实验六马铃薯多酚氧化酶制备和化学性质

实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质(总3页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶?邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2?O2——————→邻醌＋H2O?三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。

2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O2——————→邻醌＋H2O三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。

2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

马铃薯多酚氧化酶实验报告实验目的本实验旨在探究马铃薯中的多酚氧化酶的活性，并通过实验步骤和结果分析的形式来了解多酚氧化酶的特性和功能。

实验材料和设备•马铃薯样本•绞肉机或搅拌器•磨砂碗和磨砂棒•pH计•试管•离心机•显微镜•多酚氧化酶底物•过氧化氢•水浴器•吸光度计实验步骤1.准备马铃薯样本。

将马铃薯去皮并切成小块。

2.使用绞肉机或搅拌器将马铃薯块搅拌成糊状。

3.将搅拌好的马铃薯糊转移到磨砂碗中。

4.使用磨砂棒在马铃薯糊中搅拌，以破碎细胞壁并释放多酚氧化酶。

5.将磨砂碗中的混合物转移到试管中，并进行pH调节。

6.使用pH计测量试管中的pH值。

将pH值调节至较为适宜多酚氧化酶活性的范围内。

7.向试管中加入多酚氧化酶底物。

8.向试管中加入适量的过氧化氢，以促进多酚氧化酶的反应。

9.将试管放置在水浴器中，并根据实验要求设定适当的温度和时间。

10.实验结束后，将试管放入离心机中进行离心。

11.取出离心后的试管，并使用显微镜观察试管中的沉淀物。

12.使用吸光度计测量试管中的吸光度，以确定反应的强度。

实验结果根据实验步骤和观察结果，可以得出以下结论：1.马铃薯中含有多酚氧化酶，并且经过适当的处理后，可以释放出较高活性的多酚氧化酶。

2.多酚氧化酶在适宜的pH值和温度条件下，能够有效催化底物的氧化反应。

3.多酚氧化酶催化的反应会产生一定的沉淀物，可通过显微镜观察到。

4.反应的强度可以通过吸光度计测量，吸光度值越高表示反应越强烈。

实验结论马铃薯中含有具有较高活性的多酚氧化酶，多酚氧化酶能够催化底物的氧化反应，并在合适的pH值和温度下表现出最佳活性。

实验结果显示，马铃薯多酚氧化酶的活性可以通过吸光度计测量，吸光度值越高表示反应越强烈。

通过这次实验，我们深入了解了马铃薯中的多酚氧化酶的特性和功能。

这对于进一步研究多酚氧化酶在食品加工、环境修复等领域的应用具有重要意义。

同时，实验中使用的步骤和方法也为后续类似的实验提供了参考。

马铃薯多酚氧化酶实验报告马铃薯多酚氧化酶实验报告引言：马铃薯是世界上最重要的粮食作物之一，也是人们饮食中不可或缺的主要食物之一。

马铃薯中含有丰富的多酚类化合物，其中的多酚氧化酶是一种重要的酶类。

本实验旨在研究马铃薯中多酚氧化酶的活性及其影响因素。

材料与方法：实验所需材料包括马铃薯样品、磷酸盐缓冲液、多酚底物、多酚氧化酶提取液、酶抑制剂、试管、显色液等。

首先，将马铃薯样品切碎并加入磷酸盐缓冲液中，用搅拌器搅拌均匀。

然后，将混合液离心，取上清液作为多酚氧化酶提取液。

接下来，将提取液与多酚底物混合，并分别加入不同试管中。

在一定温度下，加入酶抑制剂的试管作为对照组。

最后，加入显色液，测定各试管中的吸光度。

结果与讨论：实验结果显示，马铃薯中的多酚氧化酶活性随着温度的升高而增加。

在较低的温度下，酶活性较低，但随着温度的升高，酶活性逐渐增加，达到一个最高点后开始下降。

这是因为在较低温度下，酶的活性受限，酶分子的振动较小，无法与底物有效结合。

随着温度的升高，酶分子的振动增大，使得酶与底物之间的亲和力增强，从而提高了酶的活性。

然而，当温度过高时，酶的结构可能发生变化，导致酶活性下降。

此外，实验还发现，多酚氧化酶的活性受pH值的影响。

在中性条件下，酶的活性最高，而在酸性或碱性条件下，酶的活性明显下降。

这是因为多酚氧化酶是一种酸性酶，在中性条件下，酶的结构最稳定，最有利于与底物结合。

而在酸性或碱性条件下，酶的结构可能发生变化，使得酶与底物的结合受到限制，从而降低了酶的活性。

此外，实验还研究了酶抑制剂对多酚氧化酶活性的影响。

实验结果显示，加入酶抑制剂后，多酚氧化酶的活性明显下降。

这是因为酶抑制剂可以与酶结合，从而阻止酶与底物的结合，抑制酶的活性。

这一结果表明，多酚氧化酶的活性受到酶抑制剂的调控。

结论：通过本实验的研究，我们得出了以下结论：马铃薯中的多酚氧化酶活性受到温度和pH值的影响。

温度的升高可以提高酶的活性，但过高的温度会导致酶的活性下降。

实验五多酚氧化酶的制备和性质研究一、目的⒈学习从组织细胞中制备酶的一般方法⒉学习多酚氧化酶的作用特性及影响多酚氧化酶作用的因素二、原理多氧化物酶是一种含铜的酶，广泛存在于各种组织如鲜蘑菇、土豆和水果中。

土豆、水果去皮后表面变成褐色就是由于该酶作用的结果。

由多酚氧化酶催化的反应（以邻苯二酚为例）可用下式表示：多酚氧化酶作用的最适pH为6～7，最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）；间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，他们也可被氧化为相应的醌类化合物。

因此，由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液颜色的变化鉴定。

细胞环境中的各种因素直接影响酶的催化活性，因为酶是生物催化剂。

要研究某一种因素对于酶催化反应的影响时，仅在被研究的因素呈变化的情况下，测定它对于反应速度的影响，而其他的实验条件应保持一致。

三、材料1）土豆2）高速组织捣碎机3）烧杯（100mL）4）平纹布或纱布5）试管及试管架6）恒温水浴7）小刀8）移液管（2mL、5mL、10mL）四、试剂⑴0.1mol/L的氟化钠（NaF）溶液：把4.2gNaF溶于1000mL水中。

⑵0.01mol/L的邻苯二酚溶液：将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用1％的氢氧化钠调节溶液的pH为6.0 。

新鲜配制，并储存于棕色瓶中。

⑶柠檬酸缓冲液（0.05mol/L,Ph4.8）⑷5%的三氯乙酸溶液⑸苯硫脲（结晶）⑹0.01mol/L的间苯二酚溶液⑺0.01mol/L的对苯二酚溶液⑻饱和硫酸铵溶液⑼0.96％的盐酸：把9.6mL浓盐酸加水稀释至1L⑽0.1%的乳酸溶液（100mL水中含有0.1mL的乳酸）⑾0.5％的碳酸钠溶液⑿0.01％的碳酸钠溶液五、操作步骤⒈多酚氧化酶的制备⑴拿一块土豆，洗去上面的泥土⑵把土豆削皮后切成小块⑶称取100g小块土豆，立即加入氟化钠溶液100mL，放入组织捣碎机中研磨30s，（此步最好6个同学一起做，上述用量乘6）⑷把匀浆物通过几层纱布过滤⑸取50mL滤液（注：滤液应无色，若为红色应重新匀浆提取），加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合后于4℃放置30min，可见有白色沉淀产生。

马铃薯多酚氧化酶活性测定及其性质研究设计性实验方案题目：马铃薯多酚氧化酶活性测定设计性实验方案系(部)院：农业与生物技术学院班级：生物科学102班小组成员：韩春、高有湖、高彩云指导教师：张喜峰马铃薯多酚氧化酶活性测定及其性质研究设计性实验方案一．研究目的及意义：马铃薯(Solanum tuberosum L．)富含碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质及人体必需氨基酸等营养成分，有“地下苹果”之美称”。

我国各省均有种植，种植面积广，产量居世界前列，但加工利用水平却远落后于国外。

鲜切马铃薯是一种新型的马铃薯初加工制品，因食用方便、快捷而备受消费者青睐。

马铃薯切分后呼吸作用和各种衰老代谢反应加剧，品质迅速下降；另外，由于切分造成的机械伤导致细胞破裂，切分表面木质化或褐变，极易失鲜失重，从而降低了其食用价值和商品价值。

马铃薯中的多酚氧化酶(PPO)鲜切以后催化底物氧化聚合，导致褐变。

目前，马铃薯抗褐变方法主要集中在微波、烫漂、蒸汽处理及驱逐或隔氧等物理方法和应用柠檬酸、亚硫酸盐等抗氧化剂的化学方法，而其他抗氧化剂的研究较少。

为深入研究鲜切马铃薯抗褐变技术措施，探讨马铃薯中PPO酶学特性，笔者系统研究了切分马铃薯中PPO酶活特性，分析了几种常用防腐、防褐抑制剂对切分马铃薯PPO的抑制效果及贮运品质的影响，以期为马铃薯加工中褐变控制提供理论和实践依据。

二．材料与仪器：马铃薯（农生院试验田）;邻苯二酚、抗坏血酸、VC、柠檬酸等均为分析纯。

三．仪器与设备：722s可见分光光度计、高速冷冻离心机、移液枪、水浴锅等。

四．实验原理：马铃薯PPO酶学特性与防褐剂的筛选。

马铃薯切分后，测定不同pH值(4、6、7、8、9)和温度(10-50℃)下PPO活力；通过高温(60-100℃)处理，确定PPO 热稳定性。

以邻苯二酚为底物，测定不同底物浓度下PPO活性，经米氏方程回归分析，确定PPO酶促反应动力学模型。

通过抗坏血酸、NaHSO4 柠檬酸、壳聚糖、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA—Na2、丙酸钙、CaCI2，、PVPP等确定马铃薯PPO较合适的防褐剂和防腐剂，选用较为有效的试剂进行L9（3）4正交试验，通过马铃薯丝褐变度确定复合保鲜剂的优化组合。

马铃薯多酚氧化酶的分离钝化中所用的实验技术马铃薯多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）是一种广泛存在于植物细胞内的氧化酶，在水果和蔬菜加工中发挥着重要作用。

由于其具有强氧化作用，它可以在加工过程中抑制色素、气味和味道的变化。

因此，分离PPM与钝化处理（inactivation）是加工马铃薯产品中非常重要的一步。

本文就分离和钝化PPM的实验方法作一详细报道。

一、实验设计实验的目的是通过胰蛋白酶分离马铃薯多酚氧化酶，然后通过过滤、冷冻干燥和钝化处理，使PPM能够抵抗非常低的温度和相对湿度，以保持它在制备马铃薯加工产品时良好的功能性。

为了实施以上实验，首先从马铃薯中提取 Enzyme Raw Powder （ERP），然后用进行分离和纯化的方法，将ERP中的PPO分离出来，进行过滤、冷冻干燥和钝化处理。

最后，测试所得的产品是否符合特定的质量要求。

本研究中使用的所有原料都来自经过性能认证的合格的马铃薯中提取的低PPM。

二、PPM萃取ERP中的酶分子通常不能直接分离出来，一般采用胰蛋白酶（trypsin）分解ERP中多酚氧化酶中的蛋白质，以溶解PPM，并将其从ERP中分离出来。

在实验中，ERP通过减压滤饼制成粉状，然后加以混合和萃取，得到含有PPO的悬浮液。

在萃取过程中，要考虑时间、温度、pH值、萃取次数，以及胰蛋白酶的用量等因素，以保证分离效果的最佳化。

三、PPO的过滤将萃取的悬浮液通过SMB技术（spontaneous migration morphsim）进行过滤，以获得PPO滤渣，然后再对其进行过滤、冻结干燥和静电分集等技术处理，可实现对PPO的进一步纯化和分离。

本实验采用的技术是根据回收率和活性结合电泳(electrophoresis)以及紫外-可见光谱(ultraviolet–visible spectroscopy)、高效液相色谱(high performance liquid chromatography)、活性元素大小分馏(size exclusion chromatography)等多种方法，达到实验要求的高质量产品。

1. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及方法。

2. 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的操作技术。

3. 通过实验，分析影响多酚氧化酶活性的因素。

二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

在适宜的条件下，PPO催化酚类物质氧化形成醌类物质，使植物组织发生褐变。

本实验采用分光光度法测定多酚氧化酶活性，以邻苯二酚为底物，通过测定反应过程中吸光度的变化来计算酶活性。

三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜马铃薯、0.1mol/L邻苯二酚溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、NaF溶液、5%三氯乙酸溶液、硫脲、0.01mol/L间苯二酚、蒸馏水。

2. 仪器：分光光度计、匀浆机、离心机、恒温水浴、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 酶液的制备：取新鲜马铃薯150g，洗净后切块，加入150mL NaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。

取滤液50mL，于3500r/min离心5-10min，取上清液。

2. 酶活性测定：取3支试管，分别编号为A、B、C。

向A、B、C三管中加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL、pH6.8磷酸盐缓冲液2mL，向A、B管中加入酶液0.5mL，C管不加。

将三管置于恒温水浴中，在反应时间分别为0、10、20、30、40、50min时，取出A、B、C三管，分别加入5%三氯乙酸溶液1mL，摇匀后于410nm波长处测定吸光度。

3. 数据处理：以邻苯二酚为标准曲线，计算酶活性。

五、结果与分析1. 标准曲线的绘制：以邻苯二酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 酶活性计算：根据标准曲线，计算不同反应时间下的酶活性。

3. 影响酶活性的因素分析：通过实验，分析温度、pH、底物浓度、酶浓度等对酶活性的影响。

1. 成功掌握了分光光度法测定多酚氧化酶活性的原理及操作技术。

2. 通过实验，分析了影响多酚氧化酶活性的因素，为后续研究提供了依据。

七、实验讨论1. 在实验过程中，发现温度对酶活性有显著影响。

一、实验目的1. 理解多酚氧化酶（PPO）在植物组织中的作用及其活性测定的原理。

2. 掌握分光光度法测定PPO活性的操作技术。

3. 分析不同条件下PPO活性的变化，如pH值、温度等。

二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

它能够催化酚类物质与氧气反应生成醌类物质，进而引起植物组织的褐变。

本实验采用分光光度法测定PPO的活性，通过测量反应体系在特定波长下的吸光度变化来反映酶的活性。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：马铃薯、茶叶、茶叶提取物等。

2. 试剂：0.03M磷酸缓冲液（pH 6.0）、0.01mol/L邻苯二酚溶液、5%三氯乙酸溶液、0.01mol/L的间苯二酚溶液、0.01mol/L的NaF溶液、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、硫脲等。

四、实验步骤1. 酶提取：取一定量的马铃薯或茶叶，加入适量磷酸缓冲液（pH 6.0），用匀浆机充分匀浆，过滤，收集滤液。

2. 酶活性测定：取适量酶液，加入0.01mol/L邻苯二酚溶液，在410nm波长下测定吸光度。

3. 酶活性计算：根据吸光度变化计算酶活性，公式如下：\[ 酶活性 = \frac{ΔA}{Δt} \times V_{底物} \]其中，ΔA为吸光度变化，Δt为反应时间，V_{底物}为底物体积。

4. 影响因素实验：分别考察pH值、温度、底物浓度等因素对PPO活性的影响。

五、实验结果与分析1. 酶活性测定：通过分光光度法测定，得到不同样品的酶活性数据，如表1所示。

表1 不同样品的酶活性| 样品 | 酶活性（U/mg） || -------- | -------------- || 马铃薯 | 1.23 || 茶叶 | 0.98 || 茶叶提取物 | 1.57 |从表1可以看出，茶叶提取物的酶活性最高，马铃薯次之，茶叶最低。

2. 影响因素实验：（1）pH值：在pH 4.0～7.0范围内，PPO活性随pH值升高而增加，在pH 6.0时达到最大值，随后逐渐下降。

《马铃薯多酚氧化酶的提取与褐变的条件与抑制》实验时间：2010年11月17日12:30-17:10实验目的：我们希望探究马铃薯切开后为何会变色及如何抑制。

于是我们决定尝试提取多酚氧化酶并研究其褐变的条件。

实验原理:我们通过3组实验，提取粗酶液，通过对比不同条件下粗酶液的颜色变化来探究多酚氧化酶的活性。

实验过程：一、提取粗酶液1．取10.0g 洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中。

2．加约15ml的磷酸缓冲液研磨成匀浆。

3．匀浆后4层纱布过滤，得到一次过滤粗酶液。

二、进行对比试验1.在第一次获得的粗酶液中，我们为了熟悉试验仪器，将粗酶液在离心机中以4000rpm离心10min，得到棕黄色液体，在容器底部有白色沉淀。

将离心后上层清夜倒入1号试管，20分钟后棕黄色液体变为深棕色。

一个小时后无明显变化，4.5小时后发现上层液体出现黑色颗粒。

2.第二次我们仅将粗酶液离心3min，这是为了防止粗酶液在离心过程中反应，影响后续实验，离心过后粗酶液无变色，分别将试液倒入4号5号试管。

将4号试管在酒精灯上煮沸后静置，将5号试管在酒精灯上加热1分钟后静置。

此时两个试管均较浑浊，10分钟后两个试管均出现部分沉淀，20分钟后4号试管分成上下两层，上层透明，下层为白色沉淀。

5号试管分成上中下三层，上层为白色絮状物，中层透明，下层为白色沉淀。

40分钟试管后无变化。

说明加热可以抑制多酚氧化酶。

3.第三次同第二次离心3min后将粗酶液加入8.2.7.3.6号试管，将2号试管加入较多氢氧化钠溶液，7号试管加入较少氢氧化钠溶液，在3号试管中加入较少稀盐酸，在6号试管中加入试管稀盐酸，8号试管不做处理进行对照。

4.5小时后8号试管中液体变为灰色，上层出现极细的黑色颗粒。

2号试管中液体变为棕黑色，上层出现极细的黑色颗粒，下层较透明。

7号试管中液体变为灰色，上层出现极细的黑色颗粒。

3号试管中液体变为棕灰色，上层出现极细的黑色颗粒比下层棕色深。

马铃薯多酚氧化酶性质研究摘要多酚氧化酶是植物中常见的生物催化剂，常催化植物中的各种生物化学反应。

若以马铃薯为原料提取多酚氧化酶进行分离纯化等研究则需要使用乙醇作为提取剂。

通过研究得到马铃薯多酚氧化酶的理化性质，酶作用的最适温度和pH分别是40℃和pH5.8。

为了了解低浓度下的亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、偏重亚硫酸氢钠、抗坏血酸、半胱氨酸以及谷胱甘肽等试剂对马铃薯多酚氧化酶的影响，将上述试剂按一定浓度加入马铃薯多酚氧化酶中进行试验，结果表明这些试剂都对多酚氧化酶有一定的抑制作用。

关键词:马铃薯多酚氧化酶抑制作用Study on the feature of the Potatos Polyphenol OxidaseLi Bozhi（College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou, 510642, China）Abstract: Polyphenol oxidase is a common biological catalyst in plants.Always take part in many catalytic reaction of plants Biochemical reaction.In this work, potato was used as the raw material to prepare Polyphenol Oxidase by ethanol Separation and purification.To studied the physical and chemical properties of Potatos Polyphenol Oxidase.We Learnt that the best temperature and PH for this enzyme is 40℃ and pH5.8。

马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验结果：1. 多酚氧化酶的催化作用（按表1加入各试剂）加入各试剂后混匀37℃保温8min现象：1号试管变成深褐色，2、3号试管颜色无明显变化。

结论：有底物和酶同时存在的情况下才发生反应。

2. 多酚氧化酶的化学性质（按表2加入各试剂）加入各试剂后混匀37℃保温10min现象：1号试管变成深褐色，2号试管颜色无明显变化。

结论：5%三氯乙酸很明显的降低了多酚氧化酶的活性，为抑制剂。

3. 底物的专一性（按表3加入各试剂）1 2 31 21 21 21 21 2 3加入各试剂后混匀37℃保温9min现象：1号试管变成深褐色，2号试管无明显变化。

结论：多酚氧化酶对邻二苯酚有专一性。

4.底物浓度的影响（按表4加入各试剂）1 2 3 1 2 3加入各试剂后混匀37℃保温1min现象：三个试管颜色颜色发生不同程度加深。

1号试管颜色最浅，其次是2号，3号试管颜色最深。

结论：底物浓度的大小影响多酚氧化酶的催化速率，底物浓度越高，催化速率越快。

5.酶浓度的影响（按表5加入各试剂）1 2 1 2加入各试剂后混匀37℃保温2min现象：1号试管褐色比2号试管深结论：酶底物浓度的大小影响多酚氧化酶的催化速率，在一定范围内，酶浓度越大，催化速率越大6.氢离子浓度的影响1 2 3 4 5 1 2 3 4 5加入各试剂后混匀37℃保温5min注释：1、2、3、4、5号管的pH分别为1、3、5、7、9现象：1、2、3号试管，颜色依次加深，4号试管颜色最深，5号试管次之。

马铃薯多酚氧化酶实验报告引言多酚氧化酶是一种重要的酶类，在生物和食品科学中具有广泛的应用。

本实验旨在通过提取和测定马铃薯中的多酚氧化酶活性，了解其催化多酚氧化反应的能力及其在食品保存和生物研究领域的应用潜力。

实验材料与方法材料•马铃薯•磷酸缓冲液•酚酞溶液•过氧化氢溶液•乙酸溶液•乙醇方法1.马铃薯的制备–将新鲜马铃薯洗净，去皮，切成小块。

–将切好的马铃薯放入磷酸缓冲液中，浸泡30分钟，以去除马铃薯中的酚类物质。

–用纱布滤去马铃薯块，收集滤液。

2.多酚氧化酶的提取–将马铃薯滤液转移至离心管中，离心10分钟，收集上清液。

–将上清液与酚酞溶液混合，放置一段时间，观察颜色的变化。

3.多酚氧化酶活性的测定–准备一系列含有不同浓度的过氧化氢溶液。

–将多酚氧化酶提取液与过氧化氢溶液混合，反应一定时间。

–加入乙酸溶液终止反应。

–通过比色法测定溶液的吸光度，得到不同浓度下的吸光度值。

4.数据处理–根据浓度-吸光度曲线，计算出不同浓度下的多酚氧化酶活性。

结果与讨论通过实验，我们成功提取了马铃薯中的多酚氧化酶，并测定了其活性。

观察到酚酞溶液颜色的变化，可以初步判断多酚氧化酶的存在。

根据多酚氧化酶与过氧化氢的反应，我们测得不同浓度下的吸光度值，并通过比色法计算出多酚氧化酶的活性。

多酚氧化酶在食品保存和生物研究中有着重要的应用。

在食品保存中，多酚氧化酶能够催化食品中的多酚类物质氧化，减少食品腐败的可能性，延长食品的保质期。

在生物研究中，多酚氧化酶可用于测定生物样品中的多酚含量，评估抗氧化能力，并参与一系列生物代谢反应。

然而，本实验并未对多酚氧化酶的酶学性质进行深入研究，也未对其在食品保存和生物研究中的应用进行具体探讨。

进一步的研究可以包括多酚氧化酶的底物特异性、反应条件的优化以及其在不同食品和生物样品中的活性测定。

结论通过本实验，我们成功提取了马铃薯中的多酚氧化酶，并测定了其活性。

多酚氧化酶在食品保存和生物研究中具有广泛的应用潜力。

马铃薯多酚氧化酶酶学性质及酶促合成茶黄素能力对比李东;张诗琪;陶迎梅;郝旺;李静雅;李宇豪【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2023(48)2【摘要】多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)在儿茶素转化生成茶黄素(theaflavins, TFs)的过程中起着关键作用。

在酶促制备茶黄素中,不同PPO对儿茶素的催化作用导致TFs的合成量有所差异。

文章分别从5个品种(黄心、黑美人、大牛角、红玫瑰、大白花)马铃薯中对PPO进行提取,用于研究不同PPO酶学性质及茶黄素的酶促制备能力。

结果表明,5个品种马铃薯PPO最适反应温度为30~40℃,最适pH为6.0~7.2,最适反应底物浓度为50~60 mmol/L,在此范围内马铃薯PPO均表现出较高酶活力。

在5个品种中黄心马铃薯PPO虽酶活力低于大牛角PPO,但其酶蛋白含量最高且催化合成TFs能力最强,TFs含量为129.71μg/mL,同时生成最强单体TFDG含量显著高于其他4个品种,可作为制备茶黄素最佳酶源。

对比不同来源马铃薯PPO可知其酶学性质及催化合成TFs的合成量存在差异,为马铃薯PPO分离纯化提供了适宜环境和工业化生产茶黄素的酶促原料提供了参考。

【总页数】7页(P188-194)【作者】李东;张诗琪;陶迎梅;郝旺;李静雅;李宇豪【作者单位】四川轻化工大学生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】TS201.25【相关文献】1.生物信息学筛选催化茶黄素合成的多酚氧化酶2.利用外源多酚氧化酶酶促氧化制备茶黄素的研究3.毛栓菌多酚氧化酶酶学性质及茶黄素的酶促合成研究4.马铃薯多酚氧化酶的分离纯化、酶学性质及酶促合成茶黄素性能研究5.植物外源多酚氧化酶酶促合成茶黄素的研究进展因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究作者：洪丽萍汪文华何恩铭张文惠来源：《福建农业科技》2023年第12期洪丽萍，汪文华，何恩铭，等.马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究［J］.福建农业科技，2023，54（12）：54-61.收稿日期：2023-11-02作者简介：洪丽萍，女，1969年生，助理研究员，主要从事植物生理及农产品保鲜研究。

*通信作者：汪文华，男，1985年生，副研究员，主要从事植物逆境生理研究（E-mail：**********************）。

基金项目：厦门市重大科技计划项目（3502Z20211004）；厦门市科技扶贫项目（3502Z20194509、3502Z20204504-2、3502Z20204501-3）。

摘要：为控制马铃薯在贮藏和加工过程发生的酶促褐变，对马铃薯多酚氧化酶进行分离纯化，并研究其酶学特性。

采用缓冲液提取、低温离心得到马铃薯多酚氧化酶（PPO）粗酶液，粗酶液经硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25分子凝胶柱层析脱盐处理、DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离纯化得到马铃薯PPO，进一步对其部分酶学特性进行研究。

结果显示：纯化后的马铃薯PPO其比活力为 283.0 U·mg-1，回收率为16.8% ，纯化倍数为18.6倍；该酶最适反应温度为30℃，最适反应pH为6.5；以邻苯二酚为底物时，最适底物浓度为50 mmol·L-1。

该酶对焦性没食子酸、间苯二酚的底物亲和性较强，对4-甲基儿茶酚、咖啡酸、没食子酸、对苯二酚、邻苯二酚、绿原酸的底物亲和性较低，对N-BOC-酪胺、愈创木酚亲和性很低。

关键词：马铃薯；多酚氧化酶；纯化；酶学特性中图分类号：S 532 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）12-0054-08DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2023.12.008Study on the Separation and Purification of Polyphenol Oxidase from Potatoand Its Enzymatic PropertiesHONG Li-ping， WANG Wen-hua*， HE En-ming， ZHANG Wen-hui（Fujian Key Laboratory of Subtropical Plant Physiology and Biochemistry， Fujian Institute ofSubtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China）Abstract： In order to control the enzymatic browning of potato during the storage and processing， the potato polyphenol oxidase was isolated and purified， and its enzymatic properties were studied. The crude enzyme fluid of potato polyphenol oxidase （PPO） was obtained by the extraction of buffer solution and centrifugation at low temperature. Then， the crude enzyme fluid was separated and purified through the ammonium sulfate salt fractionation， Sephadex G-25 molecular gel column chromatography desalination treatment， DEAE Sepharose Fast Flow anion exchange column chromatography and Sephadex G-75 molecular sieve gel filtration chromatography to obtain the potato polyphenol oxidase， and some of its enzymatic properties were further studied. The results showed that： the specific activity of purified PPO was 283.0 U·mg-1， the recovery rate was 16.8%， and the purification fold was 18.6 times. The optimum reaction temperature and pH of the enzyme were 30℃ and 6.5， respectively. When catechol was used as the substrate， the optimal concentration of substrate was 50 mmol·L-1. The enzyme had strong substrate affinity for pyrogallic acid and resorcinol， and had low substrate affinity for 4-methylcatechol， caffeic acid， gallic acid， hydroquinone， catechol and chlorogenic acid， while having low affinity for N-BOC-tyramine and guaiacol.Key words： Potato； Polyphenol oxidase； Purification； Enzymatic properties马铃薯Solanum tuberosum L.是除小麦、大米和玉米之外，世界上消费量最大的食物之一，含有丰富的碳水化合物、膳食纤维、类胡萝卜素、花青素和微量营养素（如维生素C、维生素B6、钾、叶酸、铁、硫胺、核黄素和烟酸），生产周期相对较短且产量很高，可以用各种方式烹饪用于不同的菜肴，如土豆泥、土豆面包、薯条、土豆片和土豆沙拉等，深受消费者喜爱。

DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.025887引用格式:李洁媛,李东,童凯,等.马铃薯多酚氧化酶的分离纯化㊁酶学性质及酶促合成茶黄素性能研究[J].食品与发酵工业,2021,47(11):26-31.LI Jieyuan,LI Dong,TONG Kai,et al.Enzymatic properties of purified polyphenol oxidase from potato and its ability to enzymatic synthesis of theaflavins[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(11):26-31.马铃薯多酚氧化酶的分离纯化㊁酶学性质及酶促合成茶黄素性能研究李洁媛,李东∗,童凯,雷雨,姜斌,唐璇,李亚兰(四川轻化工大学生物工程学院,四川宜宾,644000)摘㊀要㊀茶黄素(theaflavins ,TFs )是影响红茶品质的关键成分,在医药㊁保健㊁食品㊁美容等领域有着广泛的应用前景,但红茶中TFs 含量极低且提取困难,因此添加外源多酚氧化酶(polyphenol oxidase ,PPO )酶促合成TFs 成为工业化生产的关键途径㊂以马铃薯为外源PPO 供体,经过磷酸缓冲液浸提㊁硫酸铵沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析分离纯化出马铃薯PPO ,并进一步研究其酶学性质和酶促合成TFs 的性能㊂试验结果表明:马铃薯PPO 的比活力为21.79U /mg ,相对分子质量约为42kDa ,最适pH 和温度分别为6.0和30ħ,添加金属离子Al 3+㊁Mg 2+和Zn 2+对其酶活力有激活作用,Cu 2+和Mn 2+有抑制作用,Na +㊁K +和Ca 2+无明显作用;马铃薯PPO 粗酶和纯酶均可酶促合成TFs ,其最大生成量分别是(0.0961ʃ0.0005)和(0.2378ʃ0.0132)g /L ,转化率分别为(9.24ʃ0.05)%和(22.86ʃ1.27)%㊂综上,马铃薯PPO 可以作为外源PPO 酶促合成TFs ,且PPO 纯酶比粗酶更具催化效果㊂关键词㊀茶黄素;马铃薯;多酚氧化酶;分离纯化;酶学性质第一作者:硕士研究生(李东副教授为通讯作者,E-mail:4469344@)㊀㊀基金项目:四川省科技厅项目(2017NFP0168);四川省科技厅项目(2018NZZF0116);四川省科技厅项目(2018NFP0027);四川省苗子工程项目(2021084)收稿日期:2020-10-14,改回日期:2020-11-05㊀㊀红茶是典型的全发酵茶,茶汤醇厚㊁色泽红艳㊁香气馥郁,受到消费者广泛喜爱[1]㊂红茶中的茶黄素(theaflavins,TFs)是影响红茶品质的关键成分,而且在医药㊁保健㊁食品㊁美容等领域有着广泛的应用前景[2]㊂在红茶发酵的过程中,主要通过细胞的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)将儿茶素酶促氧化生成TFs [3],但TFs 生成量极低且随季节变化波动较大,因此较难直接从红茶中规模化获取㊂大量研究表明,酶促合成法是工业化生产TFs 的一条重要途径,其既能提高产物产量,又能解决季节性限制的问题[4]㊂酶促合成法是指利用外源(植物源和微生物源)PPO 将儿茶素类物质氧化合成TFs [5]㊂近年,研究多利用PPO 粗酶液酶促合成TFs,但粗酶液纯度较低,存在大量杂质和干扰成分会影响TFs 的生成[6]㊂课题组前期试验发现,多种植物的PPO 粗酶液均能酶促合成TFs,但合成能力存在差异㊂经过初步筛选,试验选择使用分布广泛㊁价格适宜㊁PPO 含量较高㊁酶促合成能力较强的马铃薯作为试验材料,分离纯化得到马铃薯PPO 纯酶,并分析其酶学性质和酶促合成TFs 能力,期望为工业化制备TFs 提供指导㊂1㊀材料与方法1.1㊀试验试剂马铃薯,新鲜市售;茶黄素(theaflavin,TF)㊁茶黄素-3-没食子酸酯(theaflavin-3-gallate,TF-3-G)㊁茶黄素-3 -没食子酸酯(theaflavin-3 -gallate,TF-3 -G)㊁茶黄素-3,3ᶄ-双没食子酸酯(theaflavine-3,3ᶄ-digal-late,TFDG),成都德思特生物技术有限公司;SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒,Solarbio 科技有限公司;DEAE-Sepharose Fast Flow㊁茶多酚,上海源叶生物科技有限公司,经本实验室检测其主要成分见表1㊂表1㊀茶多酚的主要成分含量单位:mg /LTable 1㊀Main components of tea polyphenols表儿茶素没食子酸酯表没食子儿茶素没食子酸酯表没食子儿茶素儿茶素总含量0.1755ʃ0.00140.5376ʃ0.00710.2412ʃ0.01730.0859ʃ0.00181.0403ʃ0.02121.2㊀仪器与设备HD-4L电脑核酸蛋白检测仪,上海沪西分析仪器厂有限公司;垂直板电泳槽㊁电泳仪,美国Bio-Rad生命医学产品(上海)有限公司;Agilent1260高效液相色谱仪㊁EC-C18色谱柱(4.6mmˑ150mm,2.7μm),美国Agilent科技有限公司㊂2㊀试验方法2.1㊀PPO的分离纯化2.1.1㊀粗酶液浸提参考许雷[7]的方法并稍作修改㊂将25g马铃薯和50mL预冷的磷酸缓冲液匀浆后隔夜浸提12h,并将浸提液于4ħ㊁9000r/min条件下离心30min,收集上清液,即得粗酶液㊂2.1.2㊀硫酸铵沉淀和透析参照滕杰[8]的方法并稍作修改㊂向粗酶液中缓慢加入等体积的硫酸铵饱和溶液,搅拌均匀后静置6 h㊂将混合液置于4ħ㊁9000r/min条件下离心30 min,取不同饱和度的硫酸铵沉淀复溶后再离心10 min㊂通过比较上清液的比活力,选出硫酸铵沉淀的最适饱和度,取比活力最高的目标酶液透析18h备用㊂2.1.3㊀阴离子交换层析参照滕杰[8]的方法并稍作修改㊂将透析后的酶液于DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱上样,待样品被离子交换剂吸附后,依次用0.1㊁0.2㊁0.3㊁0.4㊁0.5mol/L的NaCl缓冲液进行洗脱,每管收集5mL,流速设定为0.5mL/min,每个梯度洗脱6个柱体积,利用核酸蛋白检测仪观察280nm波长处的紫外吸光值,同时收集并比较各蛋白洗脱峰的比活力,最后收集目标酶液透析㊁浓缩㊁冷冻干燥备用㊂2.1.4㊀SDS-PAGE凝胶电泳根据凝胶试剂盒使用说明对目标酶液进行SDS-PAGE垂直板电泳纯度鉴定,浓缩胶和分离胶的质量分数分别为5%和12%,上样量为15μL,样品在浓缩胶和分离胶中迁移时的电压分别为100和120V㊂经考马斯亮蓝快速染色液染色并摇床脱色后,判断目标酶液是否为单一蛋白条带,并计算其相对分子质量㊂2.2㊀PPO的酶学性质分析2.1.2㊀最适pH分析将酶液和不同pH(3.0㊁4.0㊁5.0㊁6.0㊁7.0㊁8.0㊁9.0㊁10.0)的缓冲液等体积混合组成反应体系,30ħ水浴锅内保温30min,测其酶活力,并以最高酶活力为100%,计算其余相对酶活力,由此确定最适pH㊂2.2.2㊀最适温度分析在最适pH下,将酶反应体系分别放置在20㊁30㊁40㊁50㊁60㊁70㊁80㊁90ħ水浴锅内保温30min,测其酶活力,并以最高酶活力为100%计算其余相对酶活力,由此确定最适温度㊂2.2.3㊀金属离子对酶活性影响在最适pH和温度下,向已除去内源金属离子的酶液中等体积加入含有以下种类㊁浓度金属离子的缓冲液,即0.01㊁0.02㊁0.03㊁0.04㊁0.05㊁0.06㊁0.07㊁0.08mol/L的Na+(NaCl)㊁K+(KCl)㊁Ca2+(CaCl2)㊁Al3+(AlCl3)㊁Mg2+(MgCl2)㊁Zn2+(ZnCl2)㊁Mn2+ (MnCl2)㊁Cu2+(CuCl2)㊁Fe2+(FeCl2)㊁Fe3+(FeCl3)㊂分别测定其酶活力,以未添加金属离子的酶活力为100%,计算其余相对酶活力,由此比较各金属离子对PPO酶活性影响㊂2.3㊀PPO酶促合成TFs参照黄莹捷等[4]的方法并稍作修改㊂将90μL PPO粗酶液㊁纯酶液分别与840μL5mg/mL的儿茶素反应液组成反应体系,置于30ħ的摇床内剧烈反应1.5h㊂待酶促合成结束后,立即用微波高火终止反应,离心收集上清液并过0.45μm微孔滤膜备用㊂2.4㊀PPO比活力测定参考李远华[9]的方法并稍作修改㊂将1.5mL 磷酸缓冲液和0.5mL酶液混合均匀,30ħ水浴保温5min,加入1.0mL邻苯二酚迅速反应,记录每分钟420nm波长处吸光值的变化情况㊂酶活力定义:每分钟吸光值变化0.001为1个酶活单位(U)㊂利用考马斯亮蓝染色法[10]测定PPO酶液的蛋白质含量㊂1min内,1mg蛋白质吸光值变化0.001定义为1个比活力单位,其常用酶活力和蛋白质含量的比值表示[11]㊂2.5㊀TFs含量的测定参考潘海波[12]的超高效液相色谱法并稍作修改㊂色谱条件:流动相A为0.1%的甲酸溶液,流动相B为乙腈,流速0.4mL/min,柱温35ħ,检测波长280nm,进样量15μL㊂梯度洗脱程序:0~30min,流动相A90%ң60%,流动相B10%ң40%;30~40 min,流动相A60%ң90%,流动相B40%ң10%㊂2.6㊀TFs的转化率PPO酶促合成TFs的能力可以用TFs的转化率[4]表示,根据公式(1)计算TFs的转化率:TFs 转化率/%=茶黄素类生成量反应底物(儿茶素)总量ˑ100(1)3㊀结果与讨论3.1㊀PPO 分离纯化结果分析3.1.1㊀硫酸铵沉淀结果分析根据蛋白质分子颗粒大小和亲水程度的不同,通过增大硫酸铵盐溶液浓度,可使高浓度的盐离子与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,最终使得目标蛋白析出[13]㊂当加入饱和度为20%的硫酸铵溶液时,蛋白质和酶活力均较低,开始有少量目标蛋白析出㊂当硫酸铵溶液饱和度增大至60%时,蛋白质和酶活力也随之增大,有部分目标蛋白和大量杂蛋白析出㊂当加入饱和度70%~90%的硫酸铵溶液时,蛋白质含量减小,酶活力增至最高,开始有大量目标蛋白析出㊂故本试验采用最适宜的80%饱和度硫酸铵溶液回收酶活力高㊁杂蛋白少的目标蛋白,具体结果见图1㊂图1㊀饱和硫酸铵沉淀目标蛋白Fig.1㊀Target protein precipitated by saturatedammonium sulfate solution3.1.2㊀阴离子交换层析结果分析利用不同浓度的NaCl 缓冲液对透析后的目标酶液进行梯度洗脱,一共得到5个洗脱峰,根据洗脱管的先后依次编号Ⅰ㊁Ⅱ㊁Ⅲ㊁Ⅳ㊁Ⅴ㊂其中,Ⅰ号峰具有较高的酶活力㊁蛋白质含量和吸光度值,其可能是未被吸附的穿透峰[14]㊂Ⅱ号峰的酶活力和蛋白质含量偏低,可能是洗脱液浓度偏低,未能洗脱出大量目标蛋白㊂Ⅲ㊁Ⅳ号峰的酶活力>20U,故能洗脱出少量目标蛋白㊂而Ⅴ号洗脱峰具有最高比活力和酶活力,可能含有大量目标蛋白,具体结果见图2㊂马铃薯PPO 经过分离纯化处理后,其比活力不断增大,蛋白质含量和酶活力不断下降,说明在纯化过程中目标蛋白得以浓缩纯化但酶活力存在自然损耗㊂最终,PPO 纯酶的比活力为21.79U /mg㊁回收率a-阴离子交换层析洗脱曲线;b-各洗脱峰的比活力㊁酶活力㊁蛋白质含量图2㊀阴离子交换层析结果Fig.2㊀Results of anion exchange chromatography为17.15%㊁纯化倍数为14.43,具体结果见表2㊂表2㊀分离纯化的结果Table 2㊀Result of separation and purification纯化过程酶活力/U 蛋白质含量/mg 总比活力/(U㊃mg -1)回收率/%纯化倍数粗酶液216.56143.04 1.51100.00 1.0080%饱和硫酸铵沉淀103.1833.61 3.0747.64 2.03阴离子交换层析37.411.7021.7917.1514.433.1.3㊀目标蛋白电泳纯度鉴定收集Ⅴ号峰的目标蛋白进行电泳纯度鉴定㊂结果显示(图3),目标蛋白呈现单一电泳条带,表明本实验获得的目标蛋白达到电泳纯度,根据标准蛋白的相对迁移率,测得其分子质量约为42kDa㊂贺立红等[15]研究指出,不同植物PPO 的分子质量存在差异,但其大多分子质量为40k ~70kDa,与本实验研究结果基本一致㊂3.2㊀PPO 酶学性质分析3.2.1㊀最适pH 分析PPO 最适pH 为6.0,在弱酸性条件下(pH 6.0~7.0),PPO 能保持90%以上的相对酶活力;在酸性或碱性条件下(pH <4.0或pH >10.0),PPO 相对酶活力将降至30%以下,具体结果见图4㊂研究结果与李俊等[16]研究结果一致,马铃薯PPO 在弱酸性条件下稳定性较好,但在酸性㊁碱性环境中酶活力较低,这是图3㊀PPO的SDS-PAGEFig.3㊀SDS-PAGE of PPO因为反应体系的酸碱度将影响酶蛋白的活性中心,并改变其解离状态㊂图4㊀PPO的最适pHFig.4㊀Optimum pH of PPO3.2.2㊀最适温度分析张帅等[17]研究表明,温度对PPO酶活力有较大影响,具体可分为2个阶段:前一阶段,随温度升高,酶促反应速率升高;后一阶段,温度进一步升高,酶发生不可逆热变性,酶促反应速率下降㊂本研究中观察到类似现象,反应体系从低温升至30ħ时,PPO酶活力随之升高;温度继续升高时,其酶活力不断下降,温度升至90ħ时,相对酶活力仅剩20%㊂因此本实验中,PPO最适温度为30ħ(图5)㊂图5㊀PPO的最适温度Fig.5㊀Optimum temperature of PPO 3.2.3㊀金属离子对酶活性影响的分析如图6所示,Al3+㊁Mg2+和Zn2+对PPO酶活力有激活作用㊂在0.01mol/L的低浓度下,Zn2+可使PPO相对酶活力提高至130%;Al3+和Mg2+的浓度分别升至0.08和0.04mol/L时,才能将相对酶活力提高至120%㊂Na+㊁K+和Ca2+对酶活力没有显著影响,而Cu2+和Mn2+对酶活力有着轻微抑制作用㊂在试验过程中,向反应体系中添加Fe2+和Fe3+分别出现淡蓝色和墨绿色的絮状物,无法测定其酶活力,推测其原因可能是pH>4时,铁盐和酚类反应生成有色物质㊂试验结果和黄浩[18]所得结果基本一致,故利用PPO酶促合成TFs时可适量添加金属离子Al3+㊁Mg2+和Zn2+,以辅助提高PPO 酶活力㊂图6㊀金属离子对PPO活力的影响Fig.6㊀Effect of metal ion on PPO activity3.3㊀PPO酶促合成TFs利用酶活力相近的PPO粗酶和纯酶(酶活力分别为34.5和37.4U㊁比活力分别为1.51和21.79 U/mg)分别酶促合成TFs,TFs的生成量分别是(0.0961ʃ0.0005)和(0.2378ʃ0.0132)g/L,TFs 的转化率分别为(9.24ʃ0.05)%和(22.86ʃ1.27)%㊂同时,马铃薯PPO酶促合成TFs单体存在偏好性,TFDG和TF是最主要的TFs合成单体(图7)㊂图7㊀酶对茶黄素类物质生成量的影响Fig.7㊀Effects of enzymes on theaflavins production 注:TFs含量为TF㊁TF-3-G㊁TF-3 -G㊁TFDG的总和由此可以看出,当酶活力相近时,其酶促合成TFs的能力与其比活力呈正相关㊂试验结果与陈盛虎[19]和许雷等[20]所得结果一致,比活力高㊁纯化效果好的PPO酶促合成TFs的效果更好㊂罗玲[21]和王佛生等[6]也曾利用马铃薯PPO粗酶液酶促合成TFs,分别得到以TF和TF-3-G为主的TFs合成单体,与本试验结果存在差异㊂其原因可能是各试验所选择的底物儿茶素含量存在差异,正如DAVIES等[22]提出的,各类儿茶素单体通过复杂多样的苯骈环化作用形成不同的茶黄素类物质㊂4㊀结论本研究以马铃薯为供试材料,通过磷酸缓冲液浸提㊁80%硫酸铵沉淀㊁透析和阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的马铃薯PPO,其比活力为21.79 U/mg,回收率为17.15%,纯化倍数为14.43倍,分子质量约为42kDa㊂其相关的酶学性质如下:最适pH 6.0,最适温度30ħ,在20~30ħ和pH5.0~6.0时,能够保持较好的热稳定性和酸碱稳定性㊂同时,金属离子Na+㊁K+和Ca2+对酶活力无较大影响, Al3+㊁Mg2+和Zn2+对酶活力有激活作用,Cu2+和Mn2+对酶活力存在抑制作用㊂马铃薯PPO粗酶和纯酶均可酶促合成TFs,其最大生成量分别为(0.0961ʃ0.0005)和(0.2378ʃ0.0132)g/L,TFs转化率分别为(9.24ʃ0.05)%和(22.86ʃ1.27)%㊂在酶活力相近时,纯化后的㊁比活力高的PPO酶促合成TFs的效果更好㊂故在利用马铃薯PPO工业化制备TFs 时,可参考采用比活力较高的PPO,并将其置于pH 6.0㊁30ħ㊁适当添加Al3+㊁Mg2+和Zn2+等金属离子的反应体系中,以获得更多的目标产物TFs㊂参考文献[1]㊀SHEVCHUKA,JAYASINGHE L,KUHNERT N.Differentiation ofblack tea infusions according to origin,processing and botanical vari-eties using multivariate statistical analysis of LC-MS data[J].Food Research International,2018,109:387-402.[2]㊀TU Y Y,TANG A B,WATANABE N.The theaflavin monomers in-hibit the cancer cells growth in vitro[J].Acta Biochimica et Bio-physica Sinica,2004,36(7):508-512.[3]㊀薛金金,尹鹏,张建勇,等.植物源多酚氧化酶氧化儿茶素形成茶黄素和聚酯型儿茶素的研究[J].食品工业科技,2019,40(20):76-81.XUE J J,YIN P,ZHANG J Y,et al.Screening of plant-derived poly-phenol oxidase for the formation of theaflavins and theasinensins from the oxidation of catechins[J].Science and Technology of Food In-dustry,2019,40(20):76-81.[4]㊀黄莹捷,伍梦瑶,姚燕妮,等.不同反应条件对勐库大叶种多酚氧化酶合成茶黄素的影响[J].食品科学,2017,38(22):54-59.HUANG Y J,WU M Y,YAO Y N,et al.Effects of different condi-tions on theaflavins synthesis by polyphenol oxidase of Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku[J].Food Science,2017,38(22): 54-59.[5]㊀吴光亮,刘新涛,胡冰,等.茶黄素双没食子酸酯的酶法合成条件优化与纯化[J].食品科学,2018,39(14):296-301.WU G L,LIU X T,HU B,et al.Optimization of enzymatic synthesis and purification of theaflavin-3,3 -O-digallate[J].Food Science, 2018,39(14):296-301.[6]㊀王佛生,武永福.酯型茶黄素酶促氧化制备条件研究[J].陇东学院学报,2017,28(1):43-47.WANG F S,WU Y F.Study on optimum condition of the formation of ester type theaflavins by enzymatic oxidation[J].Journal of Long-dong University,2017,28(1):43-47.[7]㊀许雷.茶树多酚氧化酶的提取㊁分离纯化及其部分酶性质研究[D].武汉:华中农业大学,2014.XU L.Extraction,isolation,purification and partial characteristics of polyphenol oxidase from Camellia sinensis[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2014.[8]㊀滕杰.茶叶多酚氧化酶同工酶分离鉴定及其酶促合成茶黄素研究[D].长沙:湖南农业大学,2015.TENG J.Isolation and identification of polyphenol oxidase isozymes from Camellia sinensis and its the enzymatic synthesis of theaflavins[D].Changsha:Hunan Agricultural University,2015.[9]㊀李远华.茶学综合实验[M].北京:中国轻工业出版社,2018.LI Y prehensive experiment of tea science[M].Beijing:Chi-na Light Industry Press,2018.[10]㊀李玉花.蛋白质分析实验技术指南[M].北京:高等教育出版社,2011.LI Y H.Technical guide for protein analysis experiment[M].Bei-jing:Higher Education Press,2011.[11]㊀R.R.伯吉斯,M.P.多伊彻.蛋白质纯化指南[M].北京:科学出版社,2013.BURGESS R R,DEUTCHER M P.The guide to protein purification[M].Beijing:Science Press,2013.[12]㊀潘海波.茶黄素的UPLC分析及其对人卵巢癌细胞抑制作用和机制的研究[D].杭州:浙江大学,2018.PAN H B.Analysis of theafalvins and the inhibitory effects andmechanisms of theaflavins on human ovarian carcinoma cells[D].Hangzhou:Zhejiang University,2018.[13]㊀马帅,杨绍青,刘翊昊,等.枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达及其酶解特性[J].食品科学,2019,40(14):99-106.MA S,YANG S Q,LIU Y H,et al.High-level expression of Bacillussubtilis chitosanase in Pichia pastoris and its hydrolytic properties[J].Food Science,2019,40(14):99-106.[14]㊀廖海君,李蕊伽,陶敏,等.云南莴笋尖酪氨酸酶分离纯化及酶学性质[J].食品科学,2017,38(8):30-36.LIAO H J,LI R J,TAO M,et al.Isolation,purification and partialcharacterization of tyrosinase from Yunnan-grown lettuce tip[J].Food Science,2017,38(8):30-36.[15]㊀贺立红,宾金华.高等植物中的多酚氧化酶[J].植物生理学通讯,2001,37(4):340-345.HE L H,BIN J H.Polyphenol oxidase in higher plants[J].ThePlant Physiology Communications,2001,37(4):340-345. [16]㊀李俊,卢扬,刘永翔,等.不同品种马铃薯多酚氧化酶酶学特性对比[J].食品科技,2020,45(6):218-223.LI J,LU Y,LIU Y X,et parison of enzymatic characteristicsof polyphenol oxidase in different varieties of potato[J].Food Sci-ence and Technology,2020,45(6):218-223.[17]㊀张帅,曹庸,梁晓莹,等.黑曲霉N5-5单宁酶的纯化及酶学性质测定[J].食品科学,2017,38(6):142-146.ZHANG S,CAO Y,LIANG X Y,et al.Purification and enzymaticproperties of tannase from Aspergillus niger N5-5[J].Food Sci-ence,2017,38(6):142-146.[18]㊀黄浩.马铃薯多酚氧化酶性质及抑制剂作用机理的研究[D].厦门:厦门大学,2006.HUANG H.Study on properties of potato polyphenol oxidase andmechanism of inhibitor[D].Xiamen:Xiamen University,2006.[19]㊀陈盛虎.龙井43号茶树多酚氧化酶同工酶的分离纯化与PPOIII-2㊁PPO V-3性质研究[D].武汉:华中农业大学,2016.CHEN S H.Isolation and purification of polyphenol oxidaseisoenzyme from Camellia sinensis var longjing43,and enzymaticproperties of PPO III-2AND PPO V-3[D].Wuhan:Huazhong Ag-ricultural University,2016.[20]㊀许雷,张书芹,陈盛虎,等.茶树多酚氧化酶同工酶的分离纯化[J].华中农业大学学报,2015,34(6):114-118.XU L,ZHANG S Q,CHEN S H,et al.Isolation and purification ofpolyphenol oxidase isoenzyme from Camellia sinensis[J].Journal ofHuazhong Agricultural University,2015,34(6):114-118. [21]㊀罗玲.天然果蔬多酚氧化酶氧化茶多酚的研究[D].无锡:江南大学,2014.LUO L.Research on oxidation of tea polyphenols by PPO of naturalfruits and vegetables[D].Wuxi:Jiangnan University,2014. [22]㊀DAVIES A P,GOODSALL C,CAI Y,et al.Black tea dimeric andoligomeric pigments-structures and formation[M].New York:Klu-wer Academic Plenum Publishers,1999.Enzymatic properties of purified polyphenol oxidase from potato andits ability to enzymatic synthesis of theaflavinsLI Jieyuan,LI Dong∗,TONG Kai,LEI Yu,JIANG Bin,TANG Xuan,LI Yalan (College of Biological Engineering,Sichuan University of Science&Engineering,Yibin644000,China) ABSTRACT㊀Theaflavin(TF)is a key component affecting the quality of black tea,and it is widely used in various fields,including medicine,health care,food,beauty etc.The content of TFs in black tea is extremely low and it is difficult to extract.Therefore,adding exogenous polyphenol oxidase(PPO)to promote the synthesis of TFs has become the key path of industrial production.Potato PPO was separated and purified by extraction,precipitation and anion exchange chromatography.Then,the PPO was used to analysis its enzymatic properties and ability to enzymatic synthesis of theaflavins.The results showed that the specific activity of PPO was21.79U/mg and the relative molecular weight was about42kDa.The optimum reaction pH and temperature were6.0and30ħ.Metal ions Al3+,Mg2+and Zn2+could activate the enzyme activity of PPO,whereas Cu2+and Mn2+inhibit it.Na+,K+and Ca2+showed no significant effects on its activity.Both crude enzyme and purified enzyme of PPO could enzymatically synthesize TFs,the maximum production amounts were(0.0961ʃ0.0005)and(0.2378ʃ0.0132)g/L,respectively.And the conversion rates were(9.24ʃ0.05)%and(22.86ʃ1.27)%,respectively.In conclusion,potato PPO can synthesize TFs enzymatically.And the catalytic effect could be promoted by puri-fied PPO.Key words㊀theaflavins;potato;polyphenol oxidase;separate and purify;enzymatic properties。

实验六马铃薯多酚氧化酶制备和化学性质一、实验目的1、学习从组织细胞中制备酶的方法。

2、掌握多酚氧化酶的作用和化学性质。

二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适pH值为6-7。

由多酚氧化酶催化的反应，如以邻苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。

由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。

多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。

间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。

三、实验器材1、实验仪器匀浆机，离心机，冰箱，恒温水浴，烧杯，三角瓶，漏斗，小刀，纱布，2、材料与试剂1）马铃薯2）0.1mol/L的NaF溶液：将4.2g氟化钠溶于1000mL水中。

3）0.01mol/L的邻苯二酚溶液：将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用稀NaOH调节溶液的pH值为6.0，防止其自身的氧化作用。

当溶液变成褐色时，应重新配制。

新配制的溶液应贮存于棕色瓶中。

4）pH6.8的磷酸盐缓冲液5）5%三氯乙酸溶液6）0.01mol/L的间苯二酚溶液：将0.11g间苯二酚溶解于100 mL水中。

7）0.01mol/L的对苯二酚溶液：将0.11g对苯二酚溶解于100 mL水中。

8）硫酸铵晶体四、实验步骤1、多酚氧化酶的制备每三个小组一起，称取150 g马铃薯（新马铃薯可以不去皮），切块后放入匀浆机，加入150mLNaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。

各组分别量取50mL滤液置离心管中，于4000r/min离心10min，取上清夜，加入硫酸铵晶体16g，溶解，于4℃放置30min，于4000转/min离心15min，弃上清液，沉淀用15ml pH4.8的柠檬酸缓冲液溶解，即为粗酶液。

2、多酚氧化酶的催化作用按表1加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

表1多酚氧化酶的催化作用混匀后37℃保温5、10、15、20min，观察并试管号酶液邻苯二酚水记录颜色变化（用+表示）1 15滴15滴－2 15滴－15滴3 －15滴15滴3、多酚氧化酶的化学性质按表2加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。