慢病毒载体的miRNA载体构建实验服务

MiR-218慢病毒表达载体的构建及鉴定石晓磊;胡凤蓉;胡思隽;王为忠【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2011(011)013【摘要】To construct a lentiviral vector expressing Hsa-pre-mir-218-2 and make a foundation on studying of the functions and mechanisms of miR-218. partially complementary forward and reverse primers were designed based on the hsa-pre-mir-218-2 sequence. The primer dimers were generated by primer annealing method. These primer dimers were amplified by PCR and were inserted into enzyme-digested and linearized pGCSIL-GFP lentiviral vectors. The recombinant plasmid pGCSIL-GFP-mir-218-2 was identified by double enzyme digestion and then was packed with lentiviral packaging systems, and viral titer was determined. Human gastric cancer cells MKN-28 were infected with the constructed lentiviral vectors. The expression of miR-218 in MKN-28 cells was determined by qPCR. The double enzyme digestion and DNA sequencing analyses of the recombinant plasmid revealed that insertion element was correctly cloned into the vector. The qPCR demonstrated that the expression level of miR-218 in the lentivirus infected MKN-28 cells was increased significantly. It can effectively infect gastric cancer cells. The lentiviral vector with hsa-pre-mir-218-2 is constructed successfully and laid an experimental basis on the studies of the functions and mechanisms of miR-218.%构建人mir-218-2,pre-miRNA慢病毒表达载体,为研究miR-218在人体的功能及作用机制打下基础.以人hsa-mir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体.PCR扩增引物二聚体,酶切后插入到线性化pGCSIL-GFP慢病毒表达载体中,对重组质粒进行双酶切鉴定,并进行慢病毒的包装与滴度检测.用构建好的慢病毒表达载体感染人胃癌细胞MKN-28,qPCR检测细胞内miR-218表达.结果显示,重组质粒经双酶切分析及转化菌液测序,插入序列正确,慢病毒表达载体感染人胃癌细胞后qPCR检测显示能显著增高miR-218的表达.说明本实验成功构建了hsa-mir-218-2慢病毒表达载体,感染人胃癌细胞后能有效提高miR-218的表达.为进一步研究miR-218在人体的功能及作用机制建立了实验基础.【总页数】5页(P2888-2892)【作者】石晓磊;胡凤蓉;胡思隽;王为忠【作者单位】第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】R372【相关文献】1.Lv-shRNA-Hsa-microRNA-691慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 何燕浙;唐德军2.LOX-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 周蒨;吴慧恒;陈信良;董晓燕3.VASP基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 王静;魏蕾;邱堃4.长链非编码RNA BRE-AS1慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 周辉;余淦;徐华;叶章群5.长链非编码RNA-GAS5慢病毒表达载体构建及其转染效率鉴定 [J], 郑东颖;侯悦;李媛媛;杨云;乔宠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定叶礼红;舒晓春;邬伟民;鲁红云;孟晓军;孙辽【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2009(19)17【摘要】目的构建TIEG基因siRNA慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的TIEG 基因siRNA有效靶序列.合成靶序列的Oligo DNA退火形成双链DNA与经BamH Ⅰ和EcoRl酶切后的PshRNA-copGFP-lendvector慢病毒载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生psiRNA-TIEG慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆.测序鉴定,用psiRNA-TIEG和病毒包装系统共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;用包装病毒颗粒注射大鼠,通过RealTime-PCK检测大鼠肾组织TIEG mRNA的表达水平.结果 PCR和测序证实,成功构建TIEG siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×10<'5>ifu/μL;实验组大鼠TIEGmRNA的表达水平明显低于对照组(50.7%).结论成功构建大鼠TIEG基因siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG.【总页数】5页(P2568-2572)【作者】叶礼红;舒晓春;邬伟民;鲁红云;孟晓军;孙辽【作者单位】中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建 [J], 胡斌;杨燕;刘嘉;马智勇;黄红平;余源;刘慎沛;杨东亮2.C-erbB-2特异性siRNA逆转录病毒载体的构建与鉴定 [J], 陈敏;冯定庆;祝怀平;凌斌;周颖;朱园园;高婷;程志祥;沈国栋;赵卫东3.SMO特异性siRNA慢病毒载体的筛选构建 [J], 杨波;陈卫华;温机灵;华咏;王跃闽4.ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 任翼;刘永煜;郭微;田大力5.大鼠NgR特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 林如英;王玮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。

慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。

慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。

慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。

在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。

2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。

通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。

3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。

4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。

通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。

总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。

这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。

USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定目的构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。

方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。

寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。

连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。

构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA與包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。

通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。

结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。

与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。

结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。

标签：USP22；慢病毒载体；构建；鉴定肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，USP22泛素水解酶属去泛素化酶DUB基因家族成员，其普遍表达表明其功能的保守性，因此，USP22被归类为肿瘤干细胞的标记基因而引起高度关注[1]。

国内外学者研究发现，USP22基因过表达与结直肠癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等恶性肿瘤的浸润、转移和预后差高度相关。

沉默USP22基因表达，能显著抑制膀胱癌[7]、结直肠癌[8]细胞增殖，由此推测USP22基因可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。

本研究通过基因工程技术构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验基础。

1 材料与方法1.1 实验材料、试剂及仪器pLL3.7慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广州永诺生物科技有限公司。

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。

经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。

基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。

近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。

关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。

其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。

理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。

由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。

1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。

慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。

慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。

病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。

目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。

人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体构建及鉴定孙蓬明;毛晓丹;林芬;蔡良知;吴齐斌;宋一一【期刊名称】《福建医药杂志》【年(卷),期】2011(33)4【摘要】目的构建并鉴定靶向人ERRα基因的小分子干扰RNA的慢病毒载体.方法针对ERRα mRNA设计了4条siRNA,并构建pGCSIL-GFP-siERRα慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定.用pGCSIL-GFP-siERRα、pHelperl.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度.将慢病毒干扰RNA及含有ERRα过表达载体共转染293T细胞,Western-blot检测ERRα表达,观察蛋白表达抑制效果.结果 PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达2×109TU/ml.转染细胞中ERRα蛋白表达显著降低.结论成功构建高表达、高效率的人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体,为进一步研究ERRα在细胞核内转导中的作用机制和靶向ERRα治疗奠定基础.【总页数】4页(P1-4)【作者】孙蓬明;毛晓丹;林芬;蔡良知;吴齐斌;宋一一【作者单位】福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001;福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001;福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001;福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001;福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001;福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001【正文语种】中文【中图分类】R329.2+3;R737.3【相关文献】1.DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定 [J], 陈敏;项红兵;田玉科2.制备转基因模型小鼠的基础：人白细胞抗原A＊0206基因慢病毒载体构建及鉴定 [J], 张修彦;詹纯列;张晓玉;3.人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 许波群;李瑛;薛凯;李梅;马翔;刁飞扬;崔毓桂;刘嘉茵4.小鼠NR4A1基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 薛凯;李梅;刁飞扬;凌静;崔毓桂;刘嘉茵5.人ClC-2基因小分子干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定 [J], 杨翔云;张勇;赖小刚;裴建明;杨安钢;胡玉珍;周士胜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

hsa-miR-381过表达慢病毒载体的构建、转染和表达周苏娜;叶文广;崔耀友;梁军;张明鑫【摘要】Objective To construct hsa-miR-381-over-expressed lentivirus vector,and to investigate the regulation effect of miR-381 in esophageal squamous cell carcinoma TE10 cells after transfection.Methods The miR-381 sequence was obtained by PCR amplification,and then inserted into the lentiviral vector LV3 with Green&Puro.The miR-381 sequence was confirmed by double-enzyme cleavage and DNA sequencing and extracted.The recombinant lentivirus plasmid and packaging plasmid pGag/Pol,pRev,and pVSV-G were co-transfected into 293T cells by liposomes.The viral yielded by 293T cell was transfected into TE10 cells.The status of transfection was observed by fluorescence microscope,and the expression of miR-381 was detected by real-time quantitative PCR before and after transfection.Results Restriction enzyme digestion and sequencing results showed that recombinant plasmid was successfully constructed and packaged to lentivirus.The miR-381 sequence was confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing,and successfully inserted into the vector.The viral titer was 2 × 108 TU/ml.After transfection,the expression of miR-381 was significantly up-regulated in TE10 cells,and the expression abundance of hsa-miR-381 in TE10-381 increased by 456.05 times.Conclusion The LV3-has-miR-381 lentiviral vector is successfully constructed,and it could significantly increase the miR-381 expression in TE10 cell.%目的构建hsa-miR-381过表达慢病毒载体病毒载体,并对其在食管鳞癌TE10细胞中miR-381表达调节效果进行鉴定. 方法利用PCR法扩增miR-381基因序列,将目的基因miR-381克隆到携带Green&Puro的慢病毒载体LV3中,经双酶切及测序鉴定后大量抽提;利用脂质体将含目的基因的重组质粒和包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G共转染293T细胞;用得到的慢病毒转染TE10细胞,通过荧光显微镜观察转染状况,实时荧光定量PCR 分析转染前后miR-381的表达. 结果酶切与测序结果证明成功构建重组质粒,并成功包装成慢病毒,实验组病毒滴度为2×108 TU/ml,空白阴性对照组病毒滴度为2×108 TU/ml.TE10细胞转染过表达慢病毒后miR-381的表达升高,TE10-381组has-miR-381的表达丰度是TE10组的456.05倍. 结论 LV3-hsa-miR-381慢病毒载体构建成功,并能明显增加TE10细胞中miR-381的表达量.【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2017(048)003【总页数】5页(P241-245)【关键词】miR-381;慢病毒载体;食管鳞癌;基因转染【作者】周苏娜;叶文广;崔耀友;梁军;张明鑫【作者单位】第四军医大学唐都医院放疗科,西安710061;第四军医大学肿瘤研究所;第四军医大学肿瘤研究所;第四军医大学唐都医院放疗科,西安710061;第四军医大学唐都医院放疗科,西安710061;第四军医大学肿瘤研究所【正文语种】中文【中图分类】Q78食管癌的发病率和致死率在常见肿瘤中分别占第八和第六位，其中食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)在东亚地区占主要地位，约50%的ESCC病例发生在中国[1]。

慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够长期潜伏在宿主细胞内，并且在细胞分裂时能够传递给子细胞的病毒。

慢病毒的研究和应用在基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域具有重要意义。

慢病毒载体构建是慢病毒研究的关键环节，下面将介绍慢病毒载体构建的原理。

首先，慢病毒载体构建的关键是选择合适的病毒骨架。

常用的慢病毒载体包括HIV-1、HIV-2和SIV等。

这些病毒骨架具有较高的转导效率和稳定性，能够有效地将外源基因导入宿主细胞中。

在选择病毒骨架时，需要考虑到载体的稳定性、毒性和转导效率等因素，以确保慢病毒载体能够在宿主细胞中稳定表达外源基因。

其次，慢病毒载体构建需要将外源基因整合到病毒基因组中。

一般来说，外源基因会被整合到病毒的长末端重复序列（LTR）之间，这样可以确保外源基因能够稳定地表达。

在整合外源基因时，需要使用逆转录酶将外源基因的RNA转录成DNA，并将其整合到病毒基因组中。

整合外源基因的位置和数量会影响慢病毒载体的稳定性和表达水平，因此需要对整合位点和整合数量进行精确控制。

另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的包装限制。

在病毒的生命周期中，病毒颗粒的组装和包装需要依赖于病毒的包装信号。

因此，在构建慢病毒载体时，需要确保外源基因的整合不会影响到病毒的包装信号，否则会影响病毒的组装和包装，从而降低病毒的转导效率和稳定性。

最后，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。

在构建慢病毒载体时，需要对病毒的毒性进行改造，以降低其对宿主细胞的损害。

同时，还需要对病毒的复制和传播进行限制，以确保慢病毒载体在宿主细胞中稳定表达外源基因，同时不会对宿主细胞造成不良影响。

综上所述，慢病毒载体构建是慢病毒研究和应用的重要环节。

通过选择合适的病毒骨架、整合外源基因、考虑病毒的包装限制和确保病毒的安全性和稳定性，可以构建出稳定、高效的慢病毒载体，为基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域的研究和应用提供重要支持。

miR-940慢病毒表达载体的构建以及对鼻咽癌细胞的影响陈婧;孙奋勇;马纪【期刊名称】《同济大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(035)003【摘要】目的构建microRNA-940(miR-940)的慢病毒表达载体,制备重组慢病毒感染人鼻咽癌细胞5-8F,检测其对细胞迁移和增殖的影响.方法构建慢病毒载体,包装后感染人鼻咽癌细胞,通过加药筛选方法获得稳定过表达miR-940的人鼻咽癌细胞株5-8F/miR-940.实时定量PCR(RT-PCR)检测miR-940的表达量.MTT测定miR-940对5-8F体外增殖的影响.划痕试验检测miR-940对5-8F迁移的影响.结果构建稳定过表达miR-940的慢病毒表达载体.MTT证明miR-940可以抑制5-8F在体外的增殖.划痕试验说明miR-940可以抑制5-8F的迁移能力.结论 miR-940能够抑制5-8F在体外的增殖以及迁移能力.【总页数】5页(P1-4,9)【作者】陈婧;孙奋勇;马纪【作者单位】同济大学附属第十人民医院检验科,上海200072;同济大学附属第十人民医院检验科,上海200072;同济大学附属第十人民医院中心实验室,上海200072【正文语种】中文【中图分类】R739.63【相关文献】1.新藤黄酸诱导人鼻咽癌细胞CNE-1凋亡以及对p-p38和p-ERK1/2蛋白的影响[J], 晏烽根;李庆林2.脱氧核酶对端粒酶hTERT mRNA的切割以及对鼻咽癌细胞凋亡相关基因的影响[J], 赵家明;李明意;李震;杨展;张毅3.Slug慢病毒表达载体的构建及对ZR75-1细胞上皮间质转化的影响 [J], 李华月; 刘婕; 韩洋; 丁丽华; 叶棋浓4.CDCP1基因重组慢病毒表达载体的构建及其对宫颈癌细胞增殖与迁移的影响[J], 戚晓瑜;王青霞;李婉;卢春5.IL-35慢病毒表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达 [J], 冯涛;史浪涛;朱立;韩鹏;吴学举;赵娟;林雯昕;杨明义;李家勇;阮进松;张学刚;陈祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒慢病毒原理慢病毒(Lentivirus )是逆转录病毒的一种。

构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Len tivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

特点1)直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

2)3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4) 无需任何转染试剂，操作简便。

5) 可以根据客户需要制备多种标记。

慢病毒包装简要流程:1) 含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。

4) 病毒的纯化和浓缩。

5) 分装、-80 C保存。

6)滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

、腺病毒 原理腺病毒(Ade no virus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖 于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型2和5, 通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。

这些重组病毒仅在 高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

特点消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。

成都百美科生物QQ7742053病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。

构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4）无需任何转染试剂，操作简便。

5）可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。

4）病毒的纯化和浓缩。

5）分装、- 80 ℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

1.2、腺病毒成都百美科生物QQ77420531.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。

这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定目的构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。

方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。

寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。

连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。

构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA與包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。

通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。

结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。

与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。

结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。

标签：USP22；慢病毒载体；构建；鉴定肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，USP22泛素水解酶属去泛素化酶DUB基因家族成员，其普遍表达表明其功能的保守性，因此，USP22被归类为肿瘤干细胞的标记基因而引起高度关注[1]。

国内外学者研究发现，USP22基因过表达与结直肠癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等恶性肿瘤的浸润、转移和预后差高度相关。

沉默USP22基因表达，能显著抑制膀胱癌[7]、结直肠癌[8]细胞增殖，由此推测USP22基因可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。

本研究通过基因工程技术构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验基础。

1 材料与方法1.1 实验材料、试剂及仪器pLL3.7慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广州永诺生物科技有限公司。