
苯、甲苯混合标准溶液：10.0μL/mL；
甲醇：80% ；
苯和甲苯混合待测溶液；
四、实验步骤
1、标准溶液的配制系列
用100μL的微量注射器分别量取10μL、20μL、
50μL、100μL的苯和甲苯的混合标准溶液
（10.0μL/mL），再分别加入90μL、80μL、50μL、0μL 甲醇将其稀释，作为待测液，其浓度分别为1μL/mL、
2μL/mL、5μL/mL、10μL/mL
2、色谱条件优化
①按操作规程开机，并调好色谱条件，使仪器处于工作状态。控制流动相流速为甲醇：0.8mL/min、水：0.2 mL/min；柱温30℃；检测波长254nm；观察记录保留时间，通过软件分析两峰分离效果。
②改变色谱条件，控制流动相流速为甲醇：0.95mL/min、水：0.05 mL/min；柱温30℃；检测波长254nm；观察记录保留时间，通过软件分析两峰分离效果。
③通过观察两种色谱条件下的峰分离效果，选择最佳的色谱条件。若还不能达到最佳的分离效果，可以再设定不同的色谱条件，然后根据峰分离效果，选择最佳的色谱条件。
3、苯、甲苯定性分析
在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样5μL苯和甲苯混合待测溶液，5μL苯标准溶液
（10.0μL/mL）和5μL甲苯标准溶液（10.0μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3～5遍)，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。
4、苯、甲苯定量分析
最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样1.0μL/mL 、2.0μL/mL、4.0μL/mL、10.0μL/mL的苯和甲苯混合标准溶液5μL。观察并记录各色谱图上的保留时间和峰面积。绘制苯和甲苯混合标准溶液峰面积与相应浓度的标准曲线。
5、苯和甲苯混合待测溶液分析
最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器进样苯和甲苯混合待测液5μL，观察并记录各色谱图上的保留时间和峰面积。根据峰面积在工作曲线上查出苯和甲苯待测液的浓度，并计算试样中苯和甲苯的含量。
五、实验数据及分析
高效液相色谱数据报告
一、色谱条件优化 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0min 0.00.51.01.52.0μV (x100,000)色谱 二、定性分析
三、 定量
分析 苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为：1 ul/ml, 2 ul/ml, 5 ul/ml,10 ul/ml 。 苯 甲苯
浓度 峰面积 浓度 峰面积
1 ul/ml 212685 1 ul/ml 387710
2 ul/ml 429291 2 ul/ml 747983
5 ul/ml 954537 5 ul/ml 1533892
10 ul/ml 1905343 10 ul/ml 2928373
样品 苯 甲苯 保留时间 3.765 4.917 苯 95% 80%
Y = aX + b
a = 186510.8
b = 36165.15
R^2 = 0.9995768 R = 0.9997884 Y = aX + b
a = 278490.9
b = 146280.5
R^2 = 0.9991048 R = 0.9995523
四、未知样品浓度
未知样品苯甲苯
浓度2 2.7ul/ml 3.6ul/ml
浓度1 2.9 ul/ml 3.6ul/ml
六、实验讨论
①由于实验中待测溶液的组分只有苯和甲苯两种物质，组分比较简单，只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能采用操作、计算简便的标准曲线法得出准确的实验结果，因而采用标准曲线法。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作及计算均较为复杂，实验及数据处理的时间长，效率相对不高，故实验中采用标准曲线法作为定量的方法。
②最佳色谱条件的选择是本实验准确度的关键。若苯与甲苯的峰分离效果过小，苯与甲苯的峰未能完全分离，必定影响其保留时间和峰面积的计算，是实验准确度减小，数据误差加大；若苯与甲苯的峰分离效果过好，虽然能将苯与甲苯的峰完全分离，实验准确度好，但是耗费的实验时间较长，效率不好。因而，应选择合适的色谱条件。
③为了提高标准曲线的拟合度，可以重复进样多次，并且由同一人进样，以免因个体习惯不同引起实验误差。进样针进样时确保进样针中没有残留气泡，另外，在进不同浓度或不同的物质前因先用乙醇溶液润洗干净，以免相互影响。
