MLP参与心肌肥大发生过程与Calcineurin_NFAT信号通路有关(已阅)
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ISSN 100727626CN 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology2007年8月23(8):660～665
MLP参与心肌肥大发生过程与CalcineurinΠNFAT信号通路有关
桂有静, 安国顺, 倪菊华3, 贾弘
(北京大学医学部生物化学与分子生物学系,北京 100083)
收稿日期:2007204205,接受日期:2007206211
国家自然科学基金项目(No.30200131)3联系人 Tel:010282801622,E2mail:juhuani@bjmu.edu.cn
Received:April5,2007;Accepted:June11,2007SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30200131)3Correspondingauthor Tel:010282801622,E2mail:juhuani@bjmu.edu.cn
摘要 心肌肥大是心肌细胞面对多种病理刺激时的共同反应,以心肌细胞体积增大和胚胎期基因的重新表达为标志.心肌发育调控基因肌肉LIM蛋白(muscleLIMprotein,MLP)的表达异常与心肌肥大有关.为研究MLP参与心肌肥大发生的分子机制,采用去氧肾上腺素(phenylephrine,PE)刺激大鼠原代培养心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,采用RNAi技术敲减MLP的表达,分析MLP与肥大信号通路钙调神经磷酸酶(calcineurin)Π活化T细胞核因子(nuclearfactorofactivatedT2cells,NFAT
)
的关系.结果显示,原代培养的心肌细胞经一定浓度的PE刺激后细胞表面积增加,肥大标志蛋白ANP、BNP表达增高,并伴有MLP表达上调.RNAi方法敲减MLP的表达则明显抑制PE诱导的心肌细胞表面积增加和BNP表达增高,并且直接影响NFAT的转录激活活性,提示MLP与心肌肥大的发生密切相关,并且可能是通过calcineurinΠNFAT信号通路而参与心肌肥大的发生.
关键词 心肌肥大;肌肉LIM蛋白;calcineurinΠNFAT信号通路中图分类号 Q593+.3
InvolvementofMLPinCardiacHypertrophyisRelatedtoCalcineurinΠNFATSignalingPathway
GUIYou2Jing,ANGuo2Shun,NIJu2Hua3,JIAHong2Ti(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,PekingUniversity
HealthScienceCenter,Beijing 100083,China)
Abstract Inresponsetonumerouspathologicstimuli,thecardiomyocytesundergoahypertrophicresponsecharacterizedbyincreasedmyocardialcellsizeandactivationoffetalcardiacgenes.TheabnormalexpressionofmyocardiumdevelopingfactormuscleLIMprotein(MLP)contributestothisprocess.ToinvestigatethemechanismofMLPparticipatesincardiachypertrophy,weusedphenylephrine(PE)toinducehypertrophicresponseinculturedratneonatalventricularmyocytesanddown2regulatedexpressionofMLPwithRNAinterference.TherelationbetweenMLPandcalcineurinΠnuclearfactorofactivatedT2cells(NFAT)signalingpathwaywasanalyzed.IncreasedcellareaandexpressionofANP,BNPwasobservedinPEstimulatedcardiomyocytes.Down2regulationofexpressionofMLPbyRNAinterferencesignificantlyinhibitedPEinducedhypertrophicresponse.Furthermore,activationofcalcineurinΠNFATsignalingpathwaywasreducedinMLPRNAinterferedmyocytesafterPEstimulation.TheseresultsindicatethatMLPisintimatelyinvolvedtheprocessofcardiachypertrophyandpossiblyregulatesthisprocessthroughcalcineurinΠNFATsignalingpathway.Keywords cardiachypertrophy;muscleLIMprotein;calcineurinΠNFATsignalingpathway 心肌细胞是一种终末分化细胞,出生后即失去增殖能力.当心脏负荷增加时,由于心肌细胞不能分裂,所以只能增大体积,以适应负荷增加的需要,从而引起心肌肥大(cardiachypertrophy).心肌肥大是心肌细胞对多种病理刺激的常见应激反应,例如高血压、血管病、各种心肌病和心肌损害、充血性心力衰竭和心律不齐等均可伴随心肌肥大[1,2].尽管诱因多种多样,心肌细胞对肥大刺激具有共同的典型反应,包括细胞表面积增大,蛋白质合成增加,心脏胚胎期基因重新表达,立早基因如c2fos、c2myc的表达等[3].细胞内钙离子(Ca2+)以及钙调神经磷酸酶(calcineurin)ΠNFAT参与心肌肥大的信号转导过程.当心肌细胞受到机械牵张或者心脏负荷增加时,细胞内Ca2+浓度出现反应性增高.多种能引起心肌肥大的激素,如血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ),去氧肾上腺素(phenylephrine,PE),内皮素1(endothelin21,ET21)等,也能使心肌细胞内Ca2+浓度增高.Calcineurin是一种丝氨酸Π苏氨酸蛋白磷酸酶,其活性依赖Ca2+和钙调蛋白(calmodulin).活化T细胞核因子(nuclearfactorofactivatedTcells,NFAT)是calcineurin的直接靶分子.NFAT经calcineurin去磷酸后,由胞浆转位至核内,与转录因子GATA4结合,激活心肌肥大相关基因的转录.Calcineurin或NFAT的持续激活可导致心肌的严重肥大并迅速转为心力衰竭或死亡[4].心肌细胞中calcineurin与α2actinin和calsarcin21形成蛋白复合物,共同定位于Z盘[5].肌肉LIM蛋白(muscleLIMprotein,MLP)是一种横纹肌特有的LIM家族蛋白,含2个LIM结构域.MLP在细胞核和细胞浆均有分布.在细胞核,MLP作为正性生肌调节因子,参与多种肌特异基因的转录调节;在细胞浆,MLP是Z盘的重要组成成分,参与细胞结构的调节[6].MLP基因敲除的小鼠表现出心肌细胞结构紊乱,扩张性心肌病以及心力衰竭[7].人类MLP基因关键位点的突变可导致心肌病的发生[8～10].在心肌梗死及心力衰竭的病人中均发现MLP表达下降[11],表明MLP在保持心肌功能中发挥重要功能.研究发现,MLP与细胞骨架蛋白、信号转导蛋白以及转录调节因子存在相互作用.心肌细胞Z盘骨架蛋白zyxin、α2actinin、N2RAP及telethonin(T2cap)均与MLP有直接相互作用[12,8],MLP基因敲除的小鼠心肌细胞表现出紊乱变宽的Z盘结构,提示MLP对维持心肌细胞正常结构具有重要作用.小鼠心室肌组织提取物中的MLP与calcineurin发生共沉淀,提示MLP不仅参与维持心肌细胞的正常结构,也可能与心肌细胞的信号转导有关.最近的研究发现,生肌调节因子家族(MyoD家族)成员生肌素(myogenin)与MLP相互作用,可促进肌特异基因乙酰胆碱受体(AChR)的表达
[13]
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如前所述,MLP基因敲除导致小鼠产生心肌病和心力衰竭,在心脏病人中发现MLP基因突变及表达下调,但对于MLP究竟是如何参与心肌细胞功能的调节还存在很多疑问.本研究采用PE刺激大鼠原代培养心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,采用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术敲减MLP的表达,分析MLP与肥大信号通路calcineurinΠNFAT的关系.我们发现,MLP的下调能抑制PE诱导的心肌细胞表面积增加和BNP表达增高,但对ANP的表达没有影响.同时发现,MLP表达下调能影响calcineurin2NFAT信号通路的活化,并且抑制心肌细胞的肥大反应.
1 材料与方法111 心肌细胞原代培养心肌细胞按文献[14]所述方法,从新生Sprague2Dawley大鼠心室肌中分离,按1×105Πcm2的密度接
种于用011mgΠml多聚赖氨酸(Sigma)铺板的培养皿中.细胞在含有10%FCS(Gibco)、100IUΠml青霉素、100IUΠml链霉素、011mmolΠLBrdU(Sigma)的DMEMΠmedium199(4∶1)培养基中培养过夜.第2d细胞换用仅含有抗生素和BrdU的DMEMΠM199培养基.形态观察及肥大标志分子检测.
112 质粒构建及转染根据大鼠MLP的cDNA序列,设计MLP的RNAi序列,人工合成互补DNA片段:5′2GATCCCCAGAGACCACCGGAAATGAATTCAAGAGATTCATTTCCGGTGGTCTCTTTTTTA23′和5′2AGCTTAAAAAAGAGACCACCGGAAATGAATCTCTTGAATTCATTTCCGGTGGTCTCTGGG23′,退火后用T4连接酶与BglⅡ和HindⅢ酶切的pSuper载体连接构建重组质粒pSuper2MLPRNAi.p9×NFAT
GL3为含9个NFAT结合位点的荧光素酶(luciferase)报告质粒,由JoergHeineke博士馈赠
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pSuper空载体或pSuperMLPRNAi质粒用Transfectamine2000(Invitrogen)按说明书转入细胞.转染3～5h后,换用无血清培养基,24h后加入PE
