葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质
实验简介：凝胶层析法是用一般的柱层析法使分子量不同的溶质通过具有分子筛效应的介质(如葡聚糖凝胶)，从而达到分离提纯的目的。凝胶层析设备简单，操作简便，条件温和，已成为分离分析蛋白质等生物大分子不可缺少的实验手段。
一、实验目的
1、掌握葡聚糖凝胶柱层析法的工作原理及基本操作技术。
2、掌握蛋白质分离纯化的一般操作技术。
二、实验原理
凝胶层析是按溶质分子大小不同而进行分离的一种层析技术，当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛作用，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验采用葡聚糖凝胶G-50作为固相载体，它适用于相对分子质量范围在1500～30000之间的多肽与蛋白质的分离。当蓝色葡聚糖-2000(相对分子质量在200万以上，蓝色)，细胞色素C(相对分子质量12800，红色)和重铬酸钾(相对分子质量294，黄色)的混合物流经层析柱时，三种物质的分级分离明显可见。蓝色葡聚糖因完全被排阻在凝胶颗粒之外而首先流出，细胞色素C渗入凝胶颗粒内部而其次流出，重铬酸钾则完全渗入凝胶内部最后流出。通过作洗脱曲线便可清楚地表示出葡聚糖凝胶G-50对这三种物质的分离效果。
样品中的各组分的流出顺序，可用有效分配系数K av表示：
K av =(V e-V o)/(V t -V o)
上式中，K av指的是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔径的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。
外水体积V o(outer volume)指基质颗粒之间体积的总和；
内水体积V i(inner volume)指基质颗粒内部体积的总和；
基质体积(V g)指基质自身所具有的体积。V。、V i和V g都是随着床体积和基质性质变化而变化的；
洗脱体积V e(elution volume)指从加样到柱出现最大浓度(峰)时所流过的洗脱液的体积(如图1)。
床体积V t(total volume)指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积。V t是基质的外水体积(V o)和内水体积(V i)以及基质体积(V g)的总和(如图2)。
即：V t=V o+V i+V g=V o+V i
图1 凝胶层析柱洗脱的3部分示意图
图2 凝胶柱床中V t，V o等关系示意图
三、实验用品
1、实验试剂
(1) 葡聚糖G-50(Sephadex G-50)。
(2)洗脱液：pH7.5的0.05mol/LTris-HCl缓冲液。
(3)样品液：蓝色葡聚糖2000、重铬酸钾和细胞色素C(各2～3mg/mL，用洗脱液配制)。
2、实验器材
层析柱(1×20cm)，部分收集器，恒流泵，梯度混合仪等
四、实验操作
1、凝胶处理：将Sephadex G-50加入蒸馏水内，室温溶胀6h或沸水浴中溶胀2h。沸水浴溶胀不但节约时间，而且有消毒(杀死污染的细菌)和排除胶粒内部气泡的作用。用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，反复用蒸馏水洗涤直至无细小颗粒为止(细颗粒存在会影响层析的流速)，然后放到真空干燥器内抽气。凝胶储存在洗脱液内，备用。
2、装柱：垂直装好层析柱，旋紧下盖，向层析柱内加入蒸馏水达柱总长度约1/4。然后将处理好的凝胶在烧杯内用2倍的溶液调成悬浮液，自柱顶端沿管内壁缓缓加入柱中至柱顶，打开底部出水口，随着水的流出，不断注入搅拌的凝胶混悬液，直至床体积沉降至离柱顶约3～4cm为止。装好的凝胶柱要求床面水
平、床体均匀无层次、无纹路或气泡等。否则必须重新装柱。
要注意在任何时候不要使蒸馏水的液面低于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶干裂，分离效果较差，并有可能混入气泡，影响液体在柱内的流动。
3、平衡：柱装好后，旋紧上盖，接上恒流泵，打开出口，用2倍于床体积的洗脱液平衡，流速为0.5mL/min，使层析柱压实并平衡。注意调节流速以防止流速过大及干柱现象。
4、层析床校正：首先肉眼观察层析床是否均匀，有无气泡和分层，床表面是否平整，然后用蓝色葡聚糖进行层析效果的检查。在层析柱中加入lmL(2mg/mL)蓝葡聚糖2000，然后用洗脱液进行洗脱(流速同前)，如移动的指示剂色带狭窄、均一，则说明装柱良好，检查后再经洗脱平衡即可使用，否则应重新装柱。
5、加样：打开层析柱下端出口，当洗脱液的液面恰好盖住床面时，关闭出口。小心地用滴管均匀地沿管壁在床面上加入7～8滴样液，注意防止冲坏床面。再打开底端出口使样液渗入凝胶内，但又不露床面，再用滴管加入少量洗脱液，把床面及附近内壁上的样品洗入胶柱。如此冲洗三次。冲洗时应尽量避免样品稀释过多，否则等于加大加样量而影响分离效果。当洗脱液进柱但又不露床面时，将洗脱液加至层析柱上口以下1cm处接上恒流泵，调好流速，开始洗脱。
6、洗脱与收集：调节洗脱液流速为1mL/min。开始用部分收集器收集(1min/管)，收集到无黄色洗脱液流出为止。目测各管颜色的强度，并用+、++、+++……符号记录各管洗脱液颜色。
五、结果
1、绘制洗脱曲线：以洗脱管数为横坐标，洗脱液的颜色强度(+、++、+++……)为纵坐标(相对指不出洗脱液内物质浓度变化)，在坐标纸上作图，绘出洗脱曲线。
2、计算
(1)蓝葡聚糖2000和重铬酸钾的洗脱体积：V e重、V e蓝；
(2)层析柱外水体积V o；
(3)层析柱内水体积V i；
(4)蓝葡聚糖2000和重铬酸钾的分配系数，k av蓝、k ev重；
(5)凝胶柱床总体积V t。(与测量法所得结果比较)。
六、注意事项
1、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据实际需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组分移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但如柱太长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。
2、各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。
3、装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。
4、始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止
