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鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白研究进展

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鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中的分泌表达及免疫原性分析

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中的分泌表达及免疫原性分析

14中国兽医杂志2020年(第56卷)第12期Chinese Journal of V eterinary Medicine鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白在昆虫细胞•杆状病毒表达系统中的分泌表达及免疫原性分析洪家兵1!2,王萍1,王晓m3,于非可3,刘文晓2,李永清2[1.江西农业大学动物科学技术学院，江南昌330045； 2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室，北京海淀100097； 3.北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京102206]摘要:根据杆状病毒表达系统的密码子偏好性,对鸡传染性法氏囊病毒(IEDV)基因序列进行密码子优化,然后合成序列。

优化后的序列被定向克隆至转移载体pFast Bac™1，转化DH10Bac™感受取重组杆状病毒穿梭质粒，转染昆虫细胞SF9,获得P0代重组杆状病毒。

间接免疫荧光鉴定和Western blot分析结果显示，病毒reBac-VP感染昆虫细胞后,能够在的上清中稳VP2，而能够与IBDV的抗体发生特异性结合，的免疫原性。

本试验成功构建了能够分泌表达VP2蛋白的重组杆状病毒，为IBDV诊断试剂及亚单位疫苗研发提供了工具。

关键词:鸡传染性法氏囊病病毒；杆状病毒；蜂毒肽；VP2蛋白中图分类号：R511 文献标志码:A文章编号：0529—6005(2020)12—0014—04Secreted Expression and Immunogenicity Analysis of VP2Protein ofInfectious Bursal Disease Virus in Baculovirus Expression SystemHONG Jia-biny1，2，WANG Piny1，WANG Xiav-yua3，YU Fei-ka3，LIU Wen-xiav2，LI Yony-qiny2(1.Colleae of Anniial Scienco and Technology，Jiangii Agricultural University，Nanchang330045，China；2.Beijing Key Laboratory for Prevention and Control of Infections Disease in Livestock and Poultry，Institute of AnniialHusbandry and Veterinary Medicine，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing100097，China； 3.Bei iing Key Labo ea eo ey of T eadi eiona eChinese Ve ee eina ey Medicine，BeiiingUnieeesieyofAgeicueeueae，Bei iing102206，China)Abstract；The V2nucleotide sequencc o C Infectious bursal disease virus(IBDV)was downloaded from NCBI GenBank data-base.Thecodon sequencewasopeimieed based on eheamino-acid composieion biasofbacueoeieus-insecece e syseem.Theopeimieed gene sequencc was synthesized and cloned into pFast Bac TM1，then transformed into DH10Bac TM—coli to obtain the baculovirus shuttle vectors.The recombinant bacmid DNA was extracted and transfected into insect cell SF9according to the manual.Indirect immunofeuoeescenceideneificaeion and Weseeen beoeanaeysisshowed ehaeafeeeeheeieuseeBac-VP2infecesinsecece s，iecan seabey eipee s VP2peoeein in ehesupeenaeaneofinsecece s，and iecan specifica e y bind eoeheaneibodyofchicken IBDV.Thisshowed ehae eheVP2peoeein eipee s ed in ehisseudyhasgood immunogeniciey.Iecoued beappeied foefueeheedeeeeopmeneofspecificdiagnoseic meehod oeineeseigaeion ofIBDVpaehogenesis.Key words:Infectious bursal disease virus；baculovirus；honeybee melittin signal peptide；VP2proteinCorressonding authors：LIU Wen-xiao，E-matl:********************；LI Yong-qing，E-mail:*******************收稿日期：2019—12—31基金项目：国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目(31761133003)；北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX201914)；北京市农林科学院畜牧兽医研究所事业基金项目(XMSSY J202006)作者简介:洪家兵(1995-)，男，硕士生,研究方向为动物免疫学基础理论与应用，E-mail:1551263132@通讯作者:刘文晓,E-mail:1ux232210809@163-com；李永清,E-mail:chunyudady@鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，ID)是由鸡传染性法病病毒(Infectious bursal disease virus，HDV)的一性、髙度性的疫抑制性疾病[1-]%IBDV主要感染3的鸡，病鸡精神沉郁、、共症状⑶％自1962年国首次报道该病以来，IBD不断在，给我国全的养禽业带来了巨大的经⑷％IBDV对毒剂强的抵抗力，很难从受污染的家禽场所中清除，疫防治Chinese Journal of Veterinary Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第12期15IBD的唯一可行选择。

传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫功能分析的开题报告

传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫功能分析的开题报告

传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫功能分析的开题报告一、选题背景法氏囊病（IBD）为鸡只常见疾病之一，病原体是传染性法氏囊病病毒（IBDV）。

病毒主要通过消化道引入体内，导致消化道黏膜炎症和免疫功能降低。

传统的预防措施包括疫苗接种和消毒等方法，但疫苗接种效果不稳定且易产生病毒突变。

因此，开发新型疫苗成为预防IBD的关键策略之一。

IBDV的VP2蛋白是病毒进入细胞的关键结构蛋白，在诱导机体产生免疫应答方面具有重要作用。

C3d是一种共价结合在蛋白表面的小分子，在促进抗原呈递和免疫识别方面也具有重要作用。

因此，将VP2与C3d 结合，构建VP2-C3d融合蛋白，并注射到动物体内，可能会加强疫苗的免疫效果。

二、研究目的本研究旨在构建VP2与C3d串联基因重组表达质粒，并表达融合蛋白，进一步探讨其在提高抗IBDV免疫效果方面的潜力。

三、研究方法1. 提取IBDV的VP2基因和C3d基因，并将其通过PCR方法得到相应的DNA片段。

2. 设计引物，将VP2基因和C3d基因的DNA片段进行连接，形成VP2-C3d融合基因。

3. 将VP2-C3d融合基因插入表达质粒pET-28a，构建重组表达质粒pET-28a-VP2-C3d。

4. 将构建好的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，通过IPTG诱导表达VP2-C3d融合蛋白。

5. 分离纯化VP2-C3d融合蛋白，并通过Western blot检测其表达情况。

6. 制备活性疫苗，将VP2-C3d融合蛋白注射到鸡体内，观察其免疫效果。

四、研究意义本研究以VP2-C3d融合蛋白为疫苗，针对传染性法氏囊病进行免疫预防，具有重要的理论和实践意义。

通过构建和表达VP2-C3d融合蛋白，可以进一步探究其在提高免疫效果方面的潜力，并为开发全新的IBD疫苗奠定了基础。

鸡传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白的克隆与表达的开题报告

鸡传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白的克隆与表达的开题报告

鸡传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白的克隆与表达
的开题报告
题目：鸡传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白的克隆与表达
背景：
鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD）是一种由法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的急性传染病，主要影响幼鸡的法氏囊。

该病毒主要通过感染母鸡传染给下一代幼鸡，也可通过间接途径传播。

IBDV是一种双链RNA病毒，属于Birnaviridae 科，主要由VP2、VP3、VP4等结构蛋白组成。

目的：
本论文旨在克隆并表达IBDV主要结构蛋白，为进一步研究IBDV病毒结构和生理作用提供基础。

方法：
1. 根据IBDV VP2、VP3、VP4基因序列设计引物，对IBDV基因组进行PCR扩增；
2. 克隆IBDV VP2、VP3、VP4基因到表达载体pET28a+中；
3. 转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达；
4. 纯化表达的蛋白，并进行鉴定。

预期结果：
成功克隆IBDV VP2、VP3、VP4基因到表达载体中，并在大肠杆菌中表达出目标蛋白。

通过蛋白纯化和Western blot等技术鉴定，获得纯化的IBDV VP2、VP3、VP4蛋白。

意义：
本论文研究IBDV主要结构蛋白的克隆与表达，为进一步研究该病毒的感染机制、免疫学和疫苗研究等提供基础。

同时，对于研究其他双链RNA病毒的结构和功能也有借鉴意义。

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

１ １ １ 病料 ．．
辽宁省 大连市发 病鸡场 ） 置 一７ ￣ 冻保存 ；Ｐ ， ０ Ｃ冷 Ｓ Ｆ鸡
胚 和 Ｓ Ｆ鸡购 自济南吴泰实验 动物繁育有 限公 司 。 Ｐ
１ １ ２ 主 要 试 剂 Ｅ． ２ ． ｏｉ Ｌ １
５的 比例 （ 质量 比） 加无 菌 Ｐ Ｓ匀 浆 ， Ｂ 反复 冻 融 ３次 ，
１ ２ ２ 动 物 回归试 验 ． ． 将 １ ５羽 同一 批 次 的 ４周 龄
１ Ｏ羽每 只鸡 注射油 乳剂 疫苗 ０ ３ｍＬ， ． 第二 组 ５羽 每 只鸡 注 射 ０ ２ｍＬ 白油 佐 剂 作 为 对 照 组 ， 疫 注 射 ． 免
后 ３周 翅下 采血 ， 分离 血 清 ， 进行 琼脂 扩散 试验 。
层 呈现 黄色 胶 冻样 。琼 脂 免 疫 扩 散试 验 结 果 表 明 ， Ｉ ＤＶ 阳性血 清 与 Ｉ ＤＶ 标 准抗 原 和 回归试 验鸡 的 Ｂ Ｂ 法 氏囊 组织 匀浆 之 间均 出 现 沉 淀线 ， 与 阴性 对 照 而
之 间无 沉淀 线 出现 （ １ 。 图 ）
质 粒的构 建
动 物 医 学 进 展 。０ ２ ３ （ ） １— １ ２ １ ，３ ５ ：８２
Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ ｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｖ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
传 染性 法 氏囊病 病 毒 ＶＰ ２基 因原 核 表 达 及 抗 原 性 分 析
单 学强 ， 明 义弘 ， 李 高 轩
模板 ， 构建 重组 表 达质 粒 ｐ Ｔ ８— ２ 使 用 大 肠 埃 Ｅ ２ ａＶＰ ； 希菌 进行 原 核 表 达 ， 备 ＶＰ 制 ２蛋 白并 分 析 Ｖ ２蛋 Ｐ 白的生物 学活 性 ， 鸡 传 染性 法 氏囊 病 基 因工 程 亚 为 单位 疫苗 的研 制奠 定基础 。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白配体结合表位的鉴定的开题报告

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白配体结合表位的鉴定的开题报告

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白配体结合表位的鉴定的开题报告一、研究背景鸡传染性法氏囊病(CDV)是由法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种常见的急性传染病，多发生于3-6周龄的肉鸡和蛋鸡。

IBDV属于Birnaviridae 家族，病毒颗粒包含两个单链RNA、VP1和VP2两个壳蛋白。

VP2是病毒唯一的表位性蛋白，与宿主细胞进行结合，进而引起感染。

因此，研究VP2蛋白的配体结合表位对于研究IBDV的感染机制具有重要意义。

二、研究目的本研究旨在通过生物信息学方法预测CDV VP2蛋白结构及其表位，并构建VP2蛋白与其配体结合的三维模型，进一步探究CDV感染的分子机制，为防治CDV提供新思路。

三、研究内容及方案1.预测CDV VP2蛋白的结构和表位：利用基于序列的方法和结构预测软件对CDV VP2蛋白的二级结构、三级结构和表位进行预测，并通过功能域分析和进化保守性评估，筛选出重要的结构域和表位。

2.构建CDV VP2蛋白与其配体的三维模型：根据预测的结构和表位，利用蛋白质分子对接软件构建CDV VP2蛋白与其配体的三维模型，并进行能量最小化优化。

3.验证CDV VP2蛋白的配体结合表位：利用同步辐射小角散射(SAXS)技术进行CDV VP2蛋白与其配体的结合情况检测。

同时，通过基于动力学模拟的微细分子模拟技术进行验证和优化，得到最终可靠的CDV VP2蛋白与其配体的结合模型。

四、预期成果1.预测和解析CDV VP2蛋白的结构和表位，明确其与配体结合的分子机制。

2.构建CDV VP2蛋白与其配体的三维模型，揭示其结构与功能的关系。

3.验证CPV VP2蛋白的配体结合表位，为进一步研究CDV感染机制提供可靠的理论依据。

传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定

传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定
７ ９ — ８ ６ ．
［ ４ ３ Ｅ ｓ ］
Ｔａ ｔ Ｓ Ｕ Ｏ Ｈ， Ｏｎ ｏ Ｎ， Ｔ ａ ｎ ｋ ａ Ｋ ，ｅ ｔ ａ １ ． Ｓ ＬＡＭ （ ＣＤｗｌ ５ ０）ｉ ｓ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ａ ｒ
ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍｅ ａ ｓ ｌ ｅ ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ［ Ｊ ］ ． Ｎａ ｔ ｕ ｒ ｅ ， ２ ０ ０ ０ ， ４ ０ ６ ： ８ ９ ３ — ８ ９ ７ ．
Ｔ ａ ｔ ｓ ｕ ｏ Ｈ。 （ ） ｎ ｏ Ｎ 。Ｙａ ｎ ａ ｇ ｉ Ｙ． Ｍｏ ｒ ｂ ｉ ｌ ｌ ｉ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｅ ｓ ｕ ｓ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｌ ｉ ｎ ｇ ｌ ｙ ｍ—
及免疫 原性测 定。将传 染性 法 氏囊病 病毒 ＨＢ株 Ｖ Ｐ ２基 因亚克隆到 原核表 达 载体 ｐ Ｅ Ｔ － ３ ２ ａ － ｃ （ ＋） 中并对 其进 行 了诱 导表 达 。Ｓ Ｄ Ｓ － Ｐ ＡＧ Ｅ电泳和 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 分析表 明 ， 表 达的 重组蛋 白约 ５ ５ ｋ ｕ ， 以包涵体形式存在 。重组
动物 医 学进展 。 ２ ０ １ ３ ， ３ ４ （ ２ ） ： ７ １ — ７ ４
Ｐｒ ｏ ｇｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎｅ
传 染 性 法 氏 囊病 病 毒 ＨＢ株 ＶＰ ２蛋 白的表 达及 免 疫 原 性 测 定
杜 冬 华 ， 周 静 ， 王 爱 华 ， 王 磊 ， 孙 继 国。
基 因组共编码 ＶＰ １ 、 Ｖ Ｐ ２ 、 Ｖ Ｐ ３ 、 Ｖ Ｐ ４和 ＶＰ ５ ５ 种 蛋 白，
至今 ， 新 的变异 株 及 超强 毒 株 不 断 出现 ， 使 得 传 统 活 其 中 ＶＰ ２蛋 白是 宿主保护性免疫 原 ， 可诱导产生 中和

p62介导传染性法氏囊病病毒VP2蛋白自噬降解以抑制病毒复制的机制研究

p62介导传染性法氏囊病病毒VP2蛋白自噬降解以抑制病毒复制的机制研究传染性法氏囊病病毒（IBDV ）是一种禽双链RNA 病毒，能够引起鸡的急性高度接触性传染病-传染性法氏囊病（IBD ）。

该病引起鸡群严重的免疫抑制，导致免疫失败和其他病原体的感染。

目前，IBDV 感染过程的免疫机制还不清楚。

IBDV 感染细胞后，细胞的免疫系统被激活，包括细胞的自噬降解。

选择性自噬是真核生物细胞内高度保守的自我降解的生物学过程，可以降解细胞内多余或异常蛋白质及细胞器，不仅是细胞抵抗内外应激的重要机制，而且是机体一种重要的免疫机制。

选择性自噬可以通过降解某些病毒的不同成分而抑制病毒的复制。

其中，p62是选择性自噬重要的受体蛋白，参与细胞的多种选择性自噬过程，可以单独或协同其他自噬受体完成自噬的降解过程。

近期，《Journal of Virology 》发表了“Cytoplasmic cargo receptor p62inhibits avibirnavirus replication by mediating autophagic degradation of viral protein VP2”的论文研究。

该研究结果显示，自噬激活剂可以下调IBDV VP2蛋白的表达水平；自噬抑制剂可以上调VP2蛋白的表达水平；而且敲低自噬蛋白ATG5，可以上调VP2蛋白的表达水平。

这些结果表明VP2可以通过自噬途径降解。

为了探究自噬降解VP2的分子机制，该研究利用免疫共沉淀和间接免疫荧光试验（IFA ）发现，在分别过表达VP2蛋白和感染IBDV 后，VP2均可以和自噬受体p62相互作用。

而且，激活或促进细胞的自噬均可以增强VP2与p62的相互作用。

IFA 结果显示，p62可以介导VP2与自噬标志蛋白LC3的共定位。

从这些结果推测p62可能介导VP2的自噬降解过程。

为了证实这一推测，该研究通过构建p62敲除的细胞系检测VP2蛋白的表达水平。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株VP2基因突变对细胞嗜性改变的研究


ｄ ｉ １ ．９ ９ ． ｓ ．０ ８０ ８ ．０ ０１ ． ｏ： ０３ ６ ￣ ｉ ｎ １０ —５ ９２ １ ．００ ｓ ２
鸡传 染性 法 氏囊病病 毒超 强毒 株 Ｖ ２基 因突变 Ｐ 对 细 胞 嗜 性 改 变 的研 究
高 立 ，祁 小 乐 ，高 玉龙 ， 高宏 雷 ，秦 立 廷 ，邓 小 芸 ，李 凯 ，王 笑梅
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Ｇ ｉＱＩ ａ — ， ＡＯ ｕｌ ｇ ＧＡ ｎ 一 ｉ Ｑ Ｎ ｉｉｇ Ｄ ＮＧ Ｘｉ －ｕ ， ＡＯ Ｌ ， ｏｌ Ｇ — ｎ ， Ｏ Ｈｏ ｇ１ ， Ｉ Ｌ —ｎ ， Ｅ ａ ｙ ｎ Ｘｉ ｅ ｏ ｅ ｔ ｏ
第 ３卷 第 １ ２ ０期
２１ 年 ００ １ 月 ０
中 国 预
防 兽
医 学 报
Ｖｏ１３２． Ｏ．０ ． Ｎ １ Ｏｃ． ２ ０ ｔ Ｏ１
Ｃｈ ｎ ｓ ｏｕ ａ ｒ ｖｅ ｉｅ Ｖｅｅ ｉ ａｙ ｅ ｃｎｅ ｉ ｅ ｅＪ ｒ ｌｏｆＰ ｅ ｎｔｖ ｔｒｎ ｒ Ｍ ｄｉｉ ｎ
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鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株VP2基因突变对细胞嗜性改变的研究

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株VP2基因突变对细胞嗜性改变的研究高立;祁小乐;高玉龙;高宏雷;秦立廷;邓小芸;李凯;王笑梅【摘要】为研究鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株(vvIBDV)细胞嗜性改变的分子基础,本研究通过定点突变、重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术,以vvIBDV HLJ-0504株为骨架构建了两组感染性克隆,并借助已建立的反向遗传操作技术进行病毒拯救.IFA检测、电镜观察及RT-PCR鉴定均显示:O253H/A284T双点突变的pCAGGHLJ0504A889/980HRT和pCAGGHLJ0504BHRT共转染DF1细胞成功拯救出重组病毒(rHLJ0504HT),而未进行双点突变的pCAGGHLJ0504AHRT和pCAGGHU0504BHRT共转染组未获得重组病毒.上述结果表明,双点突变Q253H/A284T能使vvIBDV HLJ-0504适应非允许细胞CEF,但未进行Q253H/A284T双点突变的vvIBDV HLJ-0504不能感染非允许细胞CEF,因此,该研究表明VP2的Q253H/A284T两个氨基酸突变是、vvIBDV细胞嗜性改变的分子基础.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2010(032)010【总页数】5页(P747-751)【关键词】传染性法氏囊病超强病毒株;病毒拯救;细胞嗜性【作者】高立;祁小乐;高玉龙;高宏雷;秦立廷;邓小芸;李凯;王笑梅【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室,黑龙江,哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室,黑龙江,哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室,黑龙江,哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室,黑龙江,哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室,黑龙江,哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室,黑龙江,哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室,黑龙江,哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室,黑龙江,哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD病毒(IBDV)引起的一种危害鸡的急性、高度接触性传染病[1]。

表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其表达的优化

表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其表达的优化张旺;刘琳琳;祁小乐;高玉龙;王永强;高宏雷;李凯;高立;刘长军【摘要】鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2蛋白是该病毒的主要抗原蛋白,为制备乳酸菌黏膜免疫口服疫苗,本研究采用乳酸乳球菌(ctis)及其Nisin诱导的表达系统,对VP2基因进行密码子优化,构建了表达IBDV-VP2蛋白的重组乳酸乳球菌ctis/pNZ-VP2.经正交试验对诱导条件进行优化,重组VP2蛋白(rVP2)表达量比优化前明显提高,最终得到最佳诱导条件为:OD600nm=0.5开始诱导,Nisin终浓度为2 ng/mL,诱导时间为5h,rVP2表达量达到最大值38 μg/mL.经western blot 检测,rVP2能够持续性表达并具有良好的抗原性.该重组乳酸菌的构建为进一步体内免疫实验奠定了基础.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2015(037)011【总页数】4页(P825-828)【关键词】鸡传染性法氏囊病毒;重组乳酸菌;VP2蛋白【作者】张旺;刘琳琳;祁小乐;高玉龙;王永强;高宏雷;李凯;高立;刘长军【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队,黑龙江哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD 病毒(IBDV)引起的一种高接触性和高致死性传染病[1]。

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Ｍｕｎｄｔ 对 细 胞 嗜 性 的 研 究 进 一 步 集 中 在 ＶＰ２ 的 ２５３、
收 稿 日 期 ： ２００７－１０－１５ 基 金 项 目 ： 国 家 ９７３ 项 目 （２００５ＣＢ５２３２０２） 作 者 简 介 ： 祁 小 乐 （１９８０～）， 男 ， 河 南 宜 阳 人 ， ＊ 通 讯 作 者 ： Ｅ－ｍａｉｌ： ｘｍｗ＠ｈｖｒｉ．ａｃ．ｃｎ
最 近 ， ｖａｎ Ｌｏｏｎ 在 研 究 ２７９ 位 氨 基 酸 与 ＩＢＤＶ 细 胞 嗜 性 的 关 系 时 发 现 ， 单 位 点 突 变 Ｄ２７９Ｎ 不 能 使 ｖｖＩＢＤＶ ＵＫ６６１ 株 适 应 ＣＥＦ 细 胞 ， 但 它 与 Ａ２８４Ｔ 协 同 可 以 在 ＣＥＦ 细 胞 上 拯 救 出 ＵＫ６６１ 株 病 毒 ， 但 滴 度 并 不 比 单 独 突 变 Ａ２８４Ｔ 所 拯 救 出 的 病 毒 高 ［６］。 这 与 Ｌｉｍ 的 报 道 不 一 致 ， 将 ｖｖＩＢＤＶ ＨＫ４６ 株 病 毒 做 双 位 点 突 变 Ｄ２７９Ｎ／Ａ２８４Ｔ 后 拯 救 出 来 的 病 毒 比 Ｄ７８ 株 复 制 的 更 快 ， 最 终 滴 度 也 更 高 ［７］。 Ｂｒａｎｄｔ 的 研 究 结 果 与 上 述 研 究 不 同 ， 将 不 适 应 ＣＥＦ 的 拯 救 病 毒 ｒＩＭＶＰ２ 的 ＶＰ２ 部 分 片 断 （ 包 含 ２７９、 ２８４、 ３３０ 位 氨 基 酸 ）用 Ｄ７８ 的 相 应 片 段 进 行 回 复 替 换 ， 在 ＣＥＦ 上 拯 救 不 出 病 毒 ， 说 明 这 ３ 个 氨 基 酸 的 改 变 不 足 以 使 ＩＢＤＶ 适 应 ＣＥＦ ［８］。 综 上 所 述 ， ＶＰ２ ２７９ 位 氨 基 酸 并 不 能 单 独 决 定 ＩＢＤＶ 的 细 胞 嗜 性 ， 至 于 它 能 否 协 同 其 他 氨 基 酸 而 共 同 影 响 ＩＢＤＶ 的 细 胞 嗜 性 还 有 待 研 究 。
助理研究员，
主要从事动物病毒学研究．
第８期
祁 小 乐 ， 等 ． 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒 ＶＰ２ 蛋 白 研 究 进 展
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２８４ 和 ３３０ 位 氨 基 酸 上 ［５］ ： 将 变 异 株 Ｅ／Ｄｅｌ Ａ 节 段 的 ６４７ ｂｐ ～１ ７２５ ｂｐ 的 片 段 替 换 减 毒 株 Ｄ７８ 的 部 分 区 域 （ 包 括 ２５３、２８４、３３０ 三处氨基酸突变）， 然后分 别 突 变 Ｑ２５３Ｈ、 Ａ２８４Ｔ， 均 不 能 在 ＣＥＦ 或 ＱＭ－７ 细 胞 中 拯 救 出 病 毒 ； 另 外 ， 单 位 点 回 复 突 变 Ｈ２５３Ｑ、 Ｔ２８４Ａ 使 得 减 毒 株 Ｄ７８ 不 适 应 细 胞 培 养 ， 这 证 明 单 位 点 突 变 Ｑ２５３Ｈ 或 Ａ２８４Ｔ 不 足 以 影 响 ＩＢＤＶ 的 细 胞 嗜 性 。 但 Ｍｕｎｄｔ 发 现 野 生 强 毒 株 ＧＬＳ－ＢＵ 和 细 胞 适 应 毒 株 ＧＬＳ－ＴＣ 在 ＶＰ２ 可 变 区 只 有 １ 个 氨 基 酸 的 差 异 （Ａ２８４Ｔ）， 运 用 反 向 遗 传 操 作 技 术 ， 也 证 明 了 单 位 点 突 变 Ａ２８４Ｔ 足 以 使 野 生 强 毒 株 ＧＬＳ－ＢＵ 适 应 ＣＥＦ 或 ＱＭ－７ 细 胞 ［５］。 Ｍｕｎｄｔ 对 此 作 出 了 这 样 的 解 释 ： Ａ２８４Ｔ 使 野 生 强 毒 株 适 应 细 胞 培 养 的 作 用 具 有 毒 株 特 异 性 ［５］。 ｖａｎ Ｌｏｏｎ 等 研 究 发 现 ， 单 位 点 突 变 Ａ２８４Ｔ 能 使 ｖｖＩＢＤＶ ＵＫ６６１ 株 适 应 ＣＥＦ 细 胞 ， 而 单 位 点 突 变 Ｑ２５３Ｈ 却 不 能 改 变 ｖｖＩＢＤＶ 的 细 胞 嗜 性 ， 但 它 能 协 同 Ａ２８４Ｔ 使 ＵＫ６６１ 株 在 ＣＥＦ 细 胞 上 产 生 更 高 的 滴 度 ［６］。 显 然 ， ＶＰ２ 的 ２５３、 ２８４ 位 氨 基 酸 影 响 ＩＢＤＶ 细 胞 嗜 性 ， 但 作 用 方 式 和 机 制 尚 无 定 论 。
３ ＶＰ ２ 是 ＩＢＤＶ 重 要 的 毒 力 蛋 白
一 般 认 为 ， ＶＰ２ 是 ＩＢＤＶ 最 重 要 的 毒 力 蛋 白 。 其 毒 力 的 分 子 基 础 研 究 集 中 在 ２５３、 ２７９ 和 ２８４ 三 个 氨 基 酸 位 点 上， 但还没有更深入的研究进展。
中 图 分 类 号 ： Ｓ８５２．６５９．４
文献标识码： Ｂ
文 章 编 号 ： １００８－０５８９（２００８）０７－０６５６－０５
鸡传染性法氏囊病（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ， ＩＢＤ）是由鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒 （Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ， ＩＢＤＶ） 引起 的 一 种 急 性 、 高 度 接 触 性 传 染 病 ， 主 要 危 害 ３～６ 周 龄 的 雏 鸡 。 该 病 于 １９５７ 年 首 次 发 现 于 美 国 Ｇｕｍｂｏｒｏ 地 区 。 ５０ 年 来 ， ＩＢＤ 一 直 威 胁 着 养 禽 业 的 发 展 。 免 疫 抑 制 、 抗 原 变 异 ， 特 别 是 超 强 毒 株 （ｖｖＩＢＤＶ）的 出 现 ， 使 得 该 病 的 防 控 形 势 更 加 严 峻 ［１］。 国 际 兽 疫 局 （ＯＩＥ） 已 将 ＩＢＤ 列 为 “ 影 响 社 会 经 济 的 重 要 疾 病 ”。
数 的 ３８．７ ％ （１２／３１）， 其 中 有 ９１ ％ 的 突 变 （１１／１２） 集 中 在 高 变 区 ［２］。 ＩＢＤＶ 高 变 区 有 两 个 明 显 的 亲 水 区 ， 即 亲 水 区 Ｉ （２１２ ａａ ～２２４ ａａ） 和 亲 水 区 Ⅱ （３１４ ａａ ～３２４ ａａ）。 第 二 个 亲 水 区 后 有 一 个 富 含 丝 氨 酸 的 七 肽 区 （３２６ ａａ ～３３２ ａａ）， 两 个 亲 水 区 之 间 存 在 两 个 小 亲 水 区 ， 即 ２４８ ａａ ～２５２ ａａ 和 ２７９ ａａ～２９０ ａａ。 迄 今 ， ＩＢＤＶ 毒 株 的 分 类 、 系 统 进 化 树 的 绘 制 等 绝 大 多 数 是 以 ＶＰ２ 的 序 列 特 征 为 依 据 的 ， 所 以 深 入 研 究 ＶＰ２ 的 结 构 与 功 能 对 研 究 ＩＢＤＶ 的 遗 传 变 异 规 律 十 分重要。
Ｂｒａｎｄｔ 等 报 道 ， 将 经 典 毒 株 ＩＭ 的 ＶＰ２ 替 换 Ｄ７８ 的 相 应基因后， 通过转染细胞后再在鸡胚上传代而获得的拯救 病 毒 ｒＩＭＶＰ２ 不 能 适 应 Ｖｅｒｏ 细 胞 和 ＣＥＦ［３］。 Ｂｏｏｔ 等 也 有 类 似 的 研 究 结 果 ， 所 拯 救 的 ｓｒＩＢＤＶ－ＤＡＣＢ （Ｄ６９４８ 株 的 Ａ 节 段 和 ＣＥＦ９４ 株 的 Ｂ 节 段 ）不 能 适 应 ＱＭ５ 细 胞 ， 而 ｓｒＩＢＤＶ－ ＣＡＤＢ（ＣＥＦ９４ 株 的 Ａ 节 段 和 Ｄ６９４８ 株 的 Ｂ 节 段 ）可 以 适 应 ＱＭ５， 这 说 明 决 定 ＩＢＤＶ 细 胞 嗜 性 的 关 键 基 因 在 Ａ 节 段［４］。 随 后 ， 他 们 将 ｖｖＩＢＤＶ Ｄ６９４８ 株 的 ＶＰ２ 替 换 ＣＥＦ９４ 株 的 相应部位， 转染后只能在原代法氏囊细胞上获得拯救， 而 不 能 在 ＱＭ５ 细 胞 上 检 测 到 拯 救 的 病 毒 粒 子 ， 这 也 同 样 证 明 了 ＶＰ２ 决 定 ＩＢＤＶ 的 细 胞 嗜 性 ［４］。
第 ３０ 卷 第 ８ 期 ２００８ 年 ８ 月
中国预防兽医学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｖｏｌ．３０２ 蛋白研究进展
祁小乐， 王笑梅 ＊， 高玉龙， 高宏雷
（中 国 农 业 科 学 院 哈 尔 滨 兽 医 研 究 所 兽 医 生 物 技 术 国 家 重 点 实 验 室 ／ 禽 传 染 病 研 究 室 ， 黑 龙 江 哈 尔 滨 １５０００１）
ＩＢＤＶ 属 于 双 ＲＮＡ 病 毒 科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）禽 双 ＲＮＡ 病 毒 属 （Ａｖｉｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）。 ＩＢＤＶ 基 因 组 由 两 个 双 股 ＲＮＡ 节 段 组 成 。 Ａ 节 段 长 ３ ２６０ ｂｐ， 包 括 两 个 开 放 阅 读 框 （ＯＲＦ）： 小 ＯＲＦ 在 前 ， 编 码 ＶＰ５ 蛋 白 （１７ ｋｕ）； 大 ＯＲＦ 在 后 ， 编 码 一 个 多 聚 蛋 白 ＮＨ２－ｐＶＰ２－ＶＰ４－ＶＰ３－ＣＯＯＨ （１０８ ｋｕ）。 该 多 聚 蛋 白 在 加 工 过 程 中 被 蛋 白 水 解 酶 ＶＰ４ 剪 切 成 ３ 个 蛋 白 ｐＶＰ２ （４９ ｋｕ）， ＶＰ３ （３２ ｋｕ）， ＶＰ４ （２８ ｋｕ）， ｐＶＰ２ 进 一 步 被 加 工 成 ４０ ｋｕ～４２ ｋｕ 的 ＶＰ２ 蛋 白 。 Ｂ 节 段 长 ２ ８２７ ｂｐ， 编 码 具 有 ＲＮＡ 依 赖 的 ＲＮＡ 聚 合 酶 活 性 的 ＶＰｌ 蛋 白 （９０ ｋｕ）。 ＶＰ２ 构 成 病 毒 的 外 衣 壳 ， 约 占 病 毒 总 蛋 白 的 ５１ ％ ， 是 ＩＢＤＶ 的 主 要 结 构 蛋 白 和 功 能 蛋 白 ［１］。 本 文 主 要 综 述 了 ＶＰ２ 蛋 白 与 ＩＢＤＶ 抗 原 变 异 、 细 胞 嗜 性 、 毒 力 、 免 疫 原 性、诊断等方面的重要关系， 以期在了解结构与功能的基 础 上 为 ＩＢＤＶ 防 控 提 供 依 据 和 思 路 。
Ｌｉｍ 研 究 发 现 ， 单 点 突 变 Ｓ３３０Ｒ 不 能 使 ｖｖＩＢＤＶ ＨＫ４６ 株 适 应 ＣＥＦ 细 胞 ［７］。 Ｂｒａｎｄｔ 也 认 为 Ｓ３３０Ｒ 不 能 使 强 毒 适 应 细 胞 培 养 ， 单 位 点 回 复 突 变 Ｒ３３０Ｓ 也 不 改 变 Ｄ７８ 适 应 细 胞 培 养 的 特 性 。 研 究 还 发 现 ， ３３０ 位 氨 基 酸 在 影 响 ＩＢＤＶ 细 胞 嗜 性 方 面 也 不 能 对 ２５３、２８４ 等 关 键 位 点 起 协 同 作 用［８］。
１ ＶＰ ２ 是 ＩＢＤＶ 的 主 要 变 异 区