3．指出下面pH 条件下，各蛋白质在电场中向哪个方向移动，即正极，负极，还是保持原点？
（1）胃蛋白酶（pI 1.0），在pH 5.0；
（2）血清清蛋白（pI 4.9），在pH 6.0；
（3）α-脂蛋白（pI 5.8），在pH 5.0和pH 9.0；
解答：（1）胃蛋白酶pI 1.0＜环境pH 5.0，带负电荷，向正极移动；
（2）血清清蛋白pI 4.9＜环境pH 6.0，带负电荷，向正极移动；
（3）α-脂蛋白pI 5.8＞环境pH 5.0，带正电荷，向负极移动；
α-脂蛋白pI 5.8＜环境pH 9.0，带负电荷，向正极移动。
13．哪些因素影响Tm 值的大小？
解答：影响Tm 的因素主要有：① G -C 对含量。G -C 对含3个氢键，A -T 对含2个氢键，故G -C 对相对含量愈高，Tm 亦越高（图3-29）。在0.15mol/L NaCl,0.015mol/L 柠檬酸钠溶液(1×SSC)中，经验公式为：（G+C ）% =（Tm - 69.3）× 2.44。② 溶液的离子强度。离子强度较低的介质中，Tm 较低。在纯水中，DNA 在室温下即可变性。分子生物学研究工作中需核酸变性时，常采用离子强度较低的溶液。③ 溶液的pH 。高pH 下，碱基广泛去质子而丧失形成氢键的有力，pH 大于11.3时，DNA 完全变性。pH 低于5.0时，DNA 易脱嘌呤，对单链DNA 进行电泳时，常在凝胶中加入NaOH 以维持变性关态。④ 变性剂。甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱堆积，使Tm 下降。对单链DNA 进行电泳时，常使用上述变性剂。
16．概述核酸序列测定的方法和应用领域。
解答：DNA 的序列测定目前多采用Sanger 提出的链终止法，和Gilbert 提出的化学法。其中链终止法经不断改进，使用日益广泛。链终止法测序的技术基础主要有：① 用凝胶电泳分离DNA 单链片段时，小片段移动，大片段移动慢，用适当的方法可分离分子大小仅差一个核苷酸的DNA 片段。② 用合适的聚合酶可以在试管内合成单链DNA 模板的互补链。反应体系中除单链模板外，还应包括合适的引物，4种脱氧核苷三磷酸和若干种适量的无机离子。如果在4个试管中分别进行合成反应，每个试管的反应体系能在一种核苷酸处随机中断链的合成，就可以得到4套分子大小不等的片段，如新合成的片段序列为-CCATCGTTGA -，在A 处随机中断链的合成，可得到-CCA 和-CCATCGTA 两种片段，在G 处中断合成可得到-CCATCG 和-CCATCGTTG 两种片段。在C 和T 处中断又可以得到相应的2套片段。用同位素或荧光物质标记这4套新合成的链，在凝胶中置于4个泳道中电泳，检测这4套片段的位置，即可直接读出核苷酸的序列。 在特定碱基处中断新链合成最有效的办法，是在上述4个试管中按一定比例分别加入一种相应的2 ,3 -双脱氧核苷三磷酸（ddNTP ），由于ddNTP 的3 位无-OH ，不可能形成磷酸二酯键，故合成自然中断。如上述在A 处中断的试管内，既有dATP ，又有少量的ddATP ，新合成的-CCA 链中的A 如果是ddAMP,则链的合成中断，如果是dAMP ，则链仍可延伸。因此，链中有几个A ，就能得到几种大小不等的以A 为末端的片段。如果用放射性同位素标记新合成的链，则4个试管中新合成的链在凝胶的4个泳道电泳后，经放射自显影可检测带子的位置，由带子的位置可以直接读出核苷酸的序列。采用T7测序酶时，一次可读出400多个核苷酸的序列。近年采用4种射波长不同的荧光物质分别标记4种不同的双脱氧核苷酸，终止反应后4管反应物可在同一泳道电泳，用激光扫描收集电泳信号，经计算机处理 可将序列直接打印出来。采用毛细管电泳法测序时，这种技术一次可测定700个左右核苷酸的序列，一台仪器可以有几十根毛细管同时进行测序，且电泳时间大大缩短，自动测序技术的进步加快了核酸测序的步伐，现已完成了包括人类在内的几十个物种的基因组测序。
RNA 序列测定最早采用的是类似蛋白质序列测定的片段重叠法，Holley 用此法测定酵母丙氨酸tRNA 序列耗时达数年之久。随后发展了与DNA 测序类似的直读法，但仍不如DNA 测序容易，因此，常将RNA 反转录成互补DNA （cDNA ），测定cDNA 序列后推断RNA 的序列，目前16S rRNA 1 542 b 的全序列测定，23S rRNA 2 904 b 的全序列测定，噬菌体MS2 RNA 3 569 b 的全序列测定均已完成
※10．真核生物基因组和原核生物基因组各有哪些特点?
解答： 不同点: ① 真核生物DNA 含量高，碱基对总数可达10 11，且与组蛋白稳定结合形成染色体，具有多个复制起点。原核生物DNA 含量低，不含组蛋白，称为类核体，只有一个复制起点。 ② 真核生物有多个呈线形的染色体；原核生物只有一条环形染色体。③ 真核生物DNA 中含有大量重复序列，原核生物细胞中无重复序列。④ 真核生物中为蛋白质编码的大多数基因都含有内含子(有断裂基因)；原核生物中不含内含子。⑤ 真核生物的RNA 是细胞核内合成的，它必须运输穿过核膜到细胞质才能翻译，这样严格的空间间隔在原核生物内是不存在的。⑥ 原核生物功能上密切相关的基因相互靠近，形成一个转录单位，称操纵子，真核生物不存在操纵子。⑦ 病毒基因组中普遍存在重叠基因，但近年发现这种情况在真核生物也不少见。相同点:都是由相同种类的核苷酸构成的的双螺旋结构，均是遗传信息的载体，均含有多个基因。
8．简述酶促反应酸碱催化与共价催化的分子机理。
解答：在酶促反应酸碱催化中，酶活性部位的一些功能基团可以作为广义酸给出质子（例如谷氨酸残基不带电荷的侧链羧基、赖氨酸残基带正电荷的侧链氨基等），底物结合质子，形成特定的过渡态，由于形成该过渡态所需活化能相比于非酶促反应更低，因此反应速率加快；另外一些功能基团可以作为广义碱从底物接受质子（例如谷氨酸残基带负电荷的侧链羧基、赖氨酸残基不带电荷的侧链氨基等），底物失去质子后，形成过渡态所需的活化能比非酶促反应低，因此反应速率加快。
在酶促反应共价催化中，酶活性部位的一些功能基团作为亲核试剂作用于底物的缺电子中心，或者作为亲电试剂作用于底物的负电中心，导致酶―底物共价复合物的形成，该共价复合物随后被第二种底物（在水解反应中通常是水分子）攻击，形成产物与游离酶。由于该共价复合物形成与分解的反应所需活化能均比非酶促反应低，因此反应速率被加快。
3．试说明葡萄糖至丙酮酸的代谢途径,在有氧与无氧条件下有何主要区别?
解答：(1) 葡萄糖至丙酮酸阶段，只有甘油醛-3-磷酸脱氢产生NADH+H + 。 NADH+H +代谢去路不同, 在无氧条件下去还原丙酮酸; 在有氧条件下,进入呼吸链。
(2) 生成ATP 的数量不同,净生成2mol ATP; 有氧条件下净生成7mol ATP 。
葡萄糖至丙酮酸阶段，在无氧条件下，经底物磷酸化可生成4mol ATP （甘油酸-1,3-二磷酸生成甘油酸-3-磷酸，甘油酸-2-磷酸经烯醇丙酮酸磷酸生成丙酮酸），葡萄糖至葡糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸至果糖二磷酸分别消耗了1mol ATP, 在无
氧条件下净生成2mol ATP 。在有氧条件下，甘油醛-3-磷酸脱氢产生NADH+H +进入呼吸链将生成2×2.5mol ATP ，所以净生成
7mol ATP 。
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