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大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养(一)【摘要】目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养方法。
方法取成年Wistar大鼠的后肢肌肉,利用组织块法培养成肌细胞。
并对培养细胞进行形态学研究和细胞鉴定。
结果采用组织块培养成肌细胞的密度可达118/ml, 成肌细胞的分化鉴定显示94%以上的细胞呈骨骼肌特异的肌细胞。
结论利用组织块法成功培养成年大鼠原代骨骼肌成肌细胞,该方法实用性强,所得成肌细胞纯度高,为深入研究心力衰竭骨骼肌成肌细胞自体移植奠定了基础。
【关键词】骨骼肌成肌细胞原代培养大鼠成年【Abstract】 Objective： To explorean experimental method for primary culture of adult rat skeletalmuscle sarcoblast Methods: Muscle of posterior limb from wistar rat were cultured by tissue culture method. The cells were counted and observed by light microscopy combined with identification. Results:The number of skeletalmuscle sarcoblast118per millilitre. skeletalmuscle sarcoblast cell differentiation accredit showed that over 94% cells were stained positive for myogenin.Conclusions: Tissue culture method conveniently permits the purification and Proliferation of myoblast. These esults provide the basis for future studies to assess the ability of the cells to repair heart failure.【Key words】skeletalmuscle sarcoblast primaryculture rat adult心肌细胞是终末化组织，不能再生。
实验动物（大鼠、小鼠、兔）原代心肌细胞产品编号：RAT/MIC/RAB-iCell-c001产品规格：>5×105细胞数产品价格：3930/3910/4350包装规格：1ml冻存细胞悬液或T-25培养瓶细胞详述：心肌的工作细胞包括心房肌和心室肌。
心肌细胞为短柱状，一般只有一个细胞核，心肌细胞之间有闰盘结构。
该处细胞膜凹凸相嵌，并特殊分化形成桥粒，彼此紧密连接，但心肌细胞之间并无原生质的连续。
心肌细胞的细胞核多位于细胞中部，形状似椭圆或似长方形，其长轴与肌原纤维的方向一致。
肌原纤维绕核而行，核的两端富有肌浆，其中含有丰富的糖原颗粒和线粒体，以适应心肌持续性节律收缩活动的需要。
细胞特性:1)组织来源于实验动物的正常心脏组织。
2)细胞鉴定：肌球蛋白重链(MHC)免疫荧光染色为阳性。
3)经鉴定细胞纯度高于90%。
4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
5)细胞生长方式：长柱状细胞，不规则细胞，贴壁培养。
产品的运输和保存：视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。
1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。
2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。
推荐培养基：我们推荐使用iCell原代心肌细胞培养体系（产品编号：PriMed-iCELL-022）作为体外培养原代心肌细胞的培养基。
产品使用：1)本产品仅能用于科研2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核3)本产品未通过用于活体诊断的审核。
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。
体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。
其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。
目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。
非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。
近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。
心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。
腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。
C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。
CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。
1 材料1.1动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。
1.2 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精。
培养液：培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
1.3 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
2 方法2.1 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2.2 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
2.3 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
心肌细胞组织块法原代培养流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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原代心肌细胞培养曾石秀;廖伟【摘要】目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】3页(P167-169)【关键词】原代心肌细胞;培养;存活率;纯度【作者】曾石秀;廖伟【作者单位】南昌大学医学院,江西南昌330000;赣南医学院第一附属医院心内科,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院心内科,江西赣州 341000【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1原代细胞培养是分子生物学和细胞生物学研究的一项基本技术。
原代心肌细胞可保存其结构和功能上的某些特点，有自发性搏动，不受神经、体液因素的干扰，有利于直接进行生理、病理及药理等多方面的研究［1］。
本研究目的为探讨一种实用的原代心肌细胞培养方法。
1 材料与方法1.1 实验试剂与配制高糖DMEM、胰蛋白酶(Gibco 公司)，Ⅱ型胶原酶、BrdU(5-溴-2＇-脱氧尿苷)、0.4%台盼蓝(Sigma公司)、胎牛血清(Hyclone公司)，α横纹肌肌动蛋白(α-SA)单克隆抗体、免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物工程有限公司)。
1.2 实验动物出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠，雌雄不限［清洁级，江西中医学院，许可证号 SCXK(赣)2010-0001］。
1.3 实验仪器超净工作台(上海博迅公司，型号SW-CJ-2FD)、CO2培养箱(Thermo公司，型号Forma311)、低速离心机(江苏环宇公司，型号80-2型)、高精度恒温水浴箱(上海博迅公司，型号SSW-600-2S)、倒置相差显微镜(Olympus公司，型号CKX 41)等。
第33卷 第6期西北农林科技大学学报(自然科学版)V o l.33N o.6 2005年6月Jour.of N o rthw est Sci2T ech U niv.of A gri.and Fo r.(N at.Sci.Ed.)June2005新生大鼠心肌细胞的分离和培养Ξ刘 霞1,2,王常勇3(1西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;2延安大学生命科学学院,陕西延安716000;3军事医学科学院组织工程研究中心,北京100850) [摘 要] 为获得高纯度和高存活率的心肌细胞,探索心肌细胞大量培养的条件,并为进一步研究心肌细胞的细胞生物学特性奠定基础,同时为生理学和药理学研究提供细胞来源,试验采用胰蛋白酶顺序消化法及差速贴壁法,从1～2d龄新生大鼠的心肌组织中分离心肌细胞,观测心肌细胞的形态、结构、搏动状态和反映心肌细胞代谢状况的生化参数。
结果表明,分离所得的心肌细胞纯度高,培养第3天就开始自发搏动,后连接成片,进而同步收缩;心肌细胞的亚显微结构包括肌丝、Z线、线粒体和大量糖原颗粒,葡萄糖比消耗率为7.44nmo l (个・d),乳酸比产率为3.83nmo l (个・d),乳酸转化率为51%,细胞代谢非常旺盛,说明试验培养条件有利于心肌细胞的气体交换和营养物质的摄取,从而有利于心肌细胞的生长。
[关键词] 心肌细胞;细胞分离;细胞培养;大鼠[中图分类号] Q813.1+1;R318.11 [文献标识码] A[文章编号] 167129387(2005)0620035205 哺乳动物心脏由多种类型的细胞组成,近75%的细胞是非心肌细胞,如成纤维细胞和血红细胞等,心肌细胞占其余心脏细胞的25%,因此心肌细胞体外培养时极易被成纤维细胞污染,并可能影响到心肌细胞的分化[1]。
此外,新生大鼠心肌细胞体外培养时只能利用原代培养物,而心肌细胞的分离易受处理条件及培养技术水平的影响[2],且心肌细胞培养物的伸缩性和细胞间的接触有关,所以形成一个融合成片的单层心肌培养物极其困难。
心肌细胞的分离及培养器械：饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶动物：小鼠准备：用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。
培养过程：1、两个圆皿中加入5ml的PBS培养液，将小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小镊子开胸取心。
2、取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。
3、PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。
4、放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。
5、再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转×10min，弃上清，加培养基为管1。
6、重复第5步，3-8次，直至至组织块消化为止。
7、将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。
8、加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。
9、培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。
10、显微镜观察并计数，细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。
11、4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。
或从第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。
原代心肌细胞培养方法探讨1邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014）周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021）摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。
正常大鼠原代心肌细胞培养
一、实验试剂
1、培养基：PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、冻存液：PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗涤液：1×PBS（pH 7.4）+ 1% P/S
4、染色液：0.4% Trypan Blue
5、消化液：PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、检测试剂：一抗小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白，二抗FITC标记山羊抗小鼠IgG，乙醇丙酮混合液（1∶1）
二、实验器械
1、培养皿
2、培养瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科镊
5、200目网筛
6、玻璃滴管
7、烧杯
8、15ml离心管
三、实验流程
取材
↓
取心肌组织放入D-Hanks中洗涤3次
↓
剪碎至1mm3 +消化液（PriCells）
↓
37℃水浴8min，吸弃上层悬液（非心肌细胞）
↓
余下组织加消化液（PriCells）37℃磁力搅拌10min，60r/min
↓
上层悬液加消化终止液（PriCells）
↓
余下组织再加消化液（PriCells）继续消化3-5次
↓
收集所有混悬液过200目网筛
↓
收集滤液1000RPM/10min
↓
去上清，收集沉淀，2ml培养基重悬
↓
染色计数
四、实验操作
1、培养瓶预包被。
试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
2、取材：出生1—3天幼鼠。
3、材料预处理：将获取的心脏放入含有1% P/S的1×PBS（pH 7.4）中，剪去心房，反复洗涤，至心室内无血渍，洗涤液澄清为止。
4、消化：将心室肌用眼科剪剪成1mm3大小组织块，加入消化液10ml，37℃水浴8min后，吸取上层混悬液遗弃；余下组织加入消化液10ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌10min；吸取上层混悬液，终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块完全消化。
5、终止消化：按1∶1加入消化终止液，中止酶反应。
6、收集重悬细胞：收集中止后的消化液于离心管中，1000 rpm，离心10 min，弃去上清，加入培养液重悬，染色计数细胞。
7、培养细胞密度：调整细胞密度以5 × 105个/ml 接种入培养瓶。
8、培养：放置于37℃，5% CO2培养箱中。
五、细胞鉴定
1、显微鉴定：接种后12h细胞形态变为梭形或不规则扁平状，24h后即可看到单个细胞的自发收缩，继而细胞逐渐铺展伸出伪足，形成不规则的星形，到第3～4天，细胞相互接触交织成网，形成细胞单层或细胞簇。
2、免疫组织化学鉴定：利用α-横纹肌肌动蛋白抗原检测。
3、细胞爬片。
将洗净的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为3×104个/孔，48小时候细胞可以长满，用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。
4、细胞固定：用PBS洗涤细胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空气中自然干燥。
5、特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置4℃孵育过夜。
6、洗涤：1×PBS（pH 7.4）洗涤3次×15分钟，晾干。
7、标记性抗体：加入荧光标记抗体，37℃孵育1h。
洗涤：1×PBS（pH 7.4）洗涤3次×15分钟，晾干。
8、封片：封片剂封片。
9、镜检：荧光显微镜下观察，可见胞浆呈棕黄色染色，表明细胞对α-横纹肌肌动蛋白的表达呈阳性。
六、注意事项
1、选用出生1-3d的幼鼠。
2、在取出心脏之前给实验鼠进行消毒处理。
3、采用多次消化，直到组织块完全消化，减少消化液对细胞的损伤。
4、由于心肌细胞只占总细胞的25%，在接种心肌细胞之前做差速贴壁，除掉大部分成纤维细胞。
5、初分离获得的心肌细胞在生理浓度的钙离子溶液中易丧失收缩活性, 为了保持心肌细胞的收缩功能, 在分离的过程中应采用4℃的无钙离子Hanks＇缓冲液浸泡和冲洗心肌组织。
七、PriCells细胞图片。
