产志贺毒素大肠杆菌流行病学和stx基因研究进展

CHINA FOOD SAFETY 121分析检测牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定朱应飞，聂　翔，熊丽霞，吴学平，占忠旭，匡佩琳（江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西南昌 330000）摘　要：于2018年9月—2019年3月，每个月从超市和农贸市场中抽取20个样本，共抽取140个牛肉及制品样本，在qPCR初筛时stx阳性率为45.8%，eae的阳性率为52.2%。每月的stx初筛阳性率分别为65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初筛阳性率分别为70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。检出携带stx基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌样本4份，样本阳性菌株检出率为2.9%；检出携带eae基因的肠致病性大肠埃希氏菌样本12份，样本阳性菌株检出率为8.6%。关键词：产志贺毒素大肠埃希氏菌；肠致病性大肠埃希氏菌；分离；鉴定Isolation and Identification of Shiga Toxin Producing Escherichia coli and Enteropathogenic Escherichia coli in Beef SamplesZHU Yingfei, NIE Xiang, XIONG Lixia, WU Xueping, ZHAN Zhongxu, KUANG Peilin(Jiangxi General Institute of Testing and Certification Food Testing Institute, Nanchang 330000, China)Abstract: From September 2018 to March 2019, 20 samples were taken from supermarkets and farmers’ markets every month, with a total of 140 beef and product samples taken. the positive rate of stx was 45.8%, and the positive rate of eae was 52.2%. The monthly positive rates of stx initial screening positive rates of 65%, 60%, 80%, 5%, 25%, 45%, and 40%, respectively; The positive rates of eae initial screening were 70%, 70%, 65%, 0%, 40%, 65%, and 55%, respectively. Four Shiga toxin producing Escherichia coli samples carrying the stx gene were detected, with a positive strain detection rate of 2.9%; From September 2018 to March 2019, 12 samples of enteropathogenic Escherichia coli carrying the eae gene were detected, with a positive strain detection rate of 8.6%.Keywords: Shiga toxin producing Escherichia coli; enterogenic Escherichi coli; separation; appraisal产志贺菌毒素的大肠杆菌（Shiga Toxin Producing Escherichia coli，STEC）和肠致病性埃希氏菌（Enterogenic Escherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原体之一。牛羊等动物作为STEC和EPEC的宿主，可通过粪便污染肉食对人们的健康造成危害[1]。STEC可引起溶血性尿毒症综合征，甚至可能导致死亡[2]。EPEC可引起急性或持续性腹泻，多发于两岁以下的儿童。通常，EPEC会引起急性水样腹泻，并伴有发烧、呕吐和脱水，该病发病迅速，在摄入细菌后几小时后出现症状[3]。本研究旨在用传统平板分离法结合分子生物学方法对江西省南昌市市售牛肉样品中的STEC和EPEC进行分离鉴定。1　材料与方法1.1　仪器与试剂恒温培养箱，上海智诚；实时荧光PCR仪，伯乐；改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基，新生霉素、营养琼脂，北京陆桥；CHROMagar STEC显色培养基，科玛嘉；改良Rainbow O157显色培养基，Biolog；引物和探针，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。基金项目：江西省市场监督管理局科技项目（GSJK202104）；江西省检验检测认证总院科研项目（ZYK202212）。作者简介：朱应飞（1978—），男，湖南浏阳人，本科，高级工程师。研究方向：卫生检验。通信作者：匡佩琳（1965—），女，江西泰和人，本科，主任药师。研究方向：药学。E-mail:138****************。122 食品安全导刊 2023年10月（上）分析检测

大肠埃希菌毒力基因研究进展

张金宝;李晓娜;王桂琴

【摘 要】大肠埃希菌是寄生于人或动物肠道内的一种肠杆菌科的革兰阴性菌，常引起幼畜严重腹泻和败血症、猪水肿病、人的出血性结肠炎-溶血性尿毒综合征、新生儿脑膜炎及肾炎等多种疾病，其毒力基因主要有escs、eaeA、Stx1、Stx2、Stx2e、sep、esp、astA、aggA、hlyE、ST （STa、STb）、LT 等。论文主要介绍eaeA、Stx2e、ST（STa、STb）、astA 4个毒力基因的来源、结构、所致疾病及其与大肠埃希菌耐药性之间的相关性，旨在为动物疾病的传染源及疾病的流行病学调查和防控提供相关证据。%Escherichia coli is a Gram-negative bacteria

of Enterobacteriaceae in the intestine of human or animals .It often causes

severe diarrhea and sepsis in young animals ,pig edema disease ,human

hemor-rhagic colitis-hemolytic uremic syndrome ,neonatal meningitis and

nephritis and other diseases .Its viru-lence genes mainly include

escs ,eaeA ,Stx1 ,Stx2 ,Stx2e ,Sep ,esp ,astA ,aggA ,hlyE ,ST (STa ,

STb) ,LT ,etc .This article briefly described the source ,structure ,the illness

caused of the eaeA ,Stx2e , ST (STa ,STb) and astA ,and the correlation

产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和

耐药性分析1

李咏梅，李凡

吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 1320011

E-mail：mayflower380@

摘 要：本文采用多重PCR（multiplex PCR, mPCR）法对产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga

toxin-producing Escherichia coli, STEC）分离株进行毒力基因的分子生物学鉴定；用WHO

推荐的K-B法对分离株进行抗生素的敏感性测定，以了解stx

1、stx

2、eaeA、hlyA 4种毒力

基因的分布情况，以及分离株对18种抗生素的敏感性。结果显示产志贺毒素的大肠埃希菌

共有46株，其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx

1的有16株（36.9%），

stx

2的有8株（17.4%）；四种毒力基因均存在的有19株（41.3%），血清型为O157:H7，而非

O157:H7血清型的菌株（23/46）中，4种毒力基因同时存在的仅有3株（6.6%），但有13

株（56.9%）hlyA基因阳性。全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄

西林为30.4%，红霉素为69.6%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复

方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。非O157型 STEC耐药菌次为122， 而O157 型为

63。 实验结果证明mPCR法可以快速检测STEC特征性毒力基因，以判定其致病性能。非O157

型STEC对抗生素较易形成耐药性。

关键词：STEC；鉴定; 耐药性

1．引言

STEC是世界上人类食物中毒的重要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病

原菌[1]

。STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157H7，可引

起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶血性尿毒综合症

󰀁第22卷第3期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁宁夏大学学报(自然科学版)2001年9月󰀁Vol.22No.3󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁JournalofNingxiaUniversity(NaturalScienceEdition)Sep.2001文章编号:0253-2328(2001)03-0331-06大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展王玉炯,󰀁许崇波(宁夏大学生物工程系,宁夏银川󰀁750021)摘󰀁要:大肠杆菌的耐热性肠毒素(ST)在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色,对人类和家畜的健康构成很大的威胁.文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征,全面概述了ST的分子生物学研究进展,对于从分子水平全面了解ST的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义.关键词:大肠杆菌;耐热性肠毒素;分子生物学分类号:(中图)R378󰀁2󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁产肠毒素性大肠杆菌(Escherichiacoli,ETEC)是引起幼畜腹泻的主要病原菌.ETEC具有两类致病因子:一类为肠毒素,另一类为粘着素(或称定居因子),已知的粘着素有K88,K99,F41和987P等.ETEC借助这些粘着素定居于宿主肠道粘膜的上皮细胞上,从而大量繁殖,产生大量肠毒素,由肠毒素造成肠粘膜上皮细胞的病理性变化,导致幼畜腹泻[1].ETEC产生两种肠毒素:一种为不耐热性肠毒素(LT),它由一个分子量为28kD的A亚单位结合5个分子量为11.5kD的B亚单位组成,全LT或B亚单位具有良好的免疫原性[2];另一种为耐热性肠毒素(ST),成熟的ST为18或19个氨基酸组成的小肽,有很强的毒素活性,而免疫原性极差.Rebertson综合研究的资料表明,20%~30%的ETEC为LT+/ST-;30%~40%的ETEC为LT+/ST+;而ST-/ST+接近50%.由于ETEC产生的ST在ETEC性腹泻中扮演重要角色,对人类和家畜健康有很大威胁,因此从分子水平研究ST的各种性质、致病机理和免疫原性等,对控制由ST引起的腹泻性疾病具有重要意义.1󰀁ST的一般生物学特性1.1󰀁ST的分类根据ST的生物学特性及致病性,将其分为ST󰀁(又称STa)和ST󰀁(又称STb)两类[2].ST󰀁可溶于甲醇,可引起乳鼠和乳猪肠积水;ST󰀁不溶于甲醇,对乳鼠不引起肠积水,而对断乳小猪可致肠积水.ST󰀁可根据它的来源不同及核苷酸序列的差异分为ST󰀁a与ST󰀁b,ST󰀁a为牛源或猪源(又称STp),ST󰀁b为人源(又称STh),ST󰀁则为猪源性[3].1.2󰀁ST的理化性质不同来源的ST󰀁其理化性质相同.ST󰀁分子呈中酸性,疏水性氨基酸比例高,在低离子强度时易与碱性疏水性多肽聚合.ST󰀁分子量较小,为2000D左右,也有报道为4000D和5000D.18肽的小分子具有3个链内二硫键,因该键属于共价键,键能高,不易破坏,故分子结构高度稳定,因而耐热(在100󰀁30min和121󰀁15min不失活)、耐酸碱(在pH=2~10稳定)、耐多种有机溶剂和表面活性剂;抗各种蛋白酶水解,为肽类毒素中最特殊者;不被淀粉酶、胰蛋白酶、脂酶、链霉蛋白酶、糖化酶等失活.但ST󰀁对可破坏二硫键的氧化剂和还原剂高度敏感,0.1mol/L的2󰀁巯基乙醇、4󰀁10-5mol/L的二硫苏糖醇和过甲酸均可使其失活.可溶于甲醇、丙酮等有机溶剂.经等电聚焦测定,ST的等电点为4.3左右.ST纯化后为白色粉末,其最大吸收波长为275nm,最小吸收波长为255nm.ST󰀁单独不具免疫原性,但与大分子偶联可产生免疫原性.J.C.Frantz[4]将人工合收稿日期:2000-06-12基金项目:国家自然科学基金资助项目(39660060)作者简介:王玉炯(1963-),男,教授,博士,研究微生物学、分子生物学及基因工程等.成的STa连接到载体蛋白上,加上福氏佐剂免疫动物(母猪、母牛)后可产生抗体,且抗体高峰能维持数周,使出生的新生动物对产肠毒性大肠杆菌的攻击有保护作用.1.3󰀁ST的检测对ST󰀁的检测广泛应用的是乳鼠试验,即先将过液培养物(或离心后的上清液)经口灌入2日至4日龄的乳鼠,4h后剖腹取出全部肠管称重,计算肠管与剩余尸体重量的比率,此法简单易行,重复性较好.对ST󰀁的检测是用断乳小猪肠环结扎试验[2],即将4~9周龄断乳小猪麻醉,取其肠段扎成6cm肠环,每环注入5mL菌液或上清液,然后计算肠环中液体与肠段长度的比率(mL/cm).检测ST的免疫学反应主要有放射免疫测定法(RIA)和ELISA等.随着分子生物学的发展,近年来建立了ST基因探针检测方法[3,5~6],应用结果表明,敏感性和准确性俱佳.1.4󰀁ST󰀁的作用机理业已证实,ST󰀁能激活颗粒性鸟苷酸环化酶(GC)[7],而二硫化合物能抑制此酶,从而使ST󰀁无作用.ST󰀁的生物活性具有组织特异性,可使回肠上皮细胞内cGMP(环磷酸鸟苷)增高10倍而结肠下段仅增高1.8倍,对其他组织、器官无活性,此特异性可能与受体分布有关.Mg2+,Mn2+等可增强ST󰀁的作用.ST󰀁的激活作用具有专一性,这是由于ST󰀁对小肠粘膜颗粒性酶比可溶性酶具有更高的亲和力,同时小肠粘膜本身以颗粒性酶为主.有关ST󰀁激活酶的作用机理主要有两种学说:一是󰀁瀑布󰀁学说,认为ST󰀁结合到细胞膜表面,打开钙离子能道,钙摄取增加,激活调钙蛋白,触发磷酸酯酶A2,膜磷脂释放花生四烯酸,后者的过氧化物及过氧化氢代谢物使GC激活,但有的学者认为,ST󰀁并不引起小肠细胞花生四烯酸的释放及改变膜脂成分;二是󰀁直接偶联󰀁学说,该学说认为ST󰀁激活GC是直接的,不需要介导酶,即与已知腺苷酸环化酶激活机理相似,依靠ST受体复合物系统激活.近来,S.A.Waldman研究发现了小肠粘膜颗粒性GC与ST受体偶联的新模式[8],即两者可能通过细胞骨架成分紧密相连.这种偶联可抵抗各种离子、非离子去垢剂、盐及尿素等的溶解,而其他组织上的酶可被上述物质所溶解,但ST受体抵抗溶解作用,说明其他组织中酶与受体无特殊偶联关系.S.A.Waldman观察到GC只有与细胞骨架成分、ST受体结合在一起才被ST󰀁所激活.ST受体及GC定位于细胞膜刷状缘的亚细胞结构中,其中含有丰富的细胞骨架成分,包括肌纤蛋白等不受去垢剂溶解的物质,这些骨架成分提供基质使GC定位于此,并与受体偶联.有趣的是小肠粘膜细胞膜上的cGMP依赖性蛋白激酶也与受体及GC位于相同位置,并与骨架成分紧密相连.进一步研究发现,位于刷状缘的25kD蛋白磷酸化后,在小肠可介导ST󰀁毒素诱导的离子转移.据以上资料推测,ST󰀁引起水和电解质分泌是由刷状缘上ST󰀁受体,GC,cGMP依赖性蛋白激酶,25kD底物蛋白形成一个功能性复合物所介导,这些成分可以共价键形式紧密连接于细胞骨架成分上,并保持一种有利于各种成分相互作用的适当的空间排列结构,从而发挥各自的功能.上皮细胞cGMP增多而引起肠液潴留致泻已予公认,但对其中的机理尚不明了.业已发现,cGMP和cAMP一样,能使电泳性质相似的刷状缘膜和basolateral膜蛋白磷酸化,小肠绒毛上皮细胞内cGMP含量增高,Cl-主动吸收受抑制,跨膜电位和短环路电流增加,8󰀁溴cGMP模拟的短环路电流增加约为8󰀁溴cAMP的1/3,推测ST的作用可能与霍乱肠毒素通过cAMP升高使Na泵磷酸化、Na+吸收障碍导致水泻的机理相似,即cGMP使Cl-转运蛋白磷酸化,Cl-主动转运受抑制,进而肠腔内电解质与水潴留引起腹泻.2󰀁ST的分子生物学研究2.1󰀁ST基因的位点编码ST的基因位于产肠毒素性质粒(Ent)上.含有ST󰀁基因的质粒多是接合性质粒,分子量为46~97MD,与编码性菌毛的F质粒有一定的同源性.含有ST󰀁基因的质粒分子量为21~80MD,至少一部分质粒是接合性质粒.ST󰀁常与定居因子在同一大质粒上,ST󰀁常与LT在同一大质粒上[9].某些ST基因位于转座子上,两端有反向重复序列,称为Tn1681.2.2󰀁ST基因的克隆和表达M.H.W.So等[10]首先报道成功地克隆了ST基因,即将带有ST毒性决定簇的牛源大肠杆菌ESF0041的质粒用EcoR󰀁切出8.9kb的片段,然后与载体pSC101连接,转化到非产肠毒素性大肠杆菌,使ST的产量大约增加3倍,然后又将这一杂种质粒进行亚克隆,用BamH󰀁酶切产生2个片段,大小分别为5.6kb和3.4kb,再分别与pBR322重组,转化后进行筛选检测,发现只有3.4kb片段产生ST.以此再用Pst󰀁消化产生1.7kb,1.4kb和0.3kb332󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁宁夏大学学报(自然科学版)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁第22卷片段,将1.7kb片段再克隆后可产生ST,命名此克隆为pMS3.后来作者又对pMS3进行了亚克隆,用Taq󰀁与Hind󰀁酶切,连接转化后得到了TC1,并确定TC1就是质粒ESF0041含ST󰀁基因的最小DNA片段,大小约473bp[11].S.L.Moseley等[3]用人源ETEC的Ent质粒,经BamH󰀁酶切,把1.9kb的片段克隆到pBR322中,得到重组菌株pSLM003,把pSLM003经Taq󰀁酶切的840bp片段再克隆到pBR322上,构建出高产毒株pSLM004.ST在致病过程中起着非常重要的作用,几乎所有重症腹泻患者的样本中,只要分离到ETEC,大都产生ST.如何增强ST的免疫原性,是当前大肠杆菌肠毒素研究的热门课题之一.L.M.Guzman󰀁Verduzco等[12]用EcoRIt和Hpa󰀁酶切pRIT10250质粒,加入linker后,重组到pUC13上,构建出重组质粒pGK26,再对pGK26进行Hind󰀁和Sst󰀁双酶切后,作为载体分子,把编码LTB的基因片段连在ST下游上,构建出重组质粒pGSK51.J.D.Clements[13]把编码ST的基因片段连在LTB基因的下游,构建出3种不同的ST󰀁LTB融合基因.ELISA检测表明,当LTB基因和ST结构基因之间插入一段7个氨基酸(Asp󰀁Pro󰀁Arg󰀁Val󰀁Pro󰀁Ser󰀁Ser)的linker时,ST的表达水平最高;当两者之间有3个氨基酸(Ile󰀁Pro󰀁Gly)时,ST表达次之;当两者之间不插入氨基酸时,ELISA没有检测到ST的存在.张兆山等[14]采用不耐热肠毒素LTB亚单位基因作为载体分子,将编码ST抗原决定簇的寡核苷酸连接在消除了终止密码子的LTB基因下游,并使之处于同一开放阅读框架中,构建了3种不同的ST󰀁LTB融合基因.核苷酸序列分析证实该融合基因有正确的阅读框架;ELISA检测表明,这些融合基因既能表达LTB,也能表达ST.当LTB基因和ST结构基因之间插入21bp的寡核苷酸时,ST的表达水平最高,比野生菌株高8倍以上;当两者之间插入9bp的linker时,ST表达次之,是E.coliH10407菌株的3倍左右;二者相隔33bp时,ST的表达水平与野生菌株相近.Westrnblotting试验显示了ST󰀁LTB融合蛋白的存在,但该融合蛋白依然还具有ST毒性.许崇波等[15~16]将ST前体蛋白基因(pro󰀁ST󰀁)与󰀁󰀁半乳糖苷酶基因融合在一起,结果表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,且失去了ST󰀁本身的生物学毒性.王玉炯等[17~19]将pro󰀁ST󰀁基因融合在产气荚膜梭菌󰀁󰀁毒素基因的下游,其表达产物具有2种抗原的免疫原性,免疫动物后产生了具有中和活性的抗体,且已失去ST󰀁本身的生物学毒性.目前已用该基因工程菌株制备出双价基因工程灭活苗,在市场上应用效果良好,取得了良好的社会和经济效益wrence等[20]用EcoR󰀁和Hind󰀁双酶切pUC9STb质粒,用Klenow片段补平末端,再用BamH󰀁酶切,然后重组到pKC30上,构建出重组质粒pKC30STb,这使STb的产量比其他野生菌株高10~20倍.R.Urban等[21]把编码phoA的基因片段重组到编码STb的质粒pT7󰀁ST73上,构建成pST󰀁phoA融合基因,其产生的融合蛋白分子量为50000D,具有类似STb的生物学活性,为进一步研究STb提供了很好的材料.2.3󰀁ST核苷酸序列分析对ST󰀁a,ST󰀁b,ST󰀁不同基因的DNA序列分析有助于阐明ETEC的ST群结构.ST󰀁a和ST󰀁b的基因有70%的DNA序列同源,其基因产物C端的18个氨基酸序列是高度保守的,其他序列有68%的氨基酸同源[3].ST󰀁类的毒素基因编码成一条有71个氨基酸的多肽,核苷酸序列不同于ST󰀁基因,这为ST󰀁毒素组成一个不同类群提供了依据[22].从ETEC培养的上清液中已分离出具有ST活性、含18个氨基酸的肽链.对纯化的ST󰀁肽链作序列分析,表明它是由ST󰀁基因的54~72密码子进行编码.在ST󰀁a和ST󰀁b之间,ST肽链18个氨基酸的序列十分恒定[23].A.M.K.Saeed等[24]报道了从牛中分离的E.coliM490,B41,M524产生的ST具有完全相同的氨基酸顺序.这些结果表明了编码ST󰀁的基因是高度保守的,广泛分布于不同寄主来源的大肠杆菌中.M.So等[11]将编码ST󰀁的转座子样片段Tn1681进行亚克隆和插入突变,正确确定了ST󰀁基因在该转座子中的位置,测定了Tn1681中心部分的全部核苷酸序列,从中可以看到这一基因具有在细菌中单独表达所必需的全部特征:-10序列的同源性,16S核糖体结合位点,转译开始、终止信号,转录停止信号.由此核苷酸序列推算出该基因产物是72个氨基酸,氨基端前18个氨基酸多数是亲水的,表明这一区域的多肽起ST󰀁毒素信号序列的作用.该氨基酸序列的另一个特征是半胱氨酸占有很大比例(18%),它们可能形成3对二硫键,使ST󰀁具有非常紧密的构象,从而解释了ST󰀁对热、对酸的稳定性及对氧化剂和还原剂的敏感性.R.A.Houghten等[25]通过测定人工合成的线型ST󰀁分子中二硫键形成的先后顺序,间接测定了3对二硫键的位置,分别为5-10,6-14及9-17.经氧化剂或还原剂处理,ST的生物活性消失,表明二硫键对于ST的生物活性是必需的.333󰀁第3期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁王玉炯等:大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁