病毒分离前样品的实验室处理方法

病毒标本实验室管理制度一、目的和范围为了做好病毒标本实验室管理，保障工作人员的安全和病毒标本的安全，提高实验室工作效率，特制定本管理制度。

本制度适用于所有从事病毒标本实验室工作的人员。

二、安全管理1. 实验室内部安全（1）实验室内部应按照规范进行分区，分别设置样本处理区、核酸提取区、实验操作区和贮存区。

（2）实验室内部应有防护设施和设备，包括生化安全柜、生物安全柜、紫外线消毒灯等。

（3）实验室内部应配备必要的个人防护用具，如防护服、口罩、手套等。

（4）实验室内部应定期进行消毒和清洁。

2. 实验室外部安全（1）实验室外部应设置警示标识，禁止未经许可的人员进入。

（2）实验室外部应设有安全监控设备，实时监测实验室内部情况。

（3）实验室外部应定期进行除草和除害虫工作，保持实验室周围环境清洁。

三、人员管理1. 人员培训（1）所有从事病毒标本实验室工作的人员必须接受相关的安全培训。

（2）新员工入职时应进行入职培训，包括实验室安全规定、应急处理办法等。

2. 人员健康管理（1）实验室工作人员应定期进行健康检查，保障自身健康状况。

（2）实验室工作人员应有规范的工作服着装要求，保持良好的个人卫生习惯。

3. 人员监管（1）实验室工作人员应按规定佩戴个人防护用具，配合进行工作。

（2）实验室内部应设置监控设备，对工作人员的工作行为进行监控。

四、标本管理1. 样本采集（1）样本采集应按照规范操作流程进行，避免样本交叉污染。

（2）样本采集完成后，应及时进行标本传输和贮存。

2. 样本存储（1）存储区域应按照样本种类和存储期限进行分类，保证存储环境干净整洁。

（2）存储区域应定期进行消毒和清洁工作，保障存储区域的清洁。

（3）存储区域应设置防火、防水设备，保障存储区域的安全。

3. 标本处置（1）标本处置应按照规范操作流程进行，做好标本处置记录。

（2）标本处置应遵守相关的废弃物处理规定，保护环境。

五、设备管理1. 设备维护（1）设备维护应按照规定进行，定期进行设备保养和检查。

第一章样品的采集和处理1范围本章规定了用于人免疫缺陷病毒（HIV）检测的全血、血清、血浆、细胞、唾液、尿液以及滤纸干血斑（DBS）样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体检测、抗原检测、核酸检测、耐药检测,CD4+和CD8+T淋巴细胞测定和HIV分离培养。

2规范性引用文件《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》中华人民共和国卫生行业标准WS293-2008《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南（试行）》（中国疾病预防控制中心，2006年2月）《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南（试行）》（中国疾病预防控制中心，2008年2月）Guidelines for Using HIV Testing Technologies in Surveillance WHO/CDS/CSR/EDC/2008《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》，卫生部第45号令2006年2月1日3样品种类及相应的用途3.1全血、血清、血浆、唾液、尿液以及DBS样品可用于HIV抗体检测。

3.2抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定。

3.3血浆可用于HIV-1病毒载量、基因型及耐药检测。

DBS样品可用于HIV-1基因型及耐药检测。

3.4全血、血浆、淋巴细胞富集液、外周血淋巴细胞（PBMC）及DBS样品可用于HIV核酸的定性检测。

3.5PBMC、全血、淋巴细胞富集液等可用于HIV-1分离培养。

4操作步骤4.1采样前准备根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采血技术规范的要求操作，遵守生物安全要求（参见本规范第八章实验室生物安全）。

要检查所需物品是否已备齐，是否在有效期内，有无破损，是否足量，特别应检查受检者信息与样品容器表面的标记是否一致，并注明样品采集时间。

选择合适的室内（外）采血空间，受检者坐（卧）于合适的位置，准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废弃物容器等。

人禽流感标本的采集、运送、处理及保存操作规程一、目的规范人禽流感标本的采集、运送、处理及保存操作。

二、适用范围本操作规程适用于人禽流感标本的采集、运送、处理及保存。

三、简介人禽流感检测过程中，采集的标本包括鼻咽拭子、漱口液、血液等。

本实验室一般用鼻咽拭子或漱口液进行病毒分离与分子生物学检测，血清用于人禽流感抗体检测，采集血液部位一般位于前臂肘静脉。

四、器材1、用于血液收集的基本耗材包括：医用（5ml和10ml）一次性注射器、一次性乳胶手套、止血带、碘酒、无菌拭子、血清储藏管、标本标签、创可贴、可封口塑料袋、标本采集表格、带有冰袋的冰壶、棉拭子、污物桶、笔、试管架。

2、用于鼻咽拭子、漱口液等收集的基本耗材包括：一次性乳胶手套、防护服、十二层口罩（或N95口罩）、采样无菌棉签、采样液（螺口塑料管装）、可封口塑料袋、带有冰袋的冰壶、污物桶、样品登记表、笔、试管架。

附：血清保存管：2 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）；鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）；尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；记号笔：油性，防水。

五、人禽流感标本采集操作规程（一）标本采集要求1．采样人员须以无菌操作采集各类标本。

采集标本所使用的容器、采样液等均应无菌。

编制：福建省疾控中心病毒性疾病防治科审核：沈晓娜批准：严延生2. 每份标本必须标明标本编号、标本种类及采集日期。

采集单位应指定专人负责标本的登记、收集和管理，并认真填写“人禽流感标本采集登记表。

”3.所有标本的收集、运输和保藏都应装在有螺旋盖的塑料管中，以防止开、关标本管时产生气溶胶，并用两层清洁塑料袋包裹严实。

4.采集的标本应立即送当地疾病预防控制机构，同时附上标本送检单。

如不能立即送交，可置-20℃以下冰箱短暂保存（24小时之内）。

（二）标本采集种类与方法标本采集的时间、位置及质量对能否分离到病毒或提取到有活性的RNA至关重要，而标本保存与运输不当，也会影响病毒的分离。

流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。

分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。

病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。

病毒分离亦受一定限制。

目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。

MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。

分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。

由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。

各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。

流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。

)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。

样品的接收、登记和处理操作规范1、目的规范艾滋病病毒（HIV ）检测的血清、血浆和全血样品的采集和处理，确保HIV 抗原、抗体、核酸检测、CD 4+/CD 8+T 淋巴细胞测定和HIV 分离培养。

2、适用范围艾滋病病毒（HIV ）检测的血清、血浆和全血样品的采集和处理3、职责3.1 实验室工作人员：应熟知并遵守本SOP ，掌握艾滋病病毒（HIV ）检测样品的采集、运送、处理、接收与登记。

4 、操作步骤4.1样品的采集和处理艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。

唾液或尿液有时也可作为测试样品。

常用的血液样品的采集和处理方法如下：4.1.1血清样品采集和处理4.1.1.1用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量静脉血，室温下自然放置1~2h ，待血液凝固、血块收缩后再用3、000r/min 离心15min ，吸出血清备用。

4.1.1.2如用滤纸片采样，则手指或耳垂局部严格按常规进行消毒，在刺破皮肤后，迅速把滤纸片沾上，切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。

采血后要待血样干燥后再包装送检。

4.1.2抗凝血样品采集和处理4.1.2.1用加有抗凝剂的真空采血管（或一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。

4.1.2.2应根据实验要求选用适当的抗凝剂，如CD 4+/CD 8+T 淋巴细胞测定可选用K 3EDTA 或肝素或枸橼酸钠，HIV 病毒分离、核酸定性/定量检测可选用K 3EDTA 或枸橼酸钠。

4.1.2.3 用于核酸定性检测时，采集的抗凝全血应在4~8h 内分离PBMC 和血浆，否则应在24~48h 内分离血浆和血细胞。

病毒载量测定不同方法对样品的要求见第四章4.1中表2；CD 4+/CD 8+T 淋巴细胞测定样品采集要求见第五章4.1。

4.1.3采集样品注意事项4.1.3.1采集样品原则上应按临床采血技术规范操作（试剂盒说明书有特殊要求除外）。

4.1.3.1采集样品时应注意安全，建议采用真空采血管及蝶形针具，以避免直接接触血液；直接接触HIV感染者/艾滋病（AIDS）病人血液/体液的操作,应戴双层手套。

HIV实验室检测方法和步骤HIV，也称为人类免疫缺陷病毒，是一种能导致艾滋病的病毒。

HIV实验室检测方法和步骤被广泛应用于检测感染HIV的个体。

以下是一般情况下使用的实验室检测方法和步骤的详细说明。

1.预处理和登记在进行HIV实验室检测之前，需要对样本进行预处理和登记。

预处理包括标识样本的相关信息，如样本编号和患者信息。

这些信息对于结果记录和跟踪是至关重要的。

此外，还需检查样本的适应性和完整性。

2.血液样本采集3.血清分离采集到的血液样本需要进行血清分离。

这可以通过离心来分离血液的不同成分，例如血红蛋白和血清。

离心速度和时间需要根据实验室设备和协议进行调整。

4.酶联免疫吸附测定法（ELISA）最常用的HIV实验室检测方法是酶联免疫吸附测定法（ELISA）。

这种方法使用特定的抗体来检测血液中特定的抗原。

根据ELISA方法的不同，可检测HIV抗原或抗体。

实验室技术人员将患者血清样本加入到已包含HIV相关抗原或抗体的试剂盘中，然后根据试剂盘的建议操作，包括孵育时间、温度和洗涤步骤。

任何与接触抗原或抗体反应的特异性颜色改变，都可作为阳性结果。

否则，结果被视为阴性。

5.确认试验在进行HIV检测的初步结果后，通常会进行一个或多个确认试验。

确认试验的目的是统一确定检测结果的可靠性。

常用的确认试验包括HIV免疫荧光试验（IFA）和西方印迹法（Western blot）。

这些试验通过检测血清中的HIV特异性抗体，以确保先前的结果的准确性。

6.分子检测有时，为了获得更加可靠和敏感的结果，实验室会使用分子检测方法，例如聚合酶链式反应（PCR）。

PCR可以检测和放大病毒的基因或核酸，以确定HIV感染的存在和病毒的数量。

7.结果解读和记录HIV实验室检测结束后，实验室技术人员需要解读并记录结果。

阳性结果意味着存在HIV感染，而阴性结果则表示未检测到HIV感染。

针对不同的检测方法和样本类型，结果的解释可能有所不同。

因此，在结果解读和记录时，实验室人员需要严密遵循实验室的标准操作规程（SOP）。

HIV病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程1. 标本采集1.1 采集过程- 标本采集应由经过相应培训的医务人员进行。

- 采集前应充分向受检者解释采集过程，并获得其知情同意。

- 采集时应采取严格的无菌操作，以避免污染。

- 一般采集静脉全血样本，采集量不少于5ml。

1.2 标本处理- 采集后的标本应尽快送至实验室，避免暴露时间过长。

- 采用专用的血液收集管，确保标本完整无漏。

- 标本送至实验室前，应妥善保存并严禁摇晃。

2. 送检流程2.1 标签标识- 标本送检前，应在采集管上粘贴完整、清晰的条码标签，以确保标本追踪可靠性。

2.2 填写送检单- 标本送检时，应填写完整的送检单，包括受检者个人信息、采集时间、送检目的等相关信息。

2.3 送检方式- 送检可选择邮寄或快递方式，确保标本能够安全送达实验室。

- 快递包装需符合相关规定，避免标本在运输过程中受损。

3. 处理流程3.1 标本分离- 实验室接收标本后，应立即进行核酸分离，以保证分析的准确性。

3.2 核酸提取- 将分离的标本进行核酸提取，提取后的核酸可用于后续的检测操作。

3.3 核酸检测- 采用合适的核酸检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）等，对提取的核酸进行检测。

3.4 结果解读- 核酸检测结果应由经验丰富的专业人员进行解读，并做出相应的结果报告。

4. 结论本文档简要介绍了HIV病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程。

标本采集要求医务人员进行，并在采集前向受检者解释采集过程。

送检时需填写完整的送检单，并确保标本的追踪可靠性。

实验室应迅速进行标本分离、核酸提取和核酸检测，并由专业人员进行结果解读。

以上流程的规范实施可提高HIV病毒核酸检测的准确性和可靠性。

附件 10新冠病毒样本采集和检测技术指南为指导各级疾控部门和其他相关机构规范开展新冠肺炎病例标本采集与实验室检测工作，保证检测质量，提高检测效率，特制定本指南。

一、标本采集（一）采集对象。

新冠肺炎病例、可疑感染人员和其他需要进行检测的人员，以及可能被污染的环境或物品等。

（二）采样人员基本要求。

从事标本采集的技术人员应当经过生物安全、监测技术培训并合格，熟悉标本采集方法，熟练掌握标本采集操作流程。

应严格按照操作流程进行采样，按要求做好标本信息记录，确保标本质量符合要求、标本及相关信息可追溯。

（三）标本采集基本要求。

1.住院病例的标本由所在医院的医护人员采集，密切接触者标本由当地指定的疾控机构、医疗机构负责采集。

采集标本时，要根据不同采集对象设置不同的采样区域，发热患者前往发热门诊就诊、采样，未设置发热门诊的机构应设置发热患者专用采样区域，将发热患者与其他检测人群分区采样，避免交叉感染。

2.无症状感染者、入境人员、密切接触者在隔离观察期间应采集鼻咽拭子进行核酸检测，解除隔离时应同时采集 2 份鼻咽拭子样本，分别使用不同核酸检测试剂检测，2次检测原则上由不同检测机构开展。

3.根据临床及实验室检测工作的需要，可在住院、隔离期间多次采样，可同时采集呼吸道、血液、便等多种标本。

采样人员应严格遵循采样规范采集标本，保障所采集标本质量符合要求，同时应详细记录受检者信息，可利用条形码扫描等信息化手段采集相关信息。

4.人群筛查应根据核酸提取、检测所用试剂的要求确定采样管，可选择含病毒灭活剂（胍盐或表面活性剂等）的采样管。

用于病毒分离的标本应放置于不含有病毒灭活剂的采样管。

5.物品和环境监测应根据监测目的和防控需求，确定采样物品、位置与数量，采样时应严格遵循采样规范。

（四）采集标本种类。

每个病例必须采集急性期呼吸道标本（包括上呼吸道标本或下呼吸道标本），重症病例优先采集下呼吸道标本；根据临床需要可留取便标本、全血标本、血清标本和尿标本。

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流式细胞术(FCM)
FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能 快速、精确的对单个细胞理化特性进行多 参数定量分析和分选的技术。
Laser
FALS Sensor
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流式细胞术特点
单细胞的流动的
活细胞的
定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞
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CD4+T淋巴细胞测定的方法
支持性文件:《全国艾滋病检测技术规范》(2009)、《艾
滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南》 (2006)、《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南》(2008)、《可感 染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》(卫 生部45号令，2006)
海南省皮肤病医院
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CD4细胞计数样品的采集运输
采血时间：鉴于CD4+T淋巴细胞数日间自然变化 的个体差异，每一病人采样时间应尽可能集中在 某个相同的时段 运输条件：37℃以上的温度会破坏细胞，使血液 学和流式仪的检测结果受到影响。因此应在室温 (18-25℃)保存和运输样品，避免极端温度(结冰 或大于37℃)。高温季节，需用隔热容器盛装样 品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中 样品应存放于室温，不得冰冻保存，并且在24小 时之内送达检测实验室
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病毒载量检测样品采集运输保存
HIV-1，血浆样品
EDTA抗凝真空无菌采血管
全血5ml或3ml*2, 采集的样品量应尽可能 与定量采血管的刻度一致，采集量过多或 不足，会造成血液凝固或被稀释。采集血 液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管约10次， 使血液与抗凝剂充分混匀，避免剧烈振荡 导致溶血

非洲猪瘟实验室检测流程非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种高度致命的病毒性疾病，主要影响猪的健康和生存。

为了预防和控制ASF的传播，各国都设立了实验室来进行ASF的检测。

下面是非洲猪瘟实验室检测的基本流程。

1.样品收集：首先需要从疑似感染ASF的猪的组织、血液、粪便等样品进行采集。

收集到的样品必须遵循适当的采样方法，以确保样本的完整性和准确性。

2.样品处理：收集到的样品需要进行处理，以便提取病毒或检测病毒的核酸。

处理过程可能包括样品离心、冻干或冷冻保存等步骤，以确保样品的保存和稳定性。

3.样品提取：处理后的样品需要进行核酸提取，以获取样品中的ASF 病毒的DNA或RNA。

提取方法包括使用商用试剂盒或自制提取试剂等多种方式。

4.PCR检测：提取到的核酸可以用于聚合酶链式反应（PCR）检测ASF 病毒的存在。

PCR是一种常用的分子生物学方法，可以放大病毒的核酸并检测其存在与否。

5.结果分析：通过PCR检测，可以获得ASF病毒的阳性或阴性结果。

阳性结果表明样品中存在ASF病毒，阴性结果则表示样品中不存在ASF病毒。

6.病毒分离与鉴定：如果样品经过PCR检测呈阳性结果，接下来需要进行病毒的分离和鉴定。

这通常是通过将阳性样品接种到特定细胞系或动物体内，观察病毒是否能够繁殖和感染。

7.结果报告：最后，实验室将审核、整理和报告检测结果。

病毒检测报告通常包括样品信息、检测方法、结果和相关建议等内容，以便于参与疫情控制和预防的机构进行后续处理。

此外，非洲猪瘟实验室检测流程还可能包括对样品进行深度测序以了解ASF病毒株系、进行病毒血清学检测以了解对ASF病毒的免疫反应等。

总的来说，非洲猪瘟实验室检测流程需要收集、处理和提取样品，通过PCR检测病毒核酸，进行病毒的分离与鉴定，并最终形成检测结果和报告。

这些检测流程的目的是及时、准确地检测ASF病毒，为疫情监测和控制提供依据。

艾滋病样品的采集和处理1.范围本节规定了用于人免疫缺陷病毒（HIV）检测样品的采集和处理方法，用于 HIV 抗体检测、抗原检测。

2.规范性引用文件《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》中华人民共和国卫生行业标准 WS 293-2008《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者 CD4+T 淋巴细胞检测质量保证指南（试行）》（中国疾病预防控制中心，2006 年 2 月）《HIV-1 病毒载量测定及质量保证指南（试行）》（中国疾病预防控制中心，2008 年2 月）Guidelines for Using HIV Testing Technologies in Surveillance WHO/CDS/CSR/EDC/2008 《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》，卫生部第 45 号令2006 年 2 月 1 日3.操作步骤3.1.采样前准备根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采血技术规范的要求操作，遵守生物安全要求（参见 HIV 实验室生物安全）。

要检查所需物品是否已备齐，是否在有效期内，有无破损，是否足量，特别应检查受检者信息与样品容器表面的标记是否一致，并注明样品采集时间。

选择合适的室内（外）采血空间，受检者坐（卧）于合适的位置，准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废弃物容器等。

3.1.1.样品的编码和记录应制定样品编码的标准操作程序（SOP），规定样品编码的原则和方法，为样品制定唯一性编码（编号），保证其唯一性。

3.1.2.应使用专门的样品记录本或登记表记录样品，同时录入电脑保存。

3.2.采集和处理样品3.2.1.血液3.2.1.1血清：根据需要，用一次性注射器（或真空采血管）抽取 2～3ml 静脉血，室温下自然放置1～2h，待血液凝固、血块收缩后再用 1500～3000r/min 离心15min，吸出血清，置于合适的容器中，备用。

病毒的分离与鉴定（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离…（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。

1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。

所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。

细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。

原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。

原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。

因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。

二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。

二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。

二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃）内，做为“种子”，供以后传代用。

传染病实验室诊断、传染源调查、自然疫源地监测、流行病学调查研究，都以检出特定的病原微生物或其相关物质为目的。

这类样本来源主要是人和宿主动物、媒介昆虫，也包括水、土壤、食品等样本供调查传染源。

1、病原微生物样本采集的一般注意事项1）针对性：不要求样品代表性，强调针对性，尽可能采集病原微生物含量最多的部位。

2）足量：应采用足够检测用的样本，否则可能会得到假阴性结果。

3）多样性：应采集各种可能作为污染源的食物和环境样本，以及各种可能含有病原体的临床样本。

4）及时性：取样后应尽快测定，以利于疾病控制和患者的治疗。

2、样本保存、包装、运送1）保存：为分离样本中病原细菌或病毒，应根据样本运送时间的长短及不同病原微生物对干燥、温度、营养、pH 值的耐受能力，选择合适的培养基和推荐保存温度。

分离培养细菌的样本：在运送培养基中运送并保存于合适的温度，确保目标细菌的存活并抑制其他微生物的过度生长。

除脑脊液、尿液和唾液，其他样本若不能在 24小时内处理，多数可存放在室温；若长期保存，除一些低温敏感细节处，应存放在4℃~8℃条件下。

分离病毒的样本：一般应放在保温容器（0℃~4℃）里，不可放置超过 2 天，尽早送到实验室进行病毒分离。

如无条件立即运送或不能立即分离病毒时，应将样本冻存保存。

若长期储存，最好置-70℃冻存。

检测抗原或抗体的样本：检测抗体的血清可在 4℃条件下保存约 1 周，最长 10 天，超过 1 周必须在-20℃条件下冷冻。

注意避免不必要的反复冻融。

运送过程中若无设备保证血清的冷冻状态，最好不要冷冻血清。

在室温存放血清虽不理想，但仍可用于检测抗体，甚至是存放数周的血清。

不要仅因为没有冷冻设备而将已采集的血清轻易弃去。

保证样品运送温度的方法：为维持4℃~8℃，运送盒中围绕第 2 层容器至少要填充 4个冰袋，可维持冷藏 2~3 天。

为保证-20℃条件，在外包装袋内用 2kg 干冰，但需确保二氧化碳能释放以防爆炸，这样可维持样本冷冻 1~2 天，为保证-70℃条件，可采用液氮来储存和运送。

附件4诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、Real-time RT-PCR检测、传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步骤。

Real-time RT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金标准。

用传统RT-PCR可对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR 产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。

在发生聚集或暴发时，ELISA 方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。

食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。

一、标本前处理1.粪便、呕吐物1.1设备和材料微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5 ml无菌离心管、10 mM pH 值为 7.0 — 7.4 的 PBS。

1.2操作方法（1）离心管每管分装0.5 mlPBS。

用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 g）,稀释成约10%至20% （重量/体积）的粪便悬浮液。

当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用500间的样品。

（2）漩涡振荡每个样品1 min。

在2 400 g下离心5 min,使得固体沉淀。

澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于—70℃。

（3）取澄清的上清液200同进行RNA提取。

2.水通过阴离子滤膜过滤水样品。

用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05 M甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。

使用Microsep 100TM或CentriconTM columns离心管进一步浓缩洗脱液。

2.1设备和材料DEPC水、新配置次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、Millipore HA filter （孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20 ℃、-70 ℃ ）、Microsep 100 K columns （PALL 公司）、Centriprep YM-50 （Millipore 公司）、洗脱液（BE-0.05Gly pH7.0）、PBS 8口7.2）、离心机、氯仿、丁醇。

灭活操作规程灭活操作规程为了确保实验室的安全和实验的准确性，灭活操作在实验室中非常重要。

下面是一份灭活操作规程，可供参考：一、灭活操作的定义和目的灭活操作是指在实验过程中对生物样品、培养物或实验物质进行杀灭处理，以防止生物体或病原体的传播和实验过程中的污染。

灭活操作的目的是保护实验人员的健康和实验室环境的安全，同时确保实验结果的准确性和可靠性。

二、灭活操作的原则和方法1. 灭活操作应根据实验样品和实验物质的特性选择合适的灭活方法，如高温灭活、化学灭活或放射灭活等。

2. 灭活操作应在专用的灭活区域进行，确保实验室内其他区域不受污染。

3. 灭活操作前应了解实验样品或实验物质的特性、病原性和潜在危险，制定相应的灭活方案。

4. 灭活操作前应使用个人防护装备，如实验衣、手套、口罩和护目镜等。

5. 严格遵守实验室内的安全操作规程和政策，确保灭活操作符合法律法规和实验室的要求。

三、高温灭活高温灭活是一种常用的灭活方法，适用于灭活细菌、病毒和真菌等生物样品。

具体操作步骤如下：1. 使用带防护装置的工具将生物样品放置在高温灭活器或高压灭菌器中。

2. 根据实验需要设置合适的温度和时间，一般推荐使用121°C的高温灭活器。

3. 注意安全，避免烫伤和高压爆炸等事故发生。

4. 完成灭活后，将灭活器冷却到安全温度后再取出样品。

四、化学灭活化学灭活是一种利用化学药剂对生物样品进行灭活的方法，适用于有机物或化学敏感的生物样品。

具体操作步骤如下：1. 根据实验需要选择合适的化学灭活剂，如醋酸、乙醛、过氧乙酸等。

2. 在灭活操作区域将生物样品浸泡在适量的化学灭活剂中，确保完全浸润。

3. 根据化学灭活剂的浓度和反应时间控制灭活效果，注意不要超出安全限度。

4. 灭活结束后，将化学灭活剂充分稀释或中和后进行合理处理。

五、放射灭活放射灭活是一种利用辐射对生物样品进行灭活的方法，适用于很小剂量的生物样品。

具体操作步骤如下：1. 确定放射灭活设备和辐射源的种类和能量，确保设备正常工作和辐射源的安全。