western blot
（以17KD的H3K9me2蛋白为例）
准备：
（1）电转液：称3.03 g Tris碱， 14.5 g Glycine，加入200 ml甲醛，溶解后加双蒸水定容至1000 ml，4 oC保存。（电转液最好现用现配，但是我咨询过的几个实验室同学，一般是重复使用3-4次的，当然电转液最好每周重新配，即使还没用到3-4次）.
（2） 5×电泳缓冲液：称15.1g Tris碱， 94 g Glycine，5.0 g SDS， 定容至1000 ml，4oC保存。使用时用双蒸水稀释成1×电泳缓冲液。
（3）封闭液：称1.5 g脱脂奶粉，加入30ml TBST充分溶解，现用现配。
（4） 10×TBS 缓冲液：称24.2g Tris碱，80 g NaCl， 加入800 ml双蒸水，整PH到7.6，定容至1000 ml。
（5）1×TBS缓冲液：100ml 的10×TBS 缓冲液，加入0.5mlTween20,再加双蒸水定容至1000ml。
1.细胞总蛋白的提取：（提前开4℃离心机，水浴锅调到100℃，裂解液、PMSF和上样缓冲液取出放在冰盒里溶解）
取出细胞，弃去培养液，加3 ml 4℃预冷的PBS。平放轻轻摇动洗涤细胞，然后弃去洗液，将把细胞消化下来，加入PBS重悬，将悬液移到1.5ML的进口EP管内。加入含PMSF的裂解液（提前按100：1的裂解液：PMSF（100 mM）配好混匀于冰上备用，第一次做可按六孔板一孔加100ul,10cm的培养皿加400ul这个量试试，以后可视蛋白浓度来增减裂解液的量），摇匀置于冰上，超声15min后，取出于4℃下12000 rpm 15min,取上清液。分装出20ul的蛋白用来测蛋白质浓度，余下的蛋白加入5×上样缓冲液（加入的蛋白与5×上样缓冲液的比例为：使最终5×上样缓冲液稀释为1×，例如蛋白360ul, 5×上样缓冲液90ul），100℃煮5-10min,待冷却，放到-80℃保存（可保存一个月）。 2.BCA法测蛋白浓度
westernblot原理及步骤
Western blot原理及步骤。
Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，通过检测特定蛋白在混合物中的存在和量来研究蛋白质的表达和功能。它是一种通过特异性抗体对蛋白质进行识别和检测的方法，具有高灵敏度和高特异性的特点。本文将介绍Western
blot的原理及步骤，希望能对初学者有所帮助。
一、原理。
Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。首先，待检样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上。接下来，膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，再与二抗结合，形成特定的免疫复合物。最后，通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量。
二、步骤。
1. 样品制备。
将待检样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃水浴中煮沸5分钟，使蛋白质变性。然后冷却至室温，并离心去除沉淀物。
2. 凝胶电泳。
将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。根据蛋白质大小选择合适的分离凝胶浓度和电泳条件。
3. 转膜。
将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，通常使用半干法或湿法转膜。
4. 封闭。 将转膜浸泡在牛血清蛋白（BSA）或非脂奶粉的封闭缓冲液中，阻断非特异性结合位点。
5. 抗体孵育。
将特异性的一抗加入封闭转膜的缓冲液中，孵育一定时间，使一抗与目标蛋白结合。
6. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的一抗。
7. 二抗孵育。
将与目标蛋白特异性结合的二抗加入转膜的缓冲液中，孵育一定时间，形成特异性的免疫复合物。
8. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的二抗。
9. 检测。
通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量，最终得到Western blot结果。
总结。
Western blot技术是一种重要的蛋白质分析方法，具有高灵敏度和高特异性的优点。掌握其原理及步骤对于科研工作者来说至关重要，希望本文能够对初学者有所帮助。
一、 western blot 的定义：
即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
二、 western blot 的原理
先制备蛋白质样品，再利用SDS-PAGE原理，分离不同的蛋白质，再将分离的蛋白质进行转膜，以便固定在新膜上进行抗原-抗体结合。用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体（一抗）结合。由于此过程中，可能有未结合到抗原的抗体遗留，故需要清洗，以便保存特异性结合的抗原-抗体结合物。抗原抗体结合物暴露出一个Fc片段，相应的二抗可以结合到这个片段上，形成抗原-一抗-二抗结合物，再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上，由于加入的标记物相对质量分子很大，可以用离心作用将其沉淀下来，如果抗原与抗体结合，便可以一起沉淀下来，最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。
三、Westernblot法操作步骤是：
Westernblot第一步将被分析的蛋白样品做SDS—PAGE凝胶电泳，使样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。
Westernblot法第二步把凝胶中的蛋白转移到膜上(所谓印迹)，其中用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜。蛋白转移的方法多采用电转移，也有用吸印法转移的(原理与Southern
blotting类似)电转移又有半干法和湿法之分，本实验采用后者。
bio-rad专家还提到Westernblot法最后一步是用特异性的抗体检测，看印迹膜上是否存在相应抗原。免疫检测的方法可以是直接或间接的，现在一般都是采用间接免疫配标的方法。在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体(辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的抗第一抗体的抗体)染色，再加酶的底物显色，通过膜上显现出的颜色或经化学发光在x光底片上出现的曙光条带来显示抗原的存在。
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
