用水稻基因芯片筛选小麦耐旱相关基因

农业生物技术学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００７，１５（５）：８２１￣８２７＊基金项目：菲律宾国际水稻研究所ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＣｈａｌｌｅｎｇｅＰｒｏｇｒａｍ（ＧＣＰ）和国家重点基础研究发展规划（９７３）项目（Ｎｏ．２００６ＣＢ１００２０２）资助。

＊＊通讯作者。

教授，主要从事植物分子生物学研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：＜ｇｚｈｌｉｕ＠ｈｅｂａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．＞．收稿日期：２００７－０１－３０接受日期：２００７－０４－０４・研究论文・用水稻基因芯片筛选小麦耐旱相关基因＊许州达１，景瑞莲２，甘强３，曾海攀４，孙学辉２，ＬｅｕｎｇＨｅｉ５，路铁刚２，刘国振１，４＊＊（１．河北农业大学生命科学学院，保定０７１０００；２．中国农业科学院，北京１０００８１；３．中国科学院遗传发育研究所，北京１００１０１；４．中国科学院北京基因组研究所，北京１０１３００；５．国际水稻研究所，菲律宾）摘要：为了解小麦在干旱逆境条件下的基因转录规律，采用ＰＥＧ６０００对耐旱小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）品种旱选１０号进行拟旱处理，分别提取０、１、６和２４ｈ植株的总ＲＮＡ，经反转录荧光标记制备ｃＤＮＡ探针，并将其与含有６万Ｏｌｉｇｏ的水稻全基因组芯片进行杂交，扫描采集数据后并进行结果分析。

在１、６和２４ｈ样品中分别检测到差异表达基因１６６、２０７和３２８个，随着处理时间的延长，差异表达基因数目增加。

对差异基因进行功能分类，能量代谢途径相关基因在１、６和２４ｈ差异表达基因总数中所占比例分别为４．２％、８．２％和１６．８％，其中大部分为光合作用相关基因，并且主要表现为上调，但Ｐｓｂｒ和Ｒｕｂｉｓｃｏ编码基因的转录水平为下调，暗示它们在耐旱反应中发挥着一定作用。

关键词：小麦；耐旱；基因芯片；转录中图分类号：Ｓ１８８文献标识码：Ａ文章编号：１００６－１３０４（２００７）０５－０８２１－０７Ｄｒｏｕｇｈｔ－ｔｏｌｅｒａｎｔＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎｉｎｇｉｎＷｈｅａｔｂｙＵｓｉｎｇＲｉｃｅＭｉｃｒｏａｒｒａｙＸＵＺｈｏｕ－ｄａ１，ＪＩＮＧＲｕｉ－ｌｉａｎ２，ＧＡＮＱｉａｎｇ３，ＺＥＮＧＨａｉ－ｐａｎ４，ＳＵＮＸｕｅ－ｈｕｉ２，ＬｅｕｎｇＨｅｉ５，ＬＵＴｉｅ－ｇａｎｇ２，ＬＩＵＧｕｏ－ｚｈｅｎ１，４＊＊（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ０７１０００，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１，Ｃｈｉｎａ；３．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｅｔｉｃａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０１，Ｃｈｉｎａ；４．ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｏｍｉｃｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０１３００，Ｃｈｉｎａ；５．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＲｉｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｗｈｅａｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｒｏｆｉｌｉｎｇｕｎｄｅｒｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ，ａｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｗｈｅａｔ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）ｖａｒｉｅｔｙＨａｎｘｕａｎ１０ｗａｓｔｒｅａｔｅｄｂｙＰＥＧ６０００ａｎｄｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｔ０，１，６，ａｎｄ２４ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡｗｅｒｅｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｙｅａｎｄｕｓｅｄｔｏｈｙｂｒｉｄｉｚｅｗｉｔｈｔｈｅＢＧＩ－ＲｉｃｅＣｈｉｐ，ａｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｒｉｃｅｇｅｎｅｃｈｉｐｐｌａｔｆｏｒｍ，ｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｓｏｖｅｒ６００００Ｏｌｉｇｏｓｄｅｓｉｇｎｅｄｂａｓｅｄｏｎｒｉｃｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓｄｅｔｅｃｔｅｄ１６６，２０７ａｎｄ３２８ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ（ＤＧｓ）ａｔ１，６ａｎｄ２４ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆＤＧｓｉｎｃｒｅａｓｅｄａｌｏｎｇｗｉｔｈＰＥＧｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ－ａｌｃａｔｅｇｏｒｙａｎａｌｙｓｉｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆＤＧｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｐａｔｈｗａｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｔｏｔｈｅｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｏｆＤＧｓｗｅｒｅ４．２％，８．２％ａｎｄ１６．８％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｏｓｔｏｆｔｈｅｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｗｅｒｅｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ．ＩｔｉｓｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇｔｏｎｏｔｅｔｈａｔＰｓｂｒａｎｄＲｕｂｉｓｃｏ－ｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｓｗｅｒｅｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｉｎｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｗｈｅａｔ；ｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ植物对环境压力的适应机制是以一些特殊基因的激活和调控为基础的，这些基因作用于植物对逆境作出反应的各个过程，如：信号传递、转录调控等（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２００３）。

目前已在拟南芥、水稻等植物中鉴别出一些耐旱相关基因（ＣｈａｖｅｓａｎｄＯｌｉｖｅｉｒａ，２００４）。

近来，随着大规模测序技术的发展以及基因芯片技术体系的建立，对植物逆境胁迫应答的大规模差异表达基因的筛选已成为可能。

本研究试图利用水稻全基因组基因芯片从转录水平检测小麦干旱胁迫下基因表达的变化，为探讨小麦抗旱机理提供依据。

农业生物技术学报２００７年１材料和方法１．１小麦材料与拟旱处理采用小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）品种旱选１０号为实验材料，这是一个耐旱性较强的冬小麦品种（Ｚｈｕａｎｇ，２００３）。

在２０℃培养箱中进行种子萌发以及苗期培养，光照培养条件为１２ｈ／１２ｈ（光照／黑暗），在种子萌发１５ｄ后用ＰＥＧ６０００进行处理，处理时间为０、１、６和２４ｈ。

处理后立即取材，置于－８０℃冰箱，冻存备用。

１．２水稻全基因组基因芯片采用中国科学院北京基因组研究所暨华大基因研究中心研制的水稻芯片ＢＧＩ－ＲｉｃｅＣｈｉｐ，该芯片基于水稻９３１１测序结果并结合水稻全长ｃＤＮＡ及ＥＳＴ数据设计，共含６０７２７条长度为７０ｍｅｒ的Ｏｌｉ－ｇｏ，覆盖了已知和预测的水稻基因，另外包括阳性对照４８０个点，阴性对照２４００个点，一套芯片由Ａ、Ｂ两张芯片组成（Ｍａｅｔａｌ．，２００５）。

１．３ＲＮＡ提取用Ｔｒｉｚｏｌ法提取小麦总ＲＮＡ，具体方法：取冻存的小麦材料在灼烧过的研砵中研磨成粉末，加入到盛有１ｍＬＰｌａｎｔＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）的１．５ｍＬ离心管中，剧烈震荡，１２０００ｒ／ｍｉｎ常温离心５ｍｉｎ，取上清加入０．２体积ＮａＣｌ，０．６体积氯仿，１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心２０ｍｉｎ，上清加入０．９体积异丙醇，室温放置１０ｍｉｎ后离心１５ｍｉｎ，用７５％乙醇洗２次，风干沉淀，溶于５００μＬＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ后用酚、酚－氯仿（１∶１）各抽提１次，加入１ｍＬ无水乙醇，５０μＬＮａＡｃ，－７０℃沉淀３０ｍｉｎ，离心得沉淀，溶于ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ待用。

１．４反转录用微量紫外检测仪ＮａｎｏＤｒｏｐ测定ＲＮＡ样品浓度，取总ＲＮＡ作为合成第１链的模板，反转录引物为Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ），具体反应体系：总ＲＮＡ４５ｎｇ，反转录酶ＭＬＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２μＬ，ＭＬＶＢｕｆｆｅｒ８μＬ，ＤＴＴ４μＬ，３３．３ｍｍｏｌ／ＬｄＡＣＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）０．６μＬ，２５ｍｍｏｌ／ＬｄＴＴＰ０．３２μＬ，４ｍｍｏｌ／Ｌａａ－ｄＵＴＴＰ（Ｓｉｇｍａ）３μＬ，ＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／μＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），总体系４０μＬ。

４２℃反应２￣３ｈ，加入１０μＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤ－ＴＡ，２０μＬ１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ）终止，６８℃１５ｍｉｎ，加入５０μＬＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）调节ｐＨ值为７。

１．５ｃＤＮＡ标记与纯化反转录后的ｃＤＮＡ用氯仿／异戊醇（２４∶１）抽提１次，用Ｍｉｃｒｏｃｏｎ－３０（ＹＭ３０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）纯化，抽干后溶于１０μＬ双蒸水，加入１μＬＮａＨＣＯ３，分别与Ｃｙ３／Ｃｙ５染料偶联２～３ｈ。

反应结束后加入２μＬ２ｍｏｌ／Ｌ乙醇胺（Ｓｉｇｍａ），室温放置１５ｍｉｎ，使用ＹＭ－３０纯化，定容至３５μＬ，备用。

１．６芯片预杂及杂交每张芯片铺６０μＬ预杂交液，５０℃杂交２ｈ后，使用７５％和９５％乙醇各清洗１次，甩干。

标记后的ｃＤＮＡ加入９５μＬ杂交液，９５℃变性３ｍｉｎ，铺于芯片上，４２℃水浴杂交１４～１６ｈ。

每份材料至少进行２次独立的杂交试验，在这２次试验中，采用染料互换标记方式。

１．７芯片清洗杂交后芯片依次使用洗液１（１００ｍＬ双蒸水，１ｍＬ２０×ＳＳＣ，１ｍＬ１０％ＳＤＳ），洗液２（９０ｍＬ双蒸水，１０ｍＬ２０×ＳＳＣ，１ｍＬ１０％ＳＤＳ），洗液３（９０ｍＬ双蒸水，１０ｍＬ２０×ＳＳＣ，）清洗５ｍｉｎ，最后离心甩干。

１．８芯片扫描及数据分析芯片用ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰＥ）扫描，用软件ＧｅｎｅＰｉｘ５．１（Ａｘｏｎ）进行数据采集，后续分析使用软件Ｒ语言编写的软件（ＳｍｙｔｈａｎｄＳｐｅｅｄ，２００３）。

２结果２．１水稻Ｏｌｉｇｏ与小麦ＥＳＴ的比对因目前尚无完整的小麦基因组信息可供利用，但是禾谷类作物的同源性（Ｇｏｆｆ，１９９９）提示，借助水稻芯片有望获得小麦的转录信息。

本研究利用已经建立的水稻全基因组基因芯片分析小麦拟旱过程中的转录谱。

为确定水稻芯片上Ｏｌｉｇｏ是否可以有效反映小麦基因组信息，首先进行了水稻Ｏｌｉｇｏ与小麦ＥＳＴ数据库（ＴＩＧＲ）之间的比对，结果如图１。

可以看出，与小麦ＥＳＴ同源性大于８０％的Ｏｌｉｇｏ共计有１３２５０条，接近Ｏｌｉｇｏ总数的１／４，所以应用水稻芯片进行研究可以得到大量信息，是可行的。

图１．水稻Ｏｌｉｇｏ与小麦ＥＳＴ同源性比对Ｆｉｇ．１．ＳｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｒｉｃｅＯｌｉｇｏｓａｎｄｗｈｅａｔＥＳＴｓ８２２第５期许州达等：用水稻基因芯片筛选小麦耐旱相关基因图２．代表性芯片杂交扫描图Ｆｉｇ．２．ＴｙｐｉｃａｌｍｉｃｒｏａｒｒａｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｐｉｃｔｕｒｅＡ．芯片整体扫描图；Ｂ．一个ｓｕｂａｒｒａｙ的放大图。