实验六蛋白质制备及含量测定——
微量凯氏（Mirco-Kjeldahl）定氮法
一、实验目的要求
1、了解蛋白质提取的一般方法和原理
2、了解蛋白质含量测定的常用方法
3、学习微量凯氏定氮法的原理
4、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋白质含量的换算等。
二、实验原理
1、蛋白质的提取与制备
蛋白质的提取与制备方法与生物材料的类型及蛋白质的存在部位有关。如果是胞内蛋白，首先必须要进行细胞破碎。细胞破碎的方法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。如果是胞外蛋白，可以根据相应蛋白质的性质进行提取分离纯化。
如果待提取的蛋白质是具有生物活性的蛋白质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防止蛋白质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋白质含量测定
蛋白质含量测定的方法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯氏定氮法等。
3、凯氏定氮
生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：
（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需2～3h，视样品的性质而定。
天然的含氮有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白质分解，而有机氮则变成氨（无机氮），并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”。
但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下：
NH2-CH2 -COOH + 3H2SO4→NH3 + 2CO2↑+ 3SO2↑+ 4H2O
2 NH
3 + H2SO4→(NH4)2 SO4
或2 NH2-CH2 -COOH + 7H2SO4→(NH4)2 SO4 + 4CO2↑+ 6 SO2↑+ 8H2O （2）加碱蒸馏：
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一
定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵根离子。
(NH4)2 SO4 + 2NaOH →Na2SO4 + 2NH3 +2H2O
NH3 + H3BO3→NH4H2BO3
或2NH3 + 4H3BO3→(NH4)2 B4O7 + 5H2O
（3）滴定：
硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数物质的量（相当于待测物中氨的物质的量）计算出待测物中的含氮量，再折算为粗蛋白含量。
NH4H2BO3 + HCl →NH4Cl + H3BO3
或(NH4)2 B4O7 + 2HCl + 5H2O →2NH4Cl + 4H3BO3滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.2~5.6，将NH4H2BO3的绿色滴至原来H3BO3的紫色即为终点。
本法适用于0.2~1.0mg（2.0 mg）氮量测定。相对误差应小于2%。
图3－1 微量凯氏蒸馏装置示意图
1.热源
2. 烧瓶
3. 玻璃管
4. 橡皮管5．玻璃杯6. 棒状玻塞7. 反应室8. 反应室外壳9. 夹子10. 反应室中插管11. 冷凝管12. 锥形瓶13. 石棉网
图3－2 改进型微量凯氏定氮蒸馏装置
1.水蒸气发生器
2. 反应室
3. 水蒸气排气孔
4. 排水排气孔5．外源水入口6. 进样口7. 加样漏斗8. 冷凝器9. 冷凝器出口10. 自来水入口11. 通气室12. 通气室出口13. 通气室出口14. 排水柱1
5. 排水柱入口1
6. 排水柱入口1
7. 冷凝水和废水出口
三、主要实验试剂和器材
1、试剂
（1）消化液（过氧化氢∶浓硫酸∶水＝3∶2∶1）
（2）硫酸钾—硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜（CuSO4·5H2O）以3：1（W/W）的配比混合研磨成粉末。
（3）30%氢氧化钠溶液
（4）2%硼酸
（5）混合指示剂（田氏指示剂）的配制：
方法一：取50mL0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200mL0.1%甲基红无水乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏。
或方法二：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL与0.1%甲基红乙醇溶液2mL混和即成。
本指示剂的变色范围为pH 5.2 → 5.4 → 5.6
紫红色灰色绿色
（6）0.0100 mol·L-1HCl
[（7）硼酸－指示剂混合液：取100mL2%硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可。（约加1mL左右混合指示剂）]
2、待测样品
市售面粉
3、主要器材
（1）分析天平
（2）凯氏烧瓶100mL（×2）
（3）容量瓶（50mL）
（4）刻度吸管（1mL、2mL）
（5）凯氏定氮蒸馏装置
（6）微量滴定管（3mL、5mL，可读至0.02mL）
（7）锥形瓶（50~100mL）
四、操作方法
1、样品处理
液体样品（如血清）可以直接消化，而固体样品中的含氮量是100克该物质（干重中所含氮的克数）来表示（%）。因此在定氮前，应将固体样品中的水份除掉。一般样品干燥的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称入一定量的面粉样品，然后置105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称量一次，直到两次称量的数量不变，即达恒重（±0.0002g）。
精确称取0.1g左右的干燥面粉作为本次实验的样品。
2、消化
取2个100毫升的凯氏烧瓶，向第一号烧瓶内加0.1g面粉样品。注意，加样品时应直接送至烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上，向2号烧瓶加入0.1毫升蒸馏水作空白对照。
在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物约0.2g，消化液（浓硫酸）5mL，玻璃珠1粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。
在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，使瓶内液体微微沸腾，大约维持2 ~ 3h继续消化（待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％过氧化氢溶液1 ~ 2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成）。直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10毫升（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶内容物转入50毫升的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。
注意事项
（1）小心加样，切勿使样品沾污凯氏烧瓶口部、颈部。
（2）消化时，须斜放凯氏烧瓶（45°左右）。火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上。
本次实验消化液已经制备好，备用。从蒸馏开始做。
3、蒸馏
（1）凯氏定氮装置的安装：首先固定主体（蒸汽发生器和反应室），高度适合于热源加热；然后用橡皮管将各相应部位连接，放上自由夹；最后长橡皮管连接自来水和出水口。
