重组人促红细胞生成素的研究进展

综 述

重组人促红细胞生成素的研究进展 王丽，周勇* (中国食品药品检定研究院 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室， 北京 100050) 人促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO），是一种高糖蛋白类激素，也是最早发现的细胞因子之一。EPO主要是在肾脏合成分泌，进入血液循环系统，作用于骨髓中的红系祖细胞，促进红系祖细胞增殖、分化和成熟为红细胞。它能够刺激骨髓造血功能，及时有效地增加红细胞的数量，从而提高血液的携氧能力，增强机体对氧的结合、运输和供应能力，改善缺氧状态，是哺乳动物调节红细胞生成的主要调控因子。1989年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了Amgen公司生产的rHuEPO上市，在临床上主要用于治疗肾性贫血以及肿瘤等各种慢性疾患所伴发的贫血。继重组人促红细胞生成素（rHuEPO）出现之后，出现了很多新型的EPO，如新促红血球生成蛋白NESP(new erythropoietin stimulating protein，亦称高度糖基化Epo-Darbepoetin），CERA，EPO 模拟肽EMP（EPO mimeticpeptide）等，为临床治疗提供更好的条件。rHuEPO自从上市以来，rHuEPO可以减少病人输血次数，提高病人的生活品质，成为迄今为止用基因工程代替体液因子治疗人类疾病的一个最成功的范例之一。 1. 人促红细胞生成素的发现 人们对EPO的认识可以追溯到上个世纪初，1906年Carnot 和Deflandre发现：将放血后兔子的血浆注射给正常的兔子，正常兔子的外周血中的红细胞数量增多。他们认为贫血兔血浆中存在一种体液因子能够刺激红细胞生成,并称其为生成素[1]。这对EPO的发展无疑是一项突破。1948年，Bonsdorff和Jalavisto等将这种调控因子命名为红细胞生成素。1950年Reissman用连体鼠试验观察到，给连体之一呼吸低氧空气，另外一只鼠呼吸正常空气，结果两只均呈现同样程度的骨髓红细胞增生现象，这是由于红细胞生成素从低氧鼠进入非低氧鼠从而刺激红细胞的生成。这大大鼓舞人们对EPO的兴趣。1977年Miyake等人从再生障碍性贫血患者的尿液中成功分离提纯人红细胞生成素[2]。在基因工程技术出现以前，人们就是一直利用从贫血病人尿中、山羊和兔子中提取的EPO治疗贫血，可是通过这种方法提取EPO效率非常低，而且极不稳定，临床应用范围窄。1985年Lin和Jacobs等人分离了人EPO基因的cDNA和基因组DNA，并将EPO基因成功转入中国仓鼠卵巢细胞得到高效表达[3-4]，加快了人们对EPO的基础研究，为重组人促红细胞 __________________________________ *通讯作者：Tel:(010)67095684; 周勇E-mail:*******************.cn 生成素进入临床提高可能。1989年，美国FDA批准rHuEPO上市，主要应用于肾功能衰竭贫血患者的治疗。临床试验证明：rHuEPO不仅对肾性贫血有很好的疗效，而且对非肾性贫血如炎症、肿瘤、化疗及移植后贫血的治疗也有广阔的应用前景。根据2010版的生物制药市场分析可知：自1989年批准rHuEPO上市以来,现在总共有8种rHuEPO批准上市，大多都是生物仿制药，rHuEPO一直是全球销售量最大的基因工程药物，每年年销量额都超过百亿美元。 2. EPO的来源 胎儿肝脏是胎儿EPO的主要合成器官[5]。而成年以后肾脏则变成EPO合成的主要场所[6-9]。自1985年EPO基因的成功克隆，人们利用EPO基因cDNA探针进行原位杂交，以及免疫组化方法来确定EPO的生成场所，研究发现肾脏是EPO合成分泌的主要器官[10]。现已明确在肾脏中主要是由肾小管及管旁毛细血管内皮细胞及间质细胞合成分泌。Koury等人研究发现成年机体中有大约10-15 % 的EPO是由肝脏生成[11]。在肝脏中，EPO主要是由肝中央静脉周围肝细胞及肝枯否细胞产生。此外还有研究发现EPO亦可经一些肾脏和肝脏肿瘤、脑血管瘤、子宫肌瘤及卵巢囊肿等合成[12]。 3. EPO的结构及其生物学作用 3.1 EPO的结构 人类EPO基因位于7号染色体长臂22 区( 7q22) [13-15]，全长3000个碱基，含有5个外显子和4个内含子，与鼠源EPO基因序列有85%的同源性，与猴子EPO基因的同源性有95%。他们的EPO基因的同源性不仅表现在编码的氨基酸序列，同时在5'端第一内含子和3’端非编码区高度同源[10]，这种序列上的高度保守性可能与EPO基因表达调控有关。1992年研究表明在EPO基因3’端侧序列上存在顺式作用元件，该作用元件与机体氧含量有关，即为低氧诱导增强子，该低氧诱导增强子大约有50bp碱基，可特异与HIF-1和HIF-2结合。研究发现EPO基因表达的时间特异性和空间特异性，则是由GATA转录因子家族的转录因子结合在5'端启动子区域调节EPO基因的表达[16]。正常生理条件下，血液中的EPO浓度维持在5～20mU/ml。当循环血液中红细胞容积减低或机体缺氧时，HIF-1和HIF-2与低氧诱导增强子结合，上调EPO基因表达，使机体的EPO维持在正常水平[17-18]。此外，低血糖、细胞内钙浓度的增高、雌激素、雄激素、肾上腺素以及一些免疫调节因子亦参与调节EPO生成。 人体编码的EPO是一种糖蛋白类激素，相对分子质量为34000Da.由单链多肽分子骨架和糖基两部分组成。EPO基因编码的多肽为193个氨基酸，N端的27氨基酸组成的信号肽在分泌过程经水解去除，最终在机体中的EPO分子骨架是由165个氨基酸组成，分子量大约为18KD。肽链上有两个二硫键,分别为Cys7与 Cys161， Cys,29与 Cys33[19]。四个糖基化位点，其中3个N-连接和1个O-连接，三个N-连接位点分别为Asn24、Asn38 和Asn83，而1个O-连接位点则是Ser126。38、Asn83和Ser126。肽链通过四个糖基化位点与四个富含唾液酸的糖链相连，糖链由岩藻糖、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖和N-乙酰神经氨酸所组成。N-连接糖链主要形成四分支的复合物，而O-连接糖链只有四个糖基,完整的EPO分子中糖基部分高达相对分子量的40%。EPO 的糖基化程度很高，根据碳水化合物含量的不同可以把天然存在的EPO分成两种类型：α 型(34％ ) 和β 型(26％ )。两种类型EPO 在生物学特性，抗原性及临床应用效果上均相同[20]。EPO的三级结构是由4个反向平行的α螺旋组成和两长、两短的环形结构组成[21-22]，EPO的生物活性不仅与肽链氨基酸相关，而且与糖链也密切相关。研究发现：去除EPO糖链末端的唾液酸残基或者是N-连接的糖链会造成体内活性丧失，而对体外活性没什么影响。 3.2 EPO的生物学功能 EPO是机体刺激红细胞生成的主要细胞因子，调控机体红细胞的生成。在红细胞生成的过程中，EPO与其他生长因子如：干细胞生长因子(SCF) 、干扰素-6(interleukin-6)，类胰岛素生长因子（IGF-1）、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等细胞因子一起协同作用刺激红细胞的增殖和成熟[23],红细胞生成过程如图1。EPO在红细胞生成过程中，主要的靶细胞是红细胞集落形成单位细胞（CFU-E）和红细胞爆增集落形成单位（BFU-E），EPO主要通过阻断红系干细胞从CFU-E到早幼红细胞阶段的细胞凋亡，与其他细胞因子协同刺激红系细胞增殖成熟为红细胞[24-25]，使机体的红细胞维持在正常水平。 图1：红细胞生成过程 Figure1：Production of red blood cells

研究发现：EPO还可以作用于除肾脏与肝脏外的心血管系统、神经系统、消化系统，对系统组织有保护作用。当这些系统组织受损伤时， EPO可以通过抑制细胞凋亡,防止组织缺血再灌注损伤，免疫调节发挥抗炎症作用，促进内皮祖细胞（EPC）趋化，募集EPC到损伤部位，促使新血管生成，加速损伤组织修复[26]。 4. EPO受体（EPOR）及信号传导 4.1 EPO受体 1989年，成功从小鼠红白血病（MEL）细胞克隆了EPO受体基因[27]。1991年成功克隆了人EPO受体cDNA[28]。人的EPO-R 基因位于19 号染色体短臂24 区( 19p24) ，长5 ～ 6.5 kb，由8个外显子和7个内含子构成。编码的EPOR是由507个氨基酸组成，其中24个氨基酸形成单一肽链, 223个氨基酸形成胞浆外部分, 24个氨基酸形成跨膜部分, 236个氨基酸形成胞浆部分，与鼠源的EPOR大约有82%同源性[29]。EPOR是Ⅰ型跨膜蛋白，属于造血因子细胞超家族，这类受体还包括：IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF等细胞因子受体。和其他造血细胞因子一样，其胞外区有4个保守的半胱氨酸残基和5个氨基酸组成的保守结构WSXWS( Trp - Ser - X - Trp - Ser),胞质区中为box1、box22个保守区,为促进有丝分裂与诱导酪氨酸磷酸化配基耦联所必需,细胞质近膜区部分为与JAK2作用所必需。与EPO的合成类似，在机体组织缺氧环境下，EPOR基因的的表达也与HIF-1有关[30]。 研究发现除了在造血红细胞中表达，EPOR还在其他非造血细胞表达，神经细胞、血管平滑肌细胞、视网膜细胞、血管内皮细胞等细胞中表达[31]。根据EPO受体与 EPO的亲和性不同分为高亲和性EPO受体和低亲和性EPO受体 [32-33] ，亲和性EPO受体在造血组织细胞表达，而非造血组织则表达低亲和性的EPO受体。 4.2 EPO受体介导的信号传导机制 EPO受体胞内区本身缺乏酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性，但能够借助细胞内的非受体型酪氨酸蛋白激酶JAK-2（Janus家族蛋白酪氨酸激酶- 2）激活下游通路。当EPO与靶细胞结合时，促使靶细胞膜上的EPO受体结构发生改变，形成同源二聚体，同源化的EPO受体激活在胞内区结合的JAK2激酶，活化的JAK2激酶首先将EPO受体的酪氨酸残基磷酸化, 继而具有SH2 区域的若干信号传导蛋白聚集到磷酸化的酪氨酸残基上, 直接地或间接地被JAK2酪氨酸磷酸化而被活化[34-35]。EPO在造血红细胞中激活的信号通路如图2。

JAK是一类非受体酪氨酸激酶家族，目前发现有4个家族成员，分别是JAK1、JAK2、TYK2 和JAK3。前3者广泛存在于各种组织和细胞中，而JAK3仅存在于骨髓和淋巴系统。它们大小各异，分子量在120kD～140kD之间[36]。Jak家族分子在结构上可分为两大部分：C端是两个紧密连接的酪氨酸激酶活性样结构域，其中最靠近C端的一个是Jak激酶的催化活性区；而位于其N端的另一个激酶样结构域不具有酪氨酸激酶活性，目前认为它可能在Jak激酶与其它信号蛋白分子的结合中起一定作用。 4.2.1 JAK/STAT途径 STAT（Signal tranducer and activator of transcription）是信号传递和转录蛋白，是一类具有SH2功能区的蛋白，并能与靶基因调控区DNA结合的胞质蛋白。目前该家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6七个成员，该家族成员大约由750～900个氨基酸组成。其基本构造为SH2、SH3 区域和羧基末端具有酪氨酸残基。通过SH2 区域与磷酸化了的受体结合,使得激活的STAT蛋白向核质内移动，进入核质区识别特异的碱基序列,调节相关基因的表达。 EPO与靶细胞表面的EPOR结合, 激活胞内JAK2激酶，jak2激酶使EPOR受体的近胞质区域的Y343位酪氨酸残基磷酸化，进而可以激活STAT家族的STAT1、