2、引物长度一般在15-30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm 值5-10℃。
若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4、引物3'端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5、引物3'端不能选择A，最好选择T。
引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
6、碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与Cross dimer）的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal /mol）。
简并引物简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。
为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。
简并引物设计的方法简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。
主要用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方法。
简并引物设计的常见程序如下：1. 利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA 编码的氨基酸序列。
因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。
首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。
随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。
2. 对所找到的序列进行多序列比对。
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对程序如BLOCK，网址：http://bioinformatics.weizmann.a ...ww/make_blocks.html。
也可选工具有Clustal W。
3. 确定合适的保守区域。
设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～400个氨基酸为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有4个氨基酸。
若比对结果保守性不是很强很可能找不到4个氨基酸的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。
总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。
最终目的就是至少有两个4个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。
4. 利用软件设计引物。
当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用primer 5.0进行设计。
但最好使用专门的简并引物设计的方法如：CODEHOP（网址：http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html），GeneFisher2（网址：http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/）。
ncbi设计引物的方法步骤
设计引物的方法步骤可以参考以下步骤：
1. 确定目标序列：确定要设计引物的目标序列，例如基因、启动子或其他特定的DNA或RNA片段。
2. 取得目标序列：从NCBI等数据库或其他来源获取目标序列
的序列信息。
3. 序列分析：对目标序列进行生物信息学分析，包括序列比对、保守区域分析、开放阅读框分析等，以确定适合的引物区域。
4. 引物设计原则：根据引物设计的特定要求，确定引物设计的原则，如引物长度、GC含量、端序列等。
5. 引物设计工具：选择合适的引物设计工具，如Primer3、Primer-BLAST等，在线工具或软件可以帮助自动化设计引物。
6. 引物评估和校验：对设计出的引物进行评估和校验，包括引物间的相互比对、检查引物的互补性、检查引物的组合是否会产生二聚体等。
7. 合成和验证：将设计出的引物进行合成，并通过PCR实验
验证引物的特异性和效果。
上述步骤可以根据具体的需求和实验要求进行调整和修改，以获得最佳的引物设计结果。
NCBI使⽤教程--qPCR引物设计NCBI设计qPCR引物主要⽤到Primer designing tool⼀/打开基因序列页⾯⼆/点击Pick Primers，跳转到到Primer designing tool的页⾯到Primer designing tool的页⾯。
*如果已经有了基因的序列，可以不通过基因查找页⾯，直接进⼊Primer designing tool。
具体的⼊⼝是NCBI——BLAST——Primer-Blast。
三/根据公式对将设计出的引物进⾏参数设计① PCR Template通过查找序列转到Primer designing tool的，那么在PCR Template栏中则会⾃动出现您的基因的编号，⽐如对于human β-actin来讲，其mRNA的页⾯点击Pick Primer之后，PCR Template 栏中会出现其对应编号：NM_001101.3。
如果是直接进⼊Primer designing tool界⾯，则需要将⽬的基因的编号或者序列粘贴进该框中。
在右侧的Range栏中，可以设定正反向引物的结合范围。
② Primer Parameters引物参数栏中，前两⾏是引物的序列栏，⽤于对已有的引物进⾏特异性分析，在设计引物的过程中并不会⽤到，因此留空即可。
在PCR product size⼀⾏中，可以设定PCR引物的扩增产物长度范围，对于qPCR来讲，范围设为50~250时结果⽐较精确，可以先设定⼀个较⼩的范围，如80~150，如果该范围内没有设计出⽐较好的引物，则可以返回扩⼤产物⼤⼩范围。
# of primers to return是指软件设计引物的数量(如果有的话)，默认为10对。
引物的Tm值⼀⾏中，可以设定引物的最⼤、最⼩和最佳Tm值，以及正反向引物Tm的最⼤差值。
对于qPCR来讲，默认的即为最佳Tm值60°C，不需做任何修改。
③ Exon/intron selection在抽提RNA的过程中，样本中的基因组DNA污染会显著影响最终的结果，虽然可以使⽤DNase I进⾏处理将RNA样本中的中DNA降解掉，但是很难保证DNA降解完全。
