多酚氧化酶特性及活性

食品中的多酚氧化酶中国食品产业网 (2007年3月3日11:27)多酚氧化酶(POlyphenol Oxidase , PP0)是自然界分布极广的一种氧化还原酶，茶叶中的多酚氧化酶通过控制不同的酶活可以加工成品质与滋味迥异的各类茶叶。

自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年KeilinD .和MannG研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为p01yphenol Oxidase。

之后多酚氧化酶一直是研究的热点, 尤其是在PP0的生化、生理学性质方面取得了较大的进展。

氧化还原酶(1)酚酶又称多酚氧化酶、酪氨酸酶、多酚酶、儿茶酚氧化酶、甲酚酶、儿茶酚酶。

最适pH为5〜乙可以催化酚类物质氧化。

酚酶在植物界中存在广泛，是许多蔬菜、水果的切面在空气中迅速变黑的主要原因。

1、多酚氧化酶的分布与在植物中的作用PP0是核编码的的铜金属酶，是在细胞质中合成的，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，PP0相当稳定，甚至在土壤中已腐烂的的植物残渣上都可检测到PP0的活性。

在植物(如土豆、苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、烟草等)组织中，PP0是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后酶活被活化，从而表现出活性，在果蔬细胞组织中，PP0存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PP0活性大部分存在于叶绿体内；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PP0含量大约与蛋白质部分相同，马铃薯芽、根的多酚氧化酶的活性最高，幼叶和成熟块茎中活性中等，成熟叶和茎叶活性最低；在茶叶中的PPo可分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PP0而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态，StePhenThana⑻S.N. （1990）研究了茶树新稍中PP0活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PP0活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产。

实验11、多酚氧化酶（PPO）活性的测定《果蔬采后生理生化实验指导》曹建康姜微波赵玉梅编著一、原理多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。

在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。

多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm 处有最大光吸收峰。

因此可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。

二、仪器设备1、研钵2、高速冷冻离心机3、分光光度计4、计时器5、移液器6、离心管7、试管8、容量瓶（100 mL 、1000 mL）三、试剂1、0.1 mol·L—1 、pH 5.5乙酸—乙酸钠缓冲液母液A（200 mmol·L—1 醋酸溶液）：量取11.55 mL 冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000 mL 。

母液B（200 mmol·L—1 醋酸钠溶液）：称取16.4 g 无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000 mL 。

取68 mL 母液A和432 mL 母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000 mL 。

2、提取缓冲液（含1 mmol PEG、4% PVPP、和1% Triton X—100）称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮），取1 mL Triton X—100，用0.1 mol·L—1 、pH 5.5乙酸—乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100 mL 。

3、50 mmol·L—1 邻苯二酚溶液称取275 mg 邻苯二酚，用0.1 mol·L—1、pH 5.5乙酸—乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50 mL 。

四、实验步骤1、酶液制备：称取5.0 g 样品，置于研钵中，加入6.0 mL 提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，再用10 mL 分次清洗研钵，用抽滤法进行粗滤，使用液相纯化膜进行精滤，即得到酶提取液，低温保存备用。

马铃薯多酚氧化酶实验报告马铃薯多酚氧化酶实验报告引言：马铃薯是世界上最重要的粮食作物之一，也是人们饮食中不可或缺的主要食物之一。

马铃薯中含有丰富的多酚类化合物，其中的多酚氧化酶是一种重要的酶类。

本实验旨在研究马铃薯中多酚氧化酶的活性及其影响因素。

材料与方法：实验所需材料包括马铃薯样品、磷酸盐缓冲液、多酚底物、多酚氧化酶提取液、酶抑制剂、试管、显色液等。

首先，将马铃薯样品切碎并加入磷酸盐缓冲液中，用搅拌器搅拌均匀。

然后，将混合液离心，取上清液作为多酚氧化酶提取液。

接下来，将提取液与多酚底物混合，并分别加入不同试管中。

在一定温度下，加入酶抑制剂的试管作为对照组。

最后，加入显色液，测定各试管中的吸光度。

结果与讨论：实验结果显示，马铃薯中的多酚氧化酶活性随着温度的升高而增加。

在较低的温度下，酶活性较低，但随着温度的升高，酶活性逐渐增加，达到一个最高点后开始下降。

这是因为在较低温度下，酶的活性受限，酶分子的振动较小，无法与底物有效结合。

随着温度的升高，酶分子的振动增大，使得酶与底物之间的亲和力增强，从而提高了酶的活性。

然而，当温度过高时，酶的结构可能发生变化，导致酶活性下降。

此外，实验还发现，多酚氧化酶的活性受pH值的影响。

在中性条件下，酶的活性最高，而在酸性或碱性条件下，酶的活性明显下降。

这是因为多酚氧化酶是一种酸性酶，在中性条件下，酶的结构最稳定，最有利于与底物结合。

而在酸性或碱性条件下，酶的结构可能发生变化，使得酶与底物的结合受到限制，从而降低了酶的活性。

此外，实验还研究了酶抑制剂对多酚氧化酶活性的影响。

实验结果显示，加入酶抑制剂后，多酚氧化酶的活性明显下降。

这是因为酶抑制剂可以与酶结合，从而阻止酶与底物的结合，抑制酶的活性。

这一结果表明，多酚氧化酶的活性受到酶抑制剂的调控。

结论：通过本实验的研究，我们得出了以下结论：马铃薯中的多酚氧化酶活性受到温度和pH值的影响。

温度的升高可以提高酶的活性，但过高的温度会导致酶的活性下降。

不同成熟度烟叶烘烤过程中多酚氧化酶活性变化不同成熟度烟叶烘烤过程中多酚氧化酶活性变化摘要特色烤烟品种CB-1各部位不同采收成熟度的烟叶在烘烤过程中关键温度点多酚氧化酶活性的变化规律研究表明,CB-1不同部位烟叶无论成熟度高低,在整个烘烤过程中PPO活性均高于对照K326。

整个烘烤过程中上、中、下3个部位不同处理在46 ℃左右时PPO活性达到一个高峰,而此温度点正是酶促棕色化反应的敏感期,54 ℃之后烟叶中PPO活性基本消失,不同部位及成熟度之间差异不大。

整个烘烤过程下、上部烟叶呈先降低后升高再降低的曲线变化规律,而中部叶呈先升高再降低的变化规律。

因此,下部叶适当早采降低烟叶采收成熟度、中部烟叶适当提高烟叶采收成熟度、上部烟叶采取适宜的成熟度,有利于抑制棕色化反应,提高烟叶内在品质。

关键词烟叶;多酚氧化酶;成熟度;烘烤;活性变化ChangesofPolyphenolOxidaseActivityinDiferentMaturityTobaccoduringFlue-curingProcessLAN Jun-rongJING Jun-lingHUANG Yi-lanPENG Huai-jun(Sanming Company of Fujian Tobacco Corporation,Sanming Fujian 365001)AbstractPolyphenol oxidase activities of different maturity degree of tobacco in different parts of CB-1 in the curing process critical temperature point were studied. The results showed that regardless of maturity in different parts of the level of tobacco in the entire baking process,PPO activity in CB-1 was higher than in the control K326. The PPO activity of different treatments reached a peak at about 46 ℃,and this point was the temperature of the enzymatic browning reaction of the sensitive period,the PPO activity in tobacco leaves disappeared after 54 ℃and there was no significant difference between maturity. PPO variation of the curing process was that the lower and upper leaves decreased firstly then increased and decreased after the changes of the curve,while the middle leaves increased firstly and then reduced. Therefore,early harvest for the lower leaves,an appropriate increase in the central tobacco leaf harvest maturity,the appropriate maturity for upper leaves was conducive to inhibit the browning reaction and improve the internal quality tobacco.Key wordstobacco;polyphenol oxidase;maturity;baking;activity changes多酚氧化酶(PPO)是一种铜离子结合酶,在组织发育过程中形成,并贮存于叶绿体中。

版本：A1 修改日期：2023.12.19PPO 染色液产品简介：多酚氧化酶(polyphenol oxidase ，PPO)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性，多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂；该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。

Leagene 多酚氧化酶(PPO)染色液是利用邻苯二酚在多酚氧化酶的酶促作用下，产生棕色或褐色醌类化合物来表示多酚氧化酶的存在的。

主要用于植物或者昆虫等组织材料的多酚氧化酶(PPO)的染色观察。

该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

产品组成：自备材料：1、 蒸馏水2、 蚕豆叶片、玉米种子根尖等样品3、 显微镜、镊子、吸管、恒温箱或水浴锅操作步骤(仅供参考)：1、 根据实验具体要求操作。

实验结果：棕红色或褐色沉淀部位即多酚氧化酶活性部位。

注意事项：1、 玉米幼根最好选取从根尖到成熟区各部位的切片进行染色，便于进行酶活性的比较观察。

编号 名称 DP0021 2×50ml Storage 试剂(A): PPO 预染液 50ml RT 试剂(B): 邻苯二酚染色液 50ml 4℃ 避光 使用说明书 1份2、样品可4℃保存2~3天，亦可-20℃保存。

3、切片放入染色液后保温时间长短视实验材料而定，时间过长，茶褐色化合物会溶解到溶液中，使切片颜色变淡，影响结果。

时间太短，反应也不完全，不易观察到明显的反应。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5、试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。

有效期：3个月有效；常温运输，按要求保存。

生化实验报告[键入文档副标题]实验一多酚氧化酶（PPO）的分离与提取一、实验目的1、本实验以马铃薯为主要的实验材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。

2、通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。

二、实验原理多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，参与植物抗体的调节，属于末端氧化酶的一种。

在植物体受到机械损伤和病毒感染后，PPO催化酚与氧氧化成醌，使组织形成褐变，对PPO弄得的测定便是通过PPO氧化酚产生醌的变色反应测定其酶活性。

在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。

这种现象称为盐溶；而在蛋白质水溶液中继续加入无机盐类可以其溶解度降低而析出的过程，该现象称为盐析。

蛋白本身随盐浓度的溶解度变化曲线具有特征性，可以依据此分离蛋白，硫酸铵分级便依据此原理，首先在蛋白质溶解度最高时，离心取上清，去除此时未溶解或已经沉淀的杂蛋白，之后再其溶解度最低且未变性的时候离心取沉淀复溶，去除尚未析出的杂蛋白，从而达到纯化目的蛋白的目的。

多酚氧化酶在40%硫酸铵溶液中溶解度最高，而在75%硫酸铵溶液中沉淀量最高，由此可分离提取多酚氧化酶。

但使用硫酸铵分级，分离后的产物中会有铵根离子残留，如果采用凯氏定氮法测定蛋白质浓度时，残留的铵根离子会造成测定时高于实际值，同时该样品之后会用于离子交换层析纯化，所以需要去除其中的离子，故需要透析去除其中铵根离子。

多酚氧化酶提取在PH6.0的中性偏酸条件下进行，在此PH值下，磷酸缓冲液的缓冲能力最强，故选择使用其作为缓冲液，其中加入的EDTA为螯合剂，聚乙烯比咯烷酮是用于吸附醌，本身为固体颗粒，不需要溶解。

三、仪器与试剂：（1）马铃薯200g（2）试剂：溶液A：0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯比咯烷酮）固体硫酸铵溶液B：0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005M 氯化镁）实验器械与仪器设备：烧杯，玻璃棒，量筒，天平，高速冷冻离心机，离心杯，透析袋，植物组织匀浆器，过滤纱布。

实验五多酚氧化酶的制备和性质研究一、目的⒈学习从组织细胞中制备酶的一般方法⒉学习多酚氧化酶的作用特性及影响多酚氧化酶作用的因素二、原理多氧化物酶是一种含铜的酶，广泛存在于各种组织如鲜蘑菇、土豆和水果中。

土豆、水果去皮后表面变成褐色就是由于该酶作用的结果。

由多酚氧化酶催化的反应（以邻苯二酚为例）可用下式表示：多酚氧化酶作用的最适pH为6～7，最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）；间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，他们也可被氧化为相应的醌类化合物。

因此，由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液颜色的变化鉴定。

细胞环境中的各种因素直接影响酶的催化活性，因为酶是生物催化剂。

要研究某一种因素对于酶催化反应的影响时，仅在被研究的因素呈变化的情况下，测定它对于反应速度的影响，而其他的实验条件应保持一致。

三、材料1）土豆2）高速组织捣碎机3）烧杯（100mL）4）平纹布或纱布5）试管及试管架6）恒温水浴7）小刀8）移液管（2mL、5mL、10mL）四、试剂⑴0.1mol/L的氟化钠（NaF）溶液：把4.2gNaF溶于1000mL水中。

⑵0.01mol/L的邻苯二酚溶液：将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用1％的氢氧化钠调节溶液的pH为6.0 。

新鲜配制，并储存于棕色瓶中。

⑶柠檬酸缓冲液（0.05mol/L,Ph4.8）⑷5%的三氯乙酸溶液⑸苯硫脲（结晶）⑹0.01mol/L的间苯二酚溶液⑺0.01mol/L的对苯二酚溶液⑻饱和硫酸铵溶液⑼0.96％的盐酸：把9.6mL浓盐酸加水稀释至1L⑽0.1%的乳酸溶液（100mL水中含有0.1mL的乳酸）⑾0.5％的碳酸钠溶液⑿0.01％的碳酸钠溶液五、操作步骤⒈多酚氧化酶的制备⑴拿一块土豆，洗去上面的泥土⑵把土豆削皮后切成小块⑶称取100g小块土豆，立即加入氟化钠溶液100mL，放入组织捣碎机中研磨30s，（此步最好6个同学一起做，上述用量乘6）⑷把匀浆物通过几层纱布过滤⑸取50mL滤液（注：滤液应无色，若为红色应重新匀浆提取），加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合后于4℃放置30min，可见有白色沉淀产生。

实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的经过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。

二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。

用分光光度法在 525nm 波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。

反应式以下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2——————→邻醌＋ H2O三、资料、仪器及试剂1.资料：马铃薯块茎等2.仪器：UV－1206 或UV－1240 分光光度计；离心计；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。

3.试剂：聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）； 0.01mol ·L－1pH 6.5 磷酸缓冲液； 0.1mmol·L－1－1pH6.5 磷酸缓冲液； 0.05mol LpH5·.5 磷酸缓冲液； 30%饱和度硫酸铵； 0.1－1mol ·L儿茶酚；20％三氯乙酸。

四、实验步骤1.粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g 于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（早先用蒸馏水浸洗，尔后过滤以除去杂质）和100ml0.1mol ·L－1pH6.5 磷酸缓冲液 ,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除积淀，上清液再加硫酸铵使达 60％饱和度，离心收集积淀。

将所得积淀溶于2～3ml0.01mol ·L－1pH6.5 磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

2.活性酶的测定在试管中加入 3.9ml 0.05 mol L－·1pH5.5 磷酸缓冲液， 1.0ml 0.1 mol L －·1 儿茶酚在 37℃恒温水浴中保温 10min，尔后加入 0.5ml 酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于 525nm 波长处以时间扫描方式，在 1～2min 内测定吸光度变化（ A）值。

五、酶活性的计算以每 min 内 A525 值变化 0.01 为 1 个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。