荧光原位杂交实验

荧光原位杂交实验步骤嘿，咱今儿个就来讲讲这荧光原位杂交实验步骤哈！这实验呢，就像是一场精心编排的舞蹈，每一个步骤都得踩准点儿。

先说说样本准备吧，这就好比是给舞蹈演员选好合适的服装和道具。

得把样本处理得妥妥当当的，不能有一点儿马虎。

要是样本没弄好，那后面的步骤可就都白搭啦！你说这重要不？接下来是探针标记，这就像是给舞蹈演员化上独特的妆容，让他们在舞台上更加耀眼。

得把探针标记得精准无误，这样才能在后续的过程中准确找到目标呀。

然后就是杂交啦！这就好像是舞蹈演员们在舞台上开始尽情舞动。

要让探针和样本完美结合，就像舞者之间的默契配合一样。

这可不是随随便便就能做到的哟！杂交之后还得进行洗涤，这就好比是舞蹈结束后给演员们清理一下身上的汗水和灰尘。

把那些多余的、不需要的东西都洗掉，只留下最精华的部分。

再之后就是检测啦！这就像是观众们在欣赏舞蹈表演，要能清楚地看到演员们的精彩表现。

通过检测，我们才能知道实验的结果到底怎么样。

最后是分析数据，这就像是对舞蹈表演进行评价和总结。

看看哪些地方做得好，哪些地方还需要改进。

这一步可不能小瞧，它能让我们不断进步呢！你想想看，要是在实验过程中有一步没做好，那不就跟舞蹈中有人跳错了步子一样明显吗？所以啊，每一个步骤都得仔仔细细、认认真真地去做。

做这个实验就跟盖房子似的，每一块砖都得放稳了，房子才能坚固。

咱可不能图快就马马虎虎地做，那最后肯定得出问题呀！这荧光原位杂交实验可是个精细活儿，得有耐心、有细心，还得有那么点儿小技巧。

咱可不能小看了这些步骤，它们就像是一个个小环节，串起来才能完成这个大实验。

就像那句话说的，“千里之行，始于足下”，咱得一步一个脚印地把这实验做好。

总之呢，这荧光原位杂交实验步骤可都不简单，每一步都得用心去对待。

只有这样，咱才能在实验中取得好的结果，才能真正领略到科学的魅力呀！你说是不是这个理儿？。

FISH实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160℃以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、0.2mol/ L (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB试剂为NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。

-----0．2M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P04·2H20,加蒸馏水1000mL溶解-----0．2M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP04·12H2O 加蒸馏水至1000ml溶解----0．2M (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB : 19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。

2、0.03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液（(PBS）试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB------0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸缓冲溶液(PB ，加蒸馏水至1000ml，混匀------0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml------0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存。

3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50℃，------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60℃-------1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。

-------1/3体积的PBS溶液，-------用Hcl将pH调至7.2，定容，-------用孔径为0.22μm的滤膜过滤，----4℃保存最多保存两天，或者取少量保存在-20℃。

（加热时温度不宜过高，为60℃-65℃，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。

微生物荧光原位杂交实验技术背景微生物荧光原位杂交实验技术是在原位杂交技术的基础上发展而来的。

原位杂交技术最早应用于染色体分析，后来逐渐应用于微生物检测领域。

随着荧光标记技术的不断发展，人们开始利用荧光标记探针进行原位杂交，从而提高了检测的灵敏度和特异性。

原理微生物荧光原位杂交实验技术的原理是利用特定的荧光标记探针与细胞中的微生物进行杂交，从而将微生物定性和定量地检测出来。

该技术的基本原理是碱基互补配对原则，即探针的序列与待测微生物的序列互补，从而形成稳定的杂交双链。

利用荧光检测仪器检测荧光信号，从而实现对微生物的定量和定位分析。

实验方法样品的制备：将待测样品进行处理，使微生物细胞分离并保持活性。

探针的制备：将特定的DNA或RNA片段进行标记，形成荧光探针。

杂交反应：将样品和探针在一定条件下进行杂交反应，形成杂交双链。

洗涤和干燥：去除未结合的探针和杂质，保持杂交信号的特异性。

荧光检测：利用荧光检测仪器检测样品的荧光信号，并对数据进行处理和分析。

实验结果通过微生物荧光原位杂交实验技术，我们可以得到样品的定性和定量数据。

实验的成功率较高，特异性较强，能够清晰地检测出目标微生物的存在和数量。

该技术的灵敏度较高，可以检测出低拷贝数的微生物基因，为研究提供了有力的工具。

实验讨论微生物荧光原位杂交实验技术具有许多优势，如高特异性、高灵敏度和能够保持细胞结构的完整性等。

然而，该技术也存在一些不足之处，如探针制备过程较为繁琐、杂交反应条件要求较高以及荧光检测仪器价格昂贵等。

荧光探针的稳定性也可能影响实验结果的可靠性。

因此，在应用该技术时需要注意这些因素，并选择合适的探针和实验条件，以保证实验结果的准确性和可靠性。

结论微生物荧光原位杂交实验技术在研究领域具有广泛的应用前景。

除了在微生物检测方面的应用，该技术还可以应用于其他领域，如基因表达分析、细胞凋亡研究等。

虽然该技术存在一些不足之处，但随着技术的不断发展和优化，相信未来会有更多的应用前景等待着我们去探索和发现。

rna荧光原位杂交实验过程RNA 荧光原位杂交实验啊，这可是个有趣又有点复杂的事儿呢！咱就一步步来聊聊。

首先呢，得准备好样本，就像要给房子打地基一样重要。

这样本可得处理得妥妥当当，不能有啥马虎。

然后就是探针啦，这探针就像是寻找宝藏的钥匙，得选对选好，不然可找不到咱要的目标 RNA 呢。

接下来就是杂交这一步啦，把样本和探针放在一起，让它们好好地“亲密接触”一下，这过程就好像是一场浪漫的约会，得让它们相互融合，产生奇妙的反应。

杂交完了可不能就不管啦，还得进行各种清洗，把那些多余的、不相关的东西都洗掉，就跟打扫房间一样，把垃圾都清理掉，只留下最精华的部分。

再之后就是染色啦，给咱的目标 RNA 染上漂亮的颜色，让它在显微镜下闪闪发光，就像给明星化个美美的妆，让大家都能一眼看到它的风采。

最后就是观察啦，把样本放在显微镜下，瞪大眼睛仔细瞧，看看咱的实验成果到底咋样。

这时候就像是开奖一样，紧张又期待呢！你说这 RNA 荧光原位杂交实验像不像一场精心编排的舞台剧呀？每一步都很关键，都不能出错。

从准备样本到最后观察，每一个环节都得认真对待，不然可就演砸啦！在这个过程中，可得有耐心啊，不能着急。

就像做饭一样，火大了不行，火小了也不行，得恰到好处。

而且还得细心，不能有一点马虎，一个小细节没注意到，可能结果就完全不一样啦。

你想想啊，如果探针选错了，那不就像钥匙拿错了，根本打不开宝藏的门嘛！还有清洗的时候，如果没洗干净，那后面看到的不都是些乱七八糟的东西，哪还能找到咱要的目标 RNA 呀！所以啊，做这个实验可不能掉以轻心，得打起十二分的精神来。

这不仅是对科学的尊重，也是对自己努力的尊重呀！总之，RNA 荧光原位杂交实验就是这么个既有趣又充满挑战的事情，只有认真对待，才能收获满意的结果呢！你说是不是呀？。

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。

下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。

非生物学专业的同学请不要往下看了。

1 载玻片涂层处理（Slide coating）(1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟(3) 放入60℃烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干2样品固定（Sample fixation）(1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛（paraformaldehyde），置于4℃冰箱固定3小时以上或者过夜(2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS(3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1)(4) 固定后的样品放入-20℃冰箱保存。

3 脱水（Dehydration）(1) 将适量固定后的样品放在载玻片上，(2) 放入46℃烘箱烘干10分钟(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟(4) 在空气中晾干4 杂交（Hybridization）(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法见下面表格）到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖(2) 在Hybridization buffer上加1微升探针（Probe）(3) 在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46℃恒温箱，杂交1.5小时(4) 将Washing buffer（配制方法见下面表格）预热到48℃，准备下一步使用5冲洗(1) 杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48℃Washing buffer(2) 在48℃恒温箱中放置30min(3) 用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干6镜检晾干后，将样品用适量的antifading reagent 覆盖，盖上盖玻片，然后就可以放到共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy）下观察了。

荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。

下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。

1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。

可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。

2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。

固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。

这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。

4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。

常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。

-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。

5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。

探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。

探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。

6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。

杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。

杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。

7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。

8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。

荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。

根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。

9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。

使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。

总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。

仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OL YMPUS BX51荧光显微镜；4、OL YMPUS DP11数字显微照相机。

FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。

（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。

每次新鲜配制。

（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。

每次新鲜配制。

调节pH前升至室温。

实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。

将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。

37℃孵育20min。

3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。

3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。

4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

荧光原位杂交检测报告
一、检测目的
本次检测旨在探究目标基因在细胞核内的位置以及其存在的数量，以确保基因研究可靠性及准确性。

二、检测方法
采用荧光原位杂交技术（FISH）进行检测。

首先，获取样本组织切片并制备。

然后，利用荧光信号染色体常规核型分析技术，将采集的细胞进行体外细胞培养，用血白进行标本制备，完成荧光原位杂交，最后在荧光显微镜下观察目标基因信号。

三、检测结果
本次检测结果显示：目标基因存在于细胞核的特定区域且数量适当，未出现缺失或多余现象。

具体细节如下：
1. 细胞核内目标基因存在的数量为正常情况下的1个；
2. 目标基因位于常染色体的20号染色体的长臂上；
3. 目标基因信号强度适中，无杂乱信号干扰；
4. 目标基因存在于所有观察到的核中，未出现缺失现象。

四、检测结论
本次荧光原位杂交检测结果显示目标基因存在于样本组织细胞核内且数量适当，位置确定，验证了该基因在实验研究中的可靠性和准确性。

鉴于本次检测结果，应确保实验人员、化学品、仪器设备、试卡等相关实验材料的检测标准及操作规范，提高实验质量及结果准确率。

五、附注
1. 此次检测的基因为【填写基因名称】；
2. 本次检测结果仅供参考，如需获取更多相关信息或进一步检测，请再次联系本实验室。

荧光原位杂交操作步骤荧光原位杂交听起来很复杂呢，其实操作步骤也有章可循啦。

一、样本准备。

要做这个实验，先得把样本处理好。

如果是细胞样本的话，就得把细胞乖乖地固定在载玻片上，就像把小娃娃放在小床上一样安稳。

这一步可不能马虎，固定不好后面就不好办啦。

要是组织样本呢，得把组织切成薄片，薄到像纸片一样精致才行。

然后同样把它固定好，这就为后面的杂交打下了好基础。

二、探针准备。

接下来就是探针啦。

探针就像是专门去找目标的小侦探。

得按照实验要求把探针配好，浓度要刚刚好哦，太浓了可能会乱了阵脚，太稀了又可能找不到目标。

把探针在合适的缓冲液里调配好，就像给小侦探准备好装备一样。

三、杂交反应。

然后就到了杂交这一步啦。

把准备好的探针滴到有样本的载玻片上，再盖上盖玻片。

这时候就像把小侦探放到了有目标的地方，让它们去寻找匹配的东西。

然后把载玻片放到一个合适温度的环境里，这个温度很关键呢，就像给小侦探们创造一个舒适的工作环境。

在这个环境里让探针和样本中的目标DNA或者RNA去结合，这个过程需要一点时间，就像小侦探寻找目标也不能太着急呀。

四、洗涤。

杂交完了之后呢，就要把那些没有结合的多余探针洗掉。

这就像是把那些凑热闹的家伙赶走，只留下真正找到目标的小侦探。

用合适的洗涤液轻轻地洗，可不能太粗暴，不然把已经结合好的也冲走了就糟糕啦。

五、检测。

最后就是检测啦。

这时候要用专门的荧光显微镜去看。

打开显微镜，就像打开一个神秘的宝藏盒子。

如果杂交成功了，就能看到漂亮的荧光信号啦，就像在黑暗中看到了闪闪发光的小星星。

那些荧光信号所在的地方就是探针找到目标的地方呢。

荧光原位杂交虽然有点复杂，但是按照这些步骤一步一步来，就像照顾小宠物一样细心，也能顺利完成这个有趣的实验啦。

荧光原位杂交实验（FISH）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。

1实验方法原理：荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。

FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。

间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。

FISH（原位杂交）SOP流程------探针直接带荧光标记一、FISH实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水：将挑选好的组织切片置于切片架上放入烘箱中65℃烤片2-3h（观察组织周围石蜡是否被熔化流至切片边缘），烤片完成后将组织切片放入脱蜡机中脱蜡。

脱蜡完成后取出切片，进行抗原修复。

2、抗原修复：脱蜡完成后取出切片，进行酶修复。

稍甩净切片上水分，水平放置在孵育盒，用组化笔在组织周围画圈（过程中组织不能干片，组化笔不能碰到组织，否则会损坏组织或使抗体无法孵育到组织；不可用力按压组化笔以免笔内液体流出覆盖组织），蛋白酶K（PK）37度孵育15-20min，修复完后用PBS冲洗，再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、固定：甩去残留在片子上的PBS，滴加4%多聚甲醛，室温孵育5min。

用PBS冲洗。

再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、预杂交：滴加Hyb buffer（预杂交液）55度避光预杂交2小时。

5、准备探针：将探针原液与Hyb buffer按比例稀释，混合均匀后85℃变性3min,37℃平衡2min。

6、杂交：预杂交结束后，吸去Hyb buffer，滴加平衡后的杂交工作液，切片平放于湿盒内，37-42°C（杂交温度依据探针TM值确定）孵育过夜（湿盒内加少量水防止杂交液蒸发）。

7、洗涤：用1XSSC冲洗，浸泡2min。

（洗涤时间不宜过长，可能会洗掉表达）。

8、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育20min。

9、封片：PBS冲掉DAPI，切片稍甩干后用WGA封片剂封片（封片时应避免组织上出现气泡）。

10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

（蓝光紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）二、荧光结果判读DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。

组织荧光原位杂交
实验
组织荧光原位杂交实验是一种检测特定基因在细胞内表达情况的技术，可以在不破坏细胞形态的情况下进行。

它是利用DNA核酸合成技术，将一个DNA序列克隆到一个载体中，然后将该载体转染到细胞中，使之与目的基因杂交，并通过荧光技术检测杂交体的存在及其强度，从而间接检测目的基因的表达情况。

实验步骤如下：
1.准备探针：准备荧光标记的探针，一般采用双螺旋DNA或cDNA作为探针，将它们与特定荧光染料混合，得到荧光探针。

2.准备细胞：采用细胞培养和支持剂，将细胞培养到最佳密度，以便可以在实验中检测到荧光信号。

3.细胞转染：将探针转染到细胞中，以进行原位杂交实验。

4.荧光检测：采用荧光显微镜技术，检测转染后细胞的荧光信号强度，从而检测出目的基因的表达情况。

实验四荧光原位杂交实验一、实验目的1.掌握核酸杂交的基本原理、过程和操作；2.熟练掌握荧光显微镜的使用方法；3.掌握Image J软件进行图像融合的方法；4.理解荧光原位杂交技术的应用。

二、实验原理核酸杂交是以碱基互补为基础、以双链核酸分子在特定条件下的变性和复性为手段，对核酸分子进行定性和定量检测。

两条互补的核苷酸单链在特定条件下退火形成异质双链；应用荧光标记的探针与待检测材料中的单链核酸进行特异性结合，形成可悲检测的杂交双链核酸。

在显微镜下观察并记录结果。

本实验所用探针是位点特异性标记探针GSP myc，是由SpectrumOrange （552/576）直接标记的荧光DNA探针，长度为200bp，能识别8号染色体的着丝粒部位的α卫星序列。

三、实验器材和试剂防脱载玻片（premiere公司），医用砂轮，20×20mm盖玻片，橡皮胶，平板加热器，杂交盒，恒温水浴锅，玻璃染色缸，香柏油，荧光显微镜拍照系统，MYC基因扩增检测试剂盒。

四、实验步骤1.样品处理1）取细胞培养悬液5ml（107 cell）,2000rpm离心5min，去上清；2）加入10ml的0.075M KCl，吹打混匀，静置3min；3）37℃水浴箱低渗30min；4）加固定液2ml，吹打混匀，室温预固定10min；5）2000rpm离心5min，去上清；6）沉淀加固定液5~10ml，吹打混匀，-20℃冰箱静置30min；7）2000rpm离心5min，去上清。

2.制片1）取一张干净的载玻片，用砂轮在背面划“一”标记，尽量在中间或靠下端标记；2）加50ul固定液重悬细胞，取4ul悬液滴加到载玻片上的标记位置，室温晾干；3）平板加热器上烤片，60℃30min，显微镜下观察细胞密度；4）PBS洗涤3min；5）1%多聚甲醛室温固定10min；6）PBS洗涤3min；7）70%、90%、100%梯度乙醇脱水2min；8）取出玻片，室温晾干。

第1篇一、目的原位荧光杂交技术是一种在细胞或组织切片上进行DNA或RNA定位的方法，通过对特定序列的DNA或RNA进行标记，从而实现对特定基因或染色体的定位和定量分析。

本规程旨在规范原位荧光杂交操作，确保实验结果的准确性和可靠性。

二、适用范围本规程适用于所有原位荧光杂交实验，包括细胞原位杂交、组织切片原位杂交等。

三、材料与设备1. 材料：- 标本：细胞或组织切片- 探针：标记有荧光染料的DNA或RNA探针- 酶标抗体：针对探针标记的荧光染料- 洗涤液：如磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）- 抗荧光抗体：用于检测酶标抗体- 封片剂：如甘油封片剂2. 设备：- 荧光显微镜- 原位杂交仪- 热循环仪- 高速离心机- 显微镜载物台- 离心管- 移液器四、操作步骤1. 标本制备：- 将细胞或组织切片固定在载玻片上，进行脱水和透明处理。

- 将载玻片放入烘箱中，进行烘烤，使切片紧密贴合在载玻片上。

2. 探针制备：- 将探针进行变性，使其单链化。

- 将变性后的探针与标记有荧光染料的探针混合，进行杂交反应。

3. 杂交反应：- 将杂交混合物滴加在载玻片上的标本上，用封片剂封口。

- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行杂交反应。

4. 洗涤：- 将杂交后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。

- 洗涤过程中，注意轻柔操作，避免破坏杂交结构。

5. 酶标抗体反应：- 将酶标抗体滴加在载玻片上的杂交结构上，进行抗体结合反应。

- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行抗体结合反应。

6. 洗涤：- 将抗体结合后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。

7. 抗荧光抗体反应：- 将抗荧光抗体滴加在载玻片上的杂交结构上，进行荧光抗体结合反应。

- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行荧光抗体结合反应。

8. 洗涤：- 将荧光抗体结合后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。

9. 封片：- 将封片剂滴加在载玻片上的杂交结构上，进行封片。

10. 观察与分析：- 将载玻片放入荧光显微镜中，进行观察和分析。

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。

其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。

试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。

（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。

（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。

（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。

称量试剂勺也要干烤。

塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。

若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。

（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。

2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。

荧光原位杂交实验具体步骤及方法用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。

2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。

（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。

（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。

3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。

由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。

（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。

（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。

（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。

（5）取出玻片，自然干燥。

（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。