野生兰属植物根部内生真菌多样性初步研究

养兰易养根难，教你用“真菌”养兰花，养好“菌根”兰花自然变美你有没有想过一个问题，为什么兰科植物的根又光又白还没有根毛？没有根毛它怎么从土壤里吸收养分？有些兰根长满一盆，但是依然不影响它“吸收”养分继续生长，很多人说：“养兰即养根”，还有人说：“养兰易养根难”。

兰科植物的根与其它开花不开花植物的根到底有什么不同呢？如何才能把兰花的根养好呢？兰科植物是所有开花植物中最多样，分布最广的植物之一，一般我们将兰科植物俗称为兰花。

虽然兰科植物的花朵不像牡丹、月季那样艳丽，但中国人似乎从兰花植物种品除了“另一种美”，兰花已经慢慢的融入了中国的文化，这也是兰花的魅力所在。

今天我们不是要介绍兰花有多美，而是要说一下它的根，很多人对它根的认识可能就是“傻白傻白的”，没有一点“根”的样子，因为兰花的根没有根毛，而是光秃秃的，但这并没有影响它吸收土壤中的水分和营养物质。

这也是兰科植物与其它植物的特别之处，兰花可以与真菌共生，真菌就寄生在它的根上，与其说是兰花的根在吸收营养，不如说是那些共生菌在发挥作用。

下面就来说一下，兰花的根和菌如何共生？以及这种共生菌根如何发挥作用？有什么优点又有什么缺点。

不过在讲兰科植物的菌根之前，需要先说一下兰科植物。

兰科植物（一）兰科植物有哪些？兰科植物的分布遍及世界各地，其中亚洲和南美洲的热带地区物种最为丰富，其中常见的栽培品种有：蕙兰、春兰、寒兰、建兰、墨兰、文心兰、石斛兰、兜兰、蝴蝶兰、万代兰还有嘉德丽亚兰等，这些都是很多花友都养过的品种，另外喜欢养兰花的朋友对野生兰花可能也不陌生，比如常见的野生兰花有：石豆兰、兜兰、春兰、万代兰、贝母兰、独蒜兰、指甲兰、鹤顶兰、石仙桃、虾脊兰等。

私挖野兰违法不过在这里要强调一下，野生兰花属于国家保护植物，私自采挖是违法的，为了保护野生兰花还希望那些痴迷野兰的朋友手下留情。

四种兰花的花（左上顺时针起）：圣字蝴蝶兰、叶蜂眉兰、条叶颚唇兰、同色兜兰（二）兰科植物的特点兰花被认为是植物界的“高等植物”，因为它根据自己的特性演化出对昆虫授粉的高度适应性，比如常见的兜兰花朵形似迷宫，就是为了让昆虫粘上花粉；而我们看到都觉得非常可爱的飞鸭兰很像一直鸭子在飞，蜂兰很像一直鸟在飞，这种外形可以让授粉媒介误以为是交配对象得以传播花粉，最重要的是兰花可以与真菌建立共生关系就更厉害了。

野生蓝莓根际真菌群落特征研究
杨秀丽
【期刊名称】《农业与技术》
【年(卷),期】2022(42)18
【摘要】为了更加全面了解大兴安岭北部地区野生蓝莓的根际真菌多样性状况,对其根际土壤中的真菌进行了调查。

本研究采用454高通量测序技术对野生蓝莓根际土壤中的真菌18S rRNA基因的ITS1可变区进行测序,进而对其根际土壤真菌群落特征进行了分析。

本研究共获得24090条有效序列,282个OUTs,共涉及真菌领域的3个门和4个潜在的菌门和其它未分类菌门,分属于165个属。

本地区野生蓝莓根际真菌以Sordariomycetes属最多,占比0.275;多样性分析表明,根际真菌类群较丰富,且是一个异源的群体。

【总页数】5页(P41-45)
【作者】杨秀丽
【作者单位】呼和浩特职业学院医药卫生系
【正文语种】中文
【中图分类】S-3
【相关文献】
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土壤真菌群落代谢特征及其土壤影响因子研究5.华中五味子根际土壤真菌群落特征研究
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雾灵山保护区野生兰科植物多样性及保护研究
陈彩霞;张东坡;夏秦超;杨野;魏巍;张艳侠;张宝华;王水;崔华蕾
【期刊名称】《现代园艺》
【年(卷),期】2024(47)5
【摘要】通过野外调查、查阅文献资料,对河北雾灵山国家级自然保护区内野生兰科植物的多样性、分布、生境特点进行了调查。

结果表明,区内共有兰科15属22种,占河北总属和总种数的71.43%、78.57%,以陆生型为主(19种,86.32%),有国家Ⅱ级保护兰科6种,濒危3种,易危2种,资源相对丰富,具有极高的保护价值,应进一步加大保护力度;区内兰科植物种类分布较集中的区域为小莲花池、百草洼和大坑,分布集中的海拔为1300~1800m;区内兰科除角盘兰外,其余均在林下有分布,有9种兰科分布在疏林或草地,腐生兰主要分布在华北落叶松林中;本研究对现有的保护情况进行了分析,结合实际提出合理化的建议。

【总页数】3页(P18-20)
【作者】陈彩霞;张东坡;夏秦超;杨野;魏巍;张艳侠;张宝华;王水;崔华蕾
【作者单位】河北雾灵山国家级自然保护区管理中心;河北省林业和草原技术推广总站
【正文语种】中文
【中图分类】Q94
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入侵植物紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum Spreng）叶内生真菌多样性研究外来植物入侵是目前生态学和环境科学研究的热点问题之一,其核心是阐明为何外来植物能在入侵地表现出较强的生存竞争力问题。

关于生物入侵的机制有很多假说,但植物入侵是一个极其复杂的过程,包括了入侵物种的自身特性,新栖息地环境变化的适应以及入侵种与本地种之间错综复杂的竞争关系。

要深入阐明其入侵机理,需要对多个要素进行研究。

近年来,人们发现植物叶内共生真菌对外来植物生存竞争力具有重要影响,但主要的工作集中在禾本科植物,对其他入侵植物的内共生真菌组成情况很少开展研究。

本实验以在中国西南地区广泛入侵的菊科植物紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)为对象,系统研究了其叶内共生真菌的多样性,初步获得了以下几个结论:1、紫茎泽兰叶内共生真菌物种多样性随叶片年龄的增加而增加。

第1至第5对叶真菌物种数呈明显递增趋势,到第6对叶物种数有所降低;2、不同生境的紫茎泽兰叶内生真菌的季节变化并不相同。

在阴蔽的环境,叶内生真菌在冬季有最高物种数;但在向阳的样地,物种数在冬季是最低的;3、不同种类的内生真菌受宿主植物叶化学物质的影响不同。

Didymella的生长受到叶片化学物质的明显刺激作用,且叶片越老,刺激作用越明显。

相反,Alternaria的生长明显受到叶片化学物质抑制;4、内生真菌之间的相互作用关系主要表现为中性或偏抑制作用,很少有协同作用关系。

5、紫茎泽兰叶内生真菌出现频率和多样性随海拔、纬度的增加而减少,但随入侵历史的增加而增加;6、通过MEA小片段培养方法和ONFIT方法,我们从云南、四川不同样地,共分离得到紫茎泽兰叶内生真菌840株。

这些菌株经过RFLP分型并测定代表菌株的ITS rRNA基因,发现紫茎泽兰叶内生真菌的组成丰富多样,涵盖了47个属的真菌。

优势属包括炭疽菌属(Collectotrichum),链格孢菌属(Alternaria),炭角菌属(Xylaria)和间座壳属(Diaporthe)。

福建3种野生兰科植物繁殖生物学的初步研究福建是中国野生兰资源较为丰富的省份之一。

目前,我省兰科植物的研究主要集中在本底资源调查和区系分析上,而有关该科繁殖生物学等领域的深入研究鲜见报道。

因此,本论文以细茎石斛、葱叶兰和镰翅羊耳蒜为对象,开展这3种野生兰繁殖生物学的初步研究,内容包括生境调查、开花物候期观测及其繁殖过程中影响因子的检测分析等,研究结果不仅补充了福建兰科植物繁育系统的基础资料,而且为上述3种野生兰的保育策略提供科学依据。

初步研究结果如下：1、细茎石斛繁殖生物学方面三明尤溪的细茎石斛花期5-6月,5月下旬始花,种群花期20～30 d,单花花期7-16 d,平均为10.85 d。

花开当日,柱头即具可授性,花粉活力为57.88%,2 d内柱头可授性和花粉活力最高,且可持续10 d左右。

因此,在单花花期内,野生细茎石斛均有授粉结实的可能性。

人工授粉实验结果表明,细茎石斛花不存在无融合生殖和自动自花授粉现象,且自交不亲和,但异交的结实率很高,达85%以上。

因此,细茎石斛的结实必须异花授粉。

目前,野外未观察到其有效的传粉者,自然结实率仅1.03%或更低,推测野生状态下细茎石斛花的传粉者不足或缺乏。

野生种子活力为90.84%,显著大于人工异花(76.29%)和异源(76.93%)结实的种子(p<0.05),但人工异花与异源处理间的种子活力差异不显著(p>0.05)。

因此,繁殖种苗最好选野生种子。

以野生种子为材料开展非共生萌发实验,结果表明：细茎石斛种子无菌播种的最适培养基为MS+NAA0.20 mg·L-1,而原球茎增殖分化的适宜培养基是1/2MS+NAA 0.20 mg·L-1,生根培养基,则在1/2 MS 培养基上添加质量浓度为0.20mg.L-1的NAA或0.40 mg.L-1的IBA时效果较好。

2、葱叶兰繁殖生物学方面在垂直水平分布上,葱叶兰属低海拔野生兰,植株呈斑块状聚集分布。

兰科菌根真菌研究方法的概述郑超文;肖娅萍【摘要】兰科植物资源在全球分布广泛，其中有许多是重要的药用植物和名贵的珍稀花卉，由于具有较高的商业价值，受到各界人士的广泛关注。

兰科植物生长习性的特殊性导致其在自然状态下繁殖率极低，因此难以满足市场的广泛需求。

近年研究表明，几乎所有兰科植物都能与相应的菌根真菌建立共生关系，并且必须依赖于这些内生真菌才能完成其整个生活史。

因而对菌根真菌在提高兰科植物生长速度和繁殖能力过程中机制的研究以及将研究成果运用于工业化育苗中将是缓解兰科植物市场供求紧张问题的关键。

通过对近几年有关天麻和铁皮石斛等兰科植物的问题研究中所采用的研究方法加以阐述，以期对今后兰科菌根真菌的研究提供一定的参考。

%Resources of orchid family distribute widely over the globe. Many among them are important officinal and rare flower plants;they have drawn wide attention from all walks of life for their fairly high business values. Orchid plants have very low rate of reproduction in natural conditions because of their growing particularities;they could not meet wide market demand. Recent studies showed that almost plants of orchid family can establish symbiosis with cor-responding mycorrhizalfungi,moreover,they must rely on these endophytic fungi they could complete their whole life history. Therefore study on the mechanism of mycorrhiza in the process to promote the growth rate and fertility of or-chid plants and apply the research achievements to industrialized seedling will be the key to allay strained relationship between the supply and demand of orchid plants. In this paper research methods used in the issuebetween Gastrodia elata and Dendrobium officinalei recently were expounded,so as to provide certain references to the research on orchid mycorrhizal fungi.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】5页(P85-89)【关键词】兰科植物;菌根真菌;共生机制;研究方法【作者】郑超文;肖娅萍【作者单位】陕西师范大学生命科学学院，陕西西安 710062;陕西师范大学生命科学学院，陕西西安 710062【正文语种】中文【中图分类】Q93-31兰科植物作为自然界中的第二大科植物[1]，在世界范围内分布十分广泛，目前据统计约有800属，大约25 000种[2]。

《八种盐生植物根部内生真菌的分离鉴定及抗逆、促生作用研究》篇一一、引言盐生植物，作为一种能在高盐环境中生长的特殊植物，具有极高的生态价值和资源利用潜力。

近年来，随着对盐生植物研究的深入，其根部内生真菌逐渐成为研究的热点。

这些内生真菌不仅对盐生植物的生长和发育具有重要影响，还可能具有抗逆和促生等作用。

因此，本文选取了八种盐生植物，对其根部内生真菌进行了分离鉴定，并对其抗逆和促生作用进行了研究。

二、材料与方法1. 材料本研究所选用的八种盐生植物均采自我国不同盐碱地区。

2. 方法（1）内生真菌的分离与纯化对八种盐生植物的根部进行采样，采用常规的微生物分离方法进行内生真菌的分离与纯化。

（2）内生真菌的鉴定对纯化后的内生真菌进行形态学观察和分子生物学鉴定，确定其种类和特性。

（3）抗逆性研究通过将内生真菌接种到含有不同浓度盐分和不同pH值的培养基上，观察其生长情况，评估其抗逆性。

（4）促生作用研究采用盆栽实验，将内生真菌接种到盐生植物中，观察其对植物生长的影响，评估其促生作用。

三、结果与分析1. 内生真菌的分离与鉴定经过分离与纯化，我们成功获得了八种盐生植物根部的内生真菌。

通过形态学观察和分子生物学鉴定，我们确定了这些内生真菌的种类和特性。

其中，有五种为已知菌种，三种为新菌种。

2. 抗逆性研究我们将内生真菌接种到含有不同浓度盐分和不同pH值的培养基上，观察其生长情况。

结果显示，这些内生真菌具有较强的抗逆性，能够在高盐和极端pH值环境下生长。

其中，某些菌种在高盐环境下的生长情况明显优于其他菌种。

3. 促生作用研究我们采用盆栽实验，将内生真菌接种到盐生植物中。

结果显示，这些内生真菌对盐生植物的生长具有明显的促进作用。

其中，某些菌种能够显著提高植物的生物量和叶绿素含量，增强植物的抗逆能力。

四、讨论本研究成功分离鉴定了八种盐生植物根部的内生真菌，并对其抗逆和促生作用进行了研究。

结果显示，这些内生真菌具有较强的抗逆性和促生作用，对盐生植物的生长和发育具有重要影响。

《三种禾草根部内生真菌分离、鉴定及促生作用初探》篇一一、引言禾本科植物作为全球范围内广泛分布的植物类群，其根部内生真菌的多样性及生态功能一直是生态学和植物生理学研究的热点。

近年来，随着对内生真菌与宿主植物互作机制研究的深入，这些内生真菌的分离、鉴定及其对宿主植物的促生作用逐渐成为研究的新方向。

本文以三种禾草为研究对象，对其根部内生真菌进行分离、鉴定，并初步探讨其促生作用。

二、材料与方法（一）材料本实验选取了三种禾草作为研究对象，分别为：狗牙根、高羊茅和野燕麦。

采集的样品均来自本地区不同生态环境下的健康植株。

（二）方法1. 内生真菌的分离与纯化采用常规的微生物学方法，对三种禾草的根部进行内生真菌的分离与纯化。

通过表面消毒、研磨、稀释涂布等步骤，将内生真菌从根部分离出来，并在培养基上进行纯化。

2. 内生真菌的鉴定对纯化后的内生真菌进行形态学观察、分子生物学鉴定。

通过显微镜观察菌落形态、孢子形态等特征，结合ITS序列分析等分子生物学方法，对内生真菌进行准确鉴定。

3. 促生作用的初步研究通过盆栽实验，研究内生真菌对宿主植物的促生作用。

比较接种内生真菌与未接种的植株在生长状况、生物量、根系发育等方面的差异。

三、结果与分析（一）内生真菌的分离与纯化结果经过分离与纯化，成功获得了三种禾草根部的内生真菌。

其中，狗牙根根部获得的内生真菌数量最多，高羊茅次之，野燕麦最少。

各样品中的内生真菌种类丰富，形态各异。

（二）内生真菌的鉴定结果通过形态学观察和分子生物学鉴定，初步确定了三种禾草根部内生真菌的种类。

其中，狗牙根根部的主要内生真菌为一种属于子囊菌门的真菌；高羊茅和野燕麦根部的内生真菌则属于担子菌门。

这些内生真菌在系统发育上具有一定的多样性。

（三）促生作用的初步研究结果盆栽实验结果显示，接种了内生真菌的植株在生长状况、生物量、根系发育等方面均优于未接种的植株。

其中，狗牙根根部的内生真菌对宿主植物的促生作用最为显著。

这可能与该种内生真菌能够产生植物激素、分解土壤中的营养物质等有关。

兜兰属植物菌根真菌研究进展作者：黎艺璇房林陈红李琳吴坤林曾宋君来源：《热带作物学报》2023年第11期关键词：兜兰；内生真菌；研究进展兜兰属（Paphiopedilum）属于兰科，全球共有109种，主要分布在亚洲热带至太平洋岛屿[1]。

我国约有34种，主要分布在西南和华南地区的云南、贵州、广西、广东和海南等地。

兜兰的唇瓣特化成兜状，颇似拖鞋，故又称为“拖鞋兰”或者“仙履兰”等，其花型奇特，观赏价值极高，是兰科植物中的珍品，具有良好的市场前景。

随着花卉市场对兜兰的需求量不断增加，近十几年人们对野生兜兰持续采集，加上生境破坏，导致野生兜兰数量急剧减少，兜兰属植物均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅰ而被禁止交易[2]，在中国除带叶兜兰和硬叶兜兰为国家二级保护植物外，其他种类均为一级保护植物（2021）。

而兜兰的繁殖难度大，传统繁殖主要依靠分株来进行，繁殖系数低；目前兜兰的组培快繁技术尚未完全成熟，大部分种类与品种均不能利用其进行规模化生产；种子的无菌播种和共生萌发是目前兜兰规模化繁殖的主要手段。

兰科植物种子细小且无胚乳，储藏的养分很少，自然条件下不能自主萌发，只有通过与真菌共生获得养分才能萌发[3]。

真菌还有促进植物生长发育的作用，在兜兰植物整个生活史中，共生真菌均扮演着重要的角色。

对兜兰共生菌的了解，可以应用于种子萌发并促进植株生长发育，有助于解决兜兰人工有性繁殖的难题，并改善根际环境而促进其健康生长，对兜兰的保护和利用均具有重要的意义。

因此，越来越多专家学者开始着手于兜兰内生真菌的研究，但由于兜兰材料珍稀，总体研究报道还较少[2]。

本文从兜兰内生真菌的特点、分离鉴定方法、菌根真菌种类、兜兰与真菌互作方式及应用前景等方面进行综述，对兜兰内生真菌未来的研究方向提出建议，以期为兜兰属植物的就地和迁地保护、种子共生萌发和商品化生产提供参考。

1兜兰菌根的特点在自然界，共生菌广泛存在于动植物中，几乎所有的兰科植物均与真菌共生形成菌根。

热带亚热带植物学报2022, 30(1): 88 ~ 96Journal of Tropical and Subtropical Botany野生兜兰菌根真菌对带叶兜兰生长和生理指标的效应陈宝玲, 杨开太*, 龚建英, 唐庆, 苏莉花, 汪小玉, 龙定建(广西壮族自治区林业科学研究院，南宁530002)摘要：为探究兰科菌根真菌对带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)生长的影响，用4个分离自广西野生兜兰根部的兰科菌根真菌(Cladosporium perangustum、Kirschsteiniothelia tectonae、Phialophora sp.和Cyphellophora sp.)与带叶兜兰试管苗和营养钵苗进行菌-苗共生试验，对其生长和生理指标的变化进行了研究。

结果表明，接菌处理具有明显的促进生长作用和生理效应，Cladosporium perangustum和Phialophora sp.对试管苗的接种效果最佳，鲜质量增量、3种保护酶活性和叶绿素总量均与对照存在显著或极显著差异，鲜质量增加了360%~380%。

Kirschsteiniothelia tectonae、Phialophora sp.对营养钵苗的接种效果最佳，鲜质量增量、叶面积及3种保护酶活性均与对照存在显著或极显著差异，鲜质量增加了261%~330%。

因此，实际生产中可在带叶兜兰不同生长阶段接种适当菌株，Phialophora sp.对带叶兜兰表现出较好的促生效应，可研发为带叶兜兰育苗期通用型有益菌剂。

关键词：带叶兜兰；兰科菌根真菌；生理特性；保护酶doi: 10.11926/jtsb.4411All Rights Reserved.Effects of Wild Paphiopedilum Mycorrhizal Fungi on Growth andPhysiological Indexes of Paphiopedilum hirsutissimum SeedlingsCHEN Baoling, YANG Kaitai*, GONG Jianying, TANG Qing, SU Lihua, WANG Xiaoyu,LONG Dingjian(Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute,Nanning 530002, China)Abstract: To investigate the effects of mycorrhizal fungi on the growth of Paphiopedilum hirsutissimum, fourstrains, such as Cladosporium perangustum, Kirschsteiniothelia tectonae, Phialophora sp. and Cyphellophora sp.,isolated from roots of wild Paphiopedilum, were inoculated to tissue-cultured and potting seedlings of P.hirsutissimum for 120 days, and then the changes in growth and physiological characters were studied. The resultsshowed that the biomass and physiological indexes of tissue-cultured seedlings increase inoculated withCladosporium perangustum and Phialophora sp., the fresh weight, activities of three protective enzymes, andtotal chlorophyll content had significant differences compared with the control. Especially the fresh weight wasmore than control for 360%-380%. Two strains, Kirschsteiniothelia tectonae and Phialophora sp. had the besteffect for the potting seedlings, which the fresh weight, leaf area, and activities of three protective enzymes hadsignificant difference compared with the control, and the fresh weight increased 261%-330% than control.Therefore, appropriate strains could be inoculated to P. hirsutissimum at different growth stages in actualproduction. Phialophora sp., which showed a good promoting effect on P. hirsutissimum, could be developed as a收稿日期: 2021-03-12 接受日期: 2021-06-03基金项目:广西自然科学基金项目(2020GXNSFAA259028); 广西重点研发计划项目(桂科AB18221003)资助This work was supported by the Project for Natural Science in Guangxi (Grant No.2020GXNSFAA259028); and the Project for Key Research & Developmentin Guangxi (Grant No. AB18221003).作者简介: 陈宝玲(1981~ )，高级工程师，硕士，主要从事兰科植物的保育与繁育研究工作。

《八种盐生植物根部内生真菌的分离鉴定及抗逆、促生作用研究》篇一一、引言盐生植物，因其能在高盐碱、干旱等恶劣环境中生存并发展，已成为植物生态学研究的热点。

这些植物不仅在维持荒漠等地的生态平衡中扮演重要角色，而且其独特的生存机制也为我们提供了丰富的生物资源。

近年来，越来越多的研究开始关注盐生植物根部内生真菌的种类及其与宿主植物的相互作用。

本文旨在分离鉴定八种盐生植物根部的内生真菌，并对其抗逆、促生作用进行研究。

二、材料与方法1. 实验材料本实验选取了八种常见的盐生植物，包括碱蓬、盐角草、海蓬子等。

在生长旺盛期采集这些植物的根部样品，进行内生真菌的分离和鉴定。

2. 实验方法（1）内生真菌的分离与纯化：采用常规的微生物分离纯化技术，对盐生植物根部样品进行内生真菌的分离和纯化。

（2）内生真菌的鉴定：通过形态学观察和分子生物学技术（如ITS序列分析）对分离出的内生真菌进行鉴定。

（3）抗逆性研究：通过培养实验，观察内生真菌在不同盐浓度、干旱等逆境条件下的生长情况，以评估其抗逆性。

（4）促生作用研究：采用盆栽实验，观察接种了内生真菌的盐生植物生长情况，包括株高、叶绿素含量等生理指标，以评估其促生作用。

三、结果与分析1. 内生真菌的分离与鉴定经过分离纯化，我们成功获得了八种盐生植物根部的内生真菌。

通过形态学观察和分子生物学技术鉴定，这些内生真菌分别属于不同的属种。

其中，某些属种的内生真菌在之前的研究中鲜有报道，这为我们的研究提供了新的方向。

2. 抗逆性研究在培养实验中，我们发现这些内生真菌在较高盐浓度和干旱条件下仍能保持良好的生长状态。

这表明它们具有一定的抗逆性，可能与其独特的生理生化机制有关。

这些抗逆性强的内生真菌在未来可以用于生物技术的改良和开发。

3. 促生作用研究盆栽实验结果表明，接种了内生真菌的盐生植物在生长过程中表现出更好的生长状态。

具体表现为株高增加、叶绿素含量提高等生理指标的改善。

这表明这些内生真菌具有一定的促生作用，可能通过改善植物的营养状况、提高植物的抗逆性等途径来实现。

在相当长时间内保持沉默(潜伏在植株内),直到宿主植物生理发生变化有利于其生长时,该病原菌便快速引发宿主软腐,引起成熟或衰老组织的严重破坏[21]㊂毛壳菌属真菌多数腐生于植物残体㊁纸张㊁土壤㊁动物粪便和富含纤维质的废旧物品中[22-23],广泛分布于空气㊁土壤等多种自然环境中,也是植物最常见的内生真菌之一[24]㊂毛壳菌对一些植物病原菌有拮抗作用,是良好的生物防治材料[25],而假螺卷毛壳菌的首次提取是从云南文山的三七(Panax notoginseng)根中获得的[26],近些年关于该菌的报道甚少,也未发现其作为致病菌或生防菌来报道㊂拟盘多毛孢菌属(Pestalotiopsis)真菌侵染的寄主种类多㊁范围广,可引起多种经济作物和观赏植物的多类病害,葡萄牙拟盘多毛孢菌(P.portugallica)已被报道导致贵州六盘水山茶灰斑病(Pestalotiopsis portugallica)[27],近些年关于该菌的报道甚少㊂本文通过对云南山茶花腐病病原菌生物学特性的研究,阐明了病菌生长和环境条件的关系,进一步明确了病害的发生规律,为病害的深入研究和防治提供了一定的理论基础㊂本研究中,不同云南山茶品种对不同病原菌的抗性存在差异,按照发病率及病情指数可分为高抗(HR)㊁抗病(R)㊁耐病(T)㊁感病(S)㊁中感(MS)㊁高感(HS)6个等级,在离体回接花瓣的22个品种抗病性评价中,均未得到抗病(R)和耐病(T)品种,集中于高抗(HR)㊁感病(S)㊁中感(MS)和高感(HS)品种㊂ 紫袍 玫红桂叶 云峰 在4个病原菌接种条件下均为高抗(HR)品种,对病原菌具有较强的抗性;而 童子面 在4个病原菌接种条件下为感病(S)㊁中感(MS)和高感(HS)品种,对病原菌的抗性较差㊂花腐病是云南山茶中常见的病害,喷施化学药剂是防治该病害的主要措施,但化学药剂容易造成环境污染,易导致病原菌产生抗药性,且花瓣容易产生药害㊂选育抗病品种是病害防治的有效措施,品种抗性评价是抗病育种的基础工作,为抗病育种提供理论支持[28]㊂参考文献:[1]李孟颖,雷芸.昆明市云南山茶品种资源及其园林应用初探[C].//中国风景园林学会,中国风景园林学会2013年会议论文集(下册).北京:中国建筑工业出版社,2013:356-360.[2]Wang Y,Zhuang H,Shen Y,et al.The 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)㊁Shannon s 多样性指数(I )的平均值分别为84.54%㊁1.8454㊁1.4490㊁0.2655㊁0.4026,整体上有较高的遗传多样性水平㊂(2)19个居群总基因多样性(Ht )为0.3372,居群内基因多样性(Hs )为0.1562,居群间基因多样性大于居群内基因多样性;居群间遗传分化系数(Gst )为0.5369,居群间基因流(Nm )为0.4313<1,表明兜兰属植物各物种间遗传分化明显㊂(3)分子变异分析(AMOVA)判断兜兰属植物遗传变异发现遗传分化有50%存在于种群间,50%存在于种群内;6种兜兰属植物的遗传相似性系数在0.7609~0.8875之间,遗传距离在0.1194~0.2732之间,Mantel 检验表明各居群间Nei s 遗传距离与地理距离无显著相关性,即研究区兜兰属植物遗传多样性无明显的地理趋势㊂(4)UPGMA 法进行亲缘关系聚类分析与形态学分类的结果一致㊂关键词:兜兰属;ISSR;遗传多样性;北盘江流域;贵州中图分类号:S 682.31㊀㊀文献标识码:A㊀㊀文章编号:1672-8246(2023)02-0088-10Genetic Iversity Analysis of Wild Paphiopedilum in Beipan River ,Guizhou ProvinceTIAN Li 1,2,AN Ming-tai 1,2,SHI Jin-zhu 3(1.College of Forestry,Guizhou University,Guiyang Guizhou 550000,P.R.China;2.Biodiversity and Nature Conservation Research Center,Guizhou University,Guiyang Guizhou 550000,P.R.China;3.Longli Forest Farm of Guizhou Province,Qiannan Guizhou 551200,P.R.China)Abstract :The genetic diversity of six Paphiopedilum species in Beipan River of Guizhou Province was analyzed by ISSR -PCR.The results showed that a total of 109clear and bright bands were amplified by 8ISSR primers for 193materials.An average of 83bands were amplified from each species,and the average number of polymorphic bands was 70.The average values of the percentage of detected polymorphism(P ),observed allele(Na ),effective allele(Ne ),Nei s gene diversity index(H )and Shannon s diversity index(I )were 84.54%,1.8454,1.4490,0.2655and 0.4026,respectively.On the whole,it showed a high level of genetic diversity.The total genetic diversity(Ht )of 19populations was 0.3372,and the intra -population genetic diversity(Hs)was 0.1562.The inter -populationgenetic diversity was greater than the intra -population genetic diversity.The genetic differentiation coefficient(Gst )was 0.5369,and the gene flow(Nm )was 0.4313<1,indicating that the genetic differentiation was obvious among different species of P .spp.Molecular variation analysis(AMOVA)showed that 50%of the genetic differentiation of Paphiophil species existed among populations and 50%existed within populations in the Beipan River.The geneticsimilarity coefficient of the six species ranged from 0.7609to 0.8875,and the genetic distance ranged from㊀第52卷㊀2期㊀2023年4月㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀西㊀部㊀林㊀业㊀科㊀学Journal of West China Forestry Science㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Vol.52㊀No.2㊀Apr .2023㊀∗收稿日期:2022-12-02㊀㊀㊀基金项目:国家自然科学基金(31960042)㊂㊀㊀㊀第一作者简介:田力(1996 ),男,硕士研究生,主要从事植物生态学研究㊂E -mail:1484068567@㊀㊀㊀通信作者简介:安明态(1975 ),正高级实验师,博士,硕士生导师,主要从事珍稀濒危植物保护与利用研究㊂E -mail:615936221@0.1194to0.2732.Mantel test showed that there was no significant correlation between Nei's genetic distance and geographical distance among populations,indicating that there was no obvious geographical trend in the genetic di-versity of Paphiopedilum in the study area.The results of phylogenetic cluster analysis by UPGMA method are con-sistent with morphological classification.Key words:Paphiopedilum;ISSR;genetic diversity;Beipan River;Guizhou兰科(Orchidaceae)是高等植物中物种最多的科之一[1],其植物器官高度特化[2-3],形态各异[4],对环境依赖性极强[5]㊂兜兰属(Paphiopedi-lum)是兰科中较原始的濒危类群,由于其较高的观赏价值被过度盗采,该属所有种已被‘濒危野生动植物种国际贸易公约“列为I级珍稀濒危物种㊂世界上已知兜兰属植物有80余种,分布于亚洲的热带及亚热带㊂我国分布的兜兰属植物34种(含变种),贵州分布有其中10种,为我国兜兰属植物生物多样性和进化的热点地区之一[6]㊂贵州北盘江流域分布6种,是贵州省兜兰属植物分布最密集的区域[7]㊂贵州省处于我国西南部,该地区气候湿润,是我国典型的生态环境脆弱区㊂北盘江流域是贵州省境内喀斯特地貌发育最典型㊁形成最强烈的区域,同时该流域的降水丰富,年平均降雨量达1300mm,充足的水热造就了北盘江流域生物多样性[8-11]㊂遗传多样性是生物在长期进化中形成的自然属性[12],遗传多样性决定了物种对环境的适应能力,物种遗传多样性越高或遗传变异越丰富,其环境适应能力越强,而遗传多样性的降低或消失将引起植物适应㊁繁殖㊁对疾病及不良环境的抵抗等能力下降,并导致物种的稳定性和进化潜力降低[13]㊂遗传多样性主要受繁育系统㊁基因突变等内部因素和环境[14-15]㊁气候变化及人为干扰等外部因素的影响[16-17]㊂DNA分子标记技术是鉴别生物遗传多样性的有效手段,极大地促进了对遗传资源的认识[18],尤其是针对濒危植物遗传多样性的研究[19]㊂其中简单序列间重复序列标记(inter-sim-ple sequence repeat,ISSR)分子标记技术具有稳定性㊁多态性和易操作性,是当前植物遗传多样性研究和亲缘关系鉴定的主要手段㊂北盘江流域分布有丰富的兜兰属植物,但目前对其遗传多样性仍未明晰,因此,本研究利用ISSR分子标记技术揭示贵州省北盘江流域野生兜兰属植物遗传多样性,明确其种间㊁种内及居群间的遗传变异水平,为该地区兜兰属植物多样性保护提供科学依据,为其优先保护序列的确定及后期引种驯化奠定理论基础㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料来源北盘江流域已知分布有硬叶兜兰(Paphiopedi-lum micranthum)㊁巨瓣兜兰(P.bellatulum)㊁麻栗坡兜兰(P.malipoense)㊁长瓣兜兰(P.dianthum)㊁带叶兜兰(P.hirsutissimum)㊁小叶兜兰(P.barbigerum)[20]6种兜兰植物㊁㊂依据金燕等[21]的研究以及兜兰属植物实际生长情况,对兜兰属植物居群采用集群取样法,根据海拔㊁生境类型等选择有代表性的居群㊂由于兜兰属植物的特殊性和濒危性,取样时以不影响物种的正常生存繁育为前提,对生长脆弱的居群和植株不采或少采样㊂最终采集到6个种19个居群193个单株样品材料(表1)㊂1.2㊀研究方法1.2.1㊀DNA基因组的提取与检测为提高DNA基因组提取质量,参考邵亚林等[22-23]的研究,先对比改良CTAB法㊁普通植物基因组DNA提取试剂盒㊁多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒3种提取方法的提取质量,采取上述3种方法对巨瓣兜兰进行DNA提取,提取的DNA经纯化后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度㊂1.2.2㊀ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选参考潘英文等[24]㊁陈亚等[25]㊁高丽霞等[25-27]的研究确定兜兰属植物的ISSR-PCR反应体系总体积为20μL,对影响PCR扩增反应的4个因素: Mix混合液㊁ddH2O㊁引物㊁模板DNA进行单因素多水平试验(表2),以确定最佳ISSR扩增反应体系㊂参考植物通用ISSR引物的相关文献可知[28-29],兰科兜兰属等植物遗传多样性研究的引物共48条,从中筛选出扩增产物条带清晰㊁多态性好的引物用于后续所有样品的扩增,由通用生物系统有限公司合成㊂98㊀第2期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀田力等:贵州北盘江流域野生兜兰属植物遗传多样性分析表1㊀北盘江流域兜兰属植物居群基本信息Tab.1㊀Basic information of the population of Paphiopedium in the Beipan River居群编号地点物种海拔/m 样品数/份东经北纬AY 黔西南安龙县硬叶兜兰㊀14174105ʎ32ᶄ11.84ᵡ25ʎ2ᶄ43.73ᵡBY 黔西南望谟县硬叶兜兰㊀110512106ʎ11ᶄ35.17ᵡ25ʎ14ᶄ38.75ᵡCY 安顺市镇宁县硬叶兜兰㊀12648105ʎ50ᶄ12.80ᵡ25ʎ54ᶄ4.60ᵡDY 安顺市紫云县硬叶兜兰㊀13439106ʎ3ᶄ2.15ᵡ25ʎ52ᶄ45.18ᵡEY 安顺市紫云县硬叶兜兰㊀11696106ʎ23ᶄ53.25ᵡ25ʎ39ᶄ48.61ᵡFY 黔西南望谟县硬叶兜兰㊀109914106ʎ28ᶄ3.49ᵡ25ʎ23ᶄ26.33ᵡGJ 黔西南贞丰县巨瓣兜兰㊀90718105ʎ46ᶄ35.24ᵡ25ʎ33ᶄ32.43ᵡHJ 安顺市关岭县巨瓣兜兰㊀90112105ʎ45ᶄ57.67ᵡ25ʎ41ᶄ4.67ᵡIJ 六枝特区㊀㊀巨瓣兜兰㊀7638105ʎ18ᶄ4.69ᵡ26ʎ5ᶄ25.84ᵡJJ 黔西南晴隆县巨瓣兜兰㊀9135105ʎ25ᶄ20.06ᵡ25ʎ51ᶄ53.69ᵡKC 黔西南望谟县长瓣兜兰㊀9256106ʎ9ᶄ52.02ᵡ25ʎ15ᶄ28.95ᵡLC 黔西南望谟县长瓣兜兰㊀8739106ʎ23ᶄ49.22ᵡ25ʎ19ᶄ38.37ᵡMM 黔西南望谟县麻栗坡兜兰92324106ʎ9ᶄ52.02ᵡ25ʎ15ᶄ28.95ᵡNM 黔西南册亨县麻栗坡兜兰61320105ʎ53ᶄ43.04ᵡ25ʎ10ᶄ25.16ᵡOX 黔西南望谟县小叶兜兰㊀85711106ʎ13ᶄ29.00ᵡ25ʎ10ᶄ25.16ᵡPX 黔西南普安县小叶兜兰㊀12385105ʎ0ᶄ5.31ᵡ25ʎ56ᶄ49.48ᵡQD 黔西南望谟县带叶兜兰㊀6655106ʎ15ᶄ26.89ᵡ25ʎ12ᶄ11.08ᵡRD 黔西南望谟县带叶兜兰㊀5967106ʎ23ᶄ49.22ᵡ25ʎ19ᶄ38.37ᵡSD黔西南望谟县带叶兜兰㊀95610106ʎ27ᶄ46.47ᵡ25ʎ20ᶄ7.52ᵡ表2㊀ISSR -PCR 反应体系优化正交试验Tab.2Orthogonal test of ISSR -PCR reaction system optimization序号反应体系/μL Mix 混合液/μL ddH 2O 引物/μL 模板DNA/μL 1207.511.60.30.62207.511.40.30.83207.511.20.3 1.04207.511.40.50.65207.511.20.50.86207.511.00.5 1.07207.510.9 1.00.68207.510.7 1.00.89207.510.5 1.0 1.0102010.09.10.30.6112010.08.90.30.8122010.08.70.3 1.0132010.08.90.50.6142010.08.70.50.8152010.08.50.5 1.0162010.08.4 1.00.6172010.08.2 1.00.8182010.08.0 1.0 1.0192012.5 6.60.30.6202012.5 6.40.30.8212012.5 6.20.3 1.0222012.5 6.40.50.6232012.5 6.20.50.8242012.5 6.00.5 1.0252012.5 5.9 1.00.6262012.5 5.7 1.00.8272012.55.51.01.01.3㊀数据处理及分析对扩增产物进行人工读带,一个引物的结合位点,以250bp DNA ladder 为标准,对重复性好的条带进行统计,谱带清晰的记为1,模糊或无记为0,统计数据形成矩阵后,用POPGENE 软件计算遗传相似系数,分析遗传差异,并运用NTsys 统计软件[30]分析观测等位基因数㊁有效等位基因数㊁基因多样性㊁遗传相似度,利用UPGMA 方法进行聚类分析,构建亲缘关系聚类图㊂2㊀结果与分析2.1㊀ISSR -PCR 反应体系优化及引物筛选提取的DNA 经纯化后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测后发现(图1),条带明亮度最高的是多糖多酚植物基因组DNA 提取试剂盒提取的DNA,条带清晰明亮,DNA 完整性最高;植物基因组DNA 提取试剂盒提取的DNA 条带也较为明亮,但存在轻微的拖尾现象;改良CTAB 法提取的DNA 条带明亮度最低,因此选择多糖多酚植物基因组DNA 提取试剂盒;反应体系最佳20μL 的PCR 总反应体系为10μL 的2ˑEasy PCR SuperMix (dye),引物和模板DNA 各1μL,8μL 的灭菌ddH 2O (图2);实验筛选出了8对扩增产物条带清晰㊁多态性好的引物用于后续所有样品的扩增,分别为UBC824㊁UBC834㊁UBC841㊁UBC850㊁UBC866㊁UBC868㊁UBC873㊁UBC881㊂9西㊀部㊀林㊀业㊀科㊀学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年㊀图1㊀不同方法对兜兰属植物基因组DNA 提取电泳图Fig.1㊀Electrophoretic pattern of genome DNA extraction fromPaphiopedilum by different methods2.2㊀北盘江流域兜兰属植物DNA 多态性分析8条引物对19个兜兰属植物居群193份样品共扩增出109个多态性好且清晰度高的条带,其中多态性条带108条,多态性比率达99.08%(表3)㊂各引物扩增条带数在12~16条之间,平均每条引物扩增条带数为13.63条,每条引物扩增的多态性条带在12~16条之间,平均每条引物扩增多态性条带13.50条,引物UBC873扩增条带数和多态性条带数最多,均为16条,引物UBC866和UBC881扩增条带数最少,为12条,扩增产生的所有条带均在100~2000bp 之间㊂图2㊀兜兰属植物ISSR -PCR 反应体系优化结果电泳图注:泳道序号1~27为正交实验设计中组合序号Fig.2㊀Screening results of ISSR -PCR reaction system of Paphiopedilum species electrophoretic diagram表3㊀用于兜兰属植物ISSR -PCR 扩增的引物及扩增情况Tab.3㊀Primers used for ISSR -PCR amplification ofPaphiopedilum and amplification引物名称(UBC)引物序列(5ᶄң3ᶄ)总条带/条多态性条带/条多态性比率/%824(TC)8G 1414100.00834(AG)8YT 1313100.00841(GA)8YC 1515100.00850(GT)8YC 1313100.00866(CTC)61212100.00868(GAA)6141392.86873(GACA)41616100.00881(GGGTG)31212100.00合计109108-平均13.6313.5099.08注:Y =(C㊁T)2.3㊀兜兰属植物各居群遗传多样性分析POPGENE 软件分析北盘江流域兜兰属植物的遗传参数发现各居群多态性条带(N )的范围为22~77条,平均值为49条;多态性百分比(P )的范围为20.18%~70.64%,平均值为44.71%;观测等位基因数(Na )范围为1.2018~1.7064,平均值为1.4471,有效等位基因数(Ne )范围为1.1316~1.4145,平均值为1.2710;Nei s 基因多样性指数(H )范围为0.0739~0.2417,平均值为0.1561;Shannon s 多样性指数(I )范围为0.1094~0.3625,平均值为0.2330㊂根据观测等位基因数(Na )㊁有效等位基因数(Ne )㊁Nei s 基因多样性指数(H )和Shannon s 多样性指数(I )的平均值1.4471㊁1.2710㊁0.1561和0.2330,可知贵州北盘江流域兜兰属植物遗传多样性较丰富㊂遗传多样性各项参数(表4)显示,望谟县的硬叶兜兰居群(BY)遗传多样性最高,望谟县的带叶兜兰居群(QD)遗传多样性为最低㊂2.4㊀兜兰属各物种遗传多样性分析北盘江流域兜兰属植物的遗传参数显示(表5):每个物种平均扩增出83条带,多态性条带平均值为70条,多态性百分比P 平均值为84.54%,观测等位基因数(Na )平均值为1.8454,有效等位基因数(Ne )平均值为1.4490,Nei s 基因多样性指数(H )平均值为0.2655,Shannon s 多样性指数(I )平均值0.4026,整体上体现出较高的遗传多样性水平㊂其中遗传多样性水平最高的为麻栗坡兜兰,共扩增出89条带,多态性条带为82条,多态性百分比达95.13%,Na =1.9213,Ne =1.4801,H =0.2847,I =0.4323;小叶兜兰的遗传19㊀第2期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀田力等:贵州北盘江流域野生兜兰属植物遗传多样性分析多样性水平最低,共扩增出78条带,多态性条带为60条,多态性百分比为76.92%,Na =1.7692,Ne =1.3905,H =0.2382,I =0.3646㊂6个物种间的遗传多样性水平由高到低依次为麻栗坡兜兰>巨瓣兜兰>硬叶兜兰>长瓣兜兰>带叶兜兰>小叶兜兰㊂表4㊀ISSR 标记的兜兰属植物各居群遗传多样性指数Tab.4㊀Genetic diversity index of each population of Paphiopedilum by ISSR markers居群编号物种居群地点N P /%Na Ne H I AY 硬叶兜兰㊀黔西南安龙县3128.44 1.2844 1.17800.10400.1553BY 硬叶兜兰㊀黔西南望谟县7770.64 1.7064 1.41450.24170.3625CY 硬叶兜兰㊀安顺市镇宁县5954.13 1.5413 1.28550.17060.2607DY 硬叶兜兰㊀安顺市紫云县6458.72 1.5872 1.40350.22610.3311EY 硬叶兜兰㊀安顺市紫云县3633.03 1.3303 1.20840.11990.1782FY 硬叶兜兰㊀黔西南望谟县6761.47 1.6147 1.41370.23210.3411GJ 巨瓣兜兰㊀黔西南贞丰县4944.95 1.4495 1.25590.14840.2231HJ 巨瓣兜兰㊀安顺市关岭县4137.61 1.3761 1.26030.14380.2101IJ 巨瓣兜兰㊀六枝特区㊀㊀3633.03 1.3303 1.22540.12830.1887JJ 巨瓣兜兰㊀黔西南晴隆县4036.70 1.3670 1.25330.14200.2078KC 长瓣兜兰㊀黔西南望谟县4743.12 1.4312 1.27230.15810.2349LC 长瓣兜兰㊀黔西南望谟县3532.11 1.3211 1.18540.10850.1637MM 麻栗坡兜兰黔西南望谟县7568.81 1.6881 1.38090.22460.3397NM 麻栗坡兜兰黔西南册亨县7366.97 1.6697 1.35130.20290.3064OX 小叶兜兰㊀黔西南望谟县3532.11 1.3211 1.18580.10980.1658PX 小叶兜兰㊀黔西南普安县5146.79 1.4679 1.25950.15280.2311QD 带叶兜兰㊀黔西南望谟县2220.18 1.2018 1.13160.07390.1094RD 带叶兜兰㊀黔西南望谟县3330.28 1.3028 1.18770.10820.1613SD 带叶兜兰㊀黔西南望谟县5550.46 1.5046 1.29540.17110.2565Mean4944.711.44711.2710.15610.233注:N 为多态性条带数;P 为多态性百分比;Na 为观测等位基因数;Ne 为有效等位基因数;He 为Nei s 基因多样性;I 为Shannon s 多样性指数㊂下同表5㊀基于ISSR 标记的兜兰属植物各物种遗传多样性指数Tab.5㊀Genetic diversity index of each species of Paphiopedilum based on ISSR markers物种扩增条带数/条多态性条带数/条P /%Na NeHI硬叶兜兰㊀10792.0085.98 1.8598 1.46660.27440.4144巨瓣兜兰㊀7162.0087.32 1.8732 1.50300.28890.4320麻栗坡兜兰8982.0092.13 1.9213 1.48010.28470.4323长瓣兜兰㊀6955.0079.71 1.7971 1.43650.25840.3909小叶兜兰㊀7860.0076.92 1.7692 1.39050.23820.3646带叶兜兰㊀8169.0085.19 1.8519 1.41710.24850.3813平均值㊀㊀8370.0084.541.84541.4490.26550.40262.5㊀遗传分化和分子变异2.5.1㊀兜兰属植物遗传分化分析计算兜兰属植物遗传分化系数发现(表6),北盘江流域野生兜兰属植物6个种19个居群总基因多样性(Ht )为0.3372,居群内基因多样性(Hs )为0.1562,居群间基因多样性大于居群内;居群间遗传分化系数(Gst )为0.5369,居群间基因流(Nm )为0.4313<1,表明兜兰属植物各种间遗传分化明显;宽瓣亚属12个居群的总基因多样性(Ht )为0.3180,居群内基因多样性(Hs )为0.1737,居群间遗传分化系数(Gst )为0.4537,居群间基因流(Nm )为0.6020㊂兜兰亚属7个居群的总基因多样性(Ht )为0.2594,居群内基因多样性(Hs )为0.1261,居群间遗传分化系数(Gst )为0.5141,居群间基因流(Nm )为0.4726;宽瓣亚属居群间遗传分化为45.37%,居群内遗传分化为54.63%,兜兰亚属居群间遗传分化为51.41%,居群内遗传分化为48.59%,可见两个亚属各种间均存在明显的遗传分化㊂29西㊀部㊀林㊀业㊀科㊀学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年㊀表6㊀北盘江流域兜兰属植物遗传分化情况Tab.6㊀Genetic differentiation of Paphiopedilum in Beipan River物种居群数量/个样本数量/份HtHsGstNm硬叶兜兰㊀6530.26740.18580.30501.1393巨瓣兜兰㊀4430.28150.21590.23291.6466麻栗坡兜兰2440.28260.26180.07356.3056宽瓣亚属㊀121400.31800.17370.45370.6020长瓣兜兰㊀2150.24120.21060.12703.4373小叶兜兰㊀2160.22260.18350.17562.3478带叶兜兰㊀3220.23140.15840.31531.0856兜兰亚属㊀7530.25940.12610.51410.4726所有居群㊀191930.33720.15620.53690.4313注:Ht 为居群间基因多样性,Hs 为居群内基因多样性,Gst 为居群间遗传分化系数,Nm 为居群间基因流㊂2.5.2㊀分子变异分析用分子变异分析(AMOVA)判断兜兰属植物居群间㊁居群内的变异方差分布结果与遗传分化系数基本吻合(表7),离差平方(ss)为3846.528,方差(vc)为20.684,根据变异比率可知贵州北盘江流域兜兰属植物的遗传分化有50%存在于种群间,50%存在于种群内㊂表7㊀ISSR 标记的兜兰属植物种群方差分析Tab.7㊀Analysis of variance of the population ofPaphiopedilum by ISSR markers变异来源自由度(df)离差平方(ss)方差(vc)变异比率(%)显著度(p)种群间182058.76410.4150<0.01种群内1741787.76510.27550<0.01合计㊀1923846.52820.6841002.6㊀遗传相似性与遗传距离分析2.6.1㊀种间遗传相似性与遗传距离分析种群间遗传相似性主要用Nei s 遗传相似性系数来测定,Nei s 遗传相似性系数越大,亲缘关系越近㊂分析北盘江流域兜兰属植物的遗传相似性和遗传距离显示(表8),6种兜兰属植物的遗传相似性系数范围在0.7609~0.8875之间,遗传距离取值范围在0.1194~0.2732之间㊂其中巨瓣兜兰与小叶兜兰遗传相似性系数最小(0.7609),遗传距离最大(0.2732),两者间遗传距离最远,遗传差异最大,亲缘关系最远㊂硬叶兜兰与麻栗坡兜兰遗传相似性系数最大(0.8875),遗传距离最小(0.1194),两者间遗传距离最近,遗传相似性最高,遗传差异最小,亲缘关系最近㊂表8㊀北盘江流域兜兰属植物的Nei ’s 遗传相似性系数和遗传距离Tab.8㊀Nei s genetic similarity coefficient and genetic distance of Paphiopedilum in Beipan River物种硬叶兜兰巨瓣兜兰长瓣兜兰麻栗坡兜兰小叶兜兰带叶兜兰硬叶兜兰㊀∗∗∗∗0.83370.82120.88750.80940.8176巨瓣兜兰㊀0.1818∗∗∗∗0.77450.78570.76090.8061长瓣兜兰㊀0.19690.2555∗∗∗∗0.79320.77700.8574麻栗坡兜兰0.11940.24120.2317∗∗∗∗0.80790.8002小叶兜兰㊀0.21150.27320.25240.2134∗∗∗∗0.8628带叶兜兰㊀0.20130.21550.15380.22290.1476∗∗∗∗注:对角线以上为遗传相似性系数;对角线以下为Nei s 遗传距离㊂2.6.2㊀兜兰属植物居群间遗传距离与地理距离分析19个兜兰属植物居群的Nei s 遗传距离与地理距离如表9所示㊂硬叶兜兰6个居群中,紫云县的第一个居群(DY)与安龙县的居群(AY)的地理距离最远(110.513km )且遗传距离最大(0.199),与望谟县的居群(FY)遗传距离最小(0.039);而紫云县第二个居群(EY)与镇宁县的居群(CY)地理距离最近(21.564km)㊂巨瓣兜兰4个居群中,贞丰县居群(GJ)与六枝特区居群(IJ)地理距离最远(75.754km)且遗传距离最远(0.085),与关岭县居群(HJ)地理距离最近(13.956km),六枝特区居群(IJ)与晴隆县居群(JJ)遗传距离最小(0.049);带叶兜兰3个居群均在黔西南望谟县,其中QD 居群与SD 居39㊀第2期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀田力等:贵州北盘江流域野生兜兰属植物遗传多样性分析群地理距离最远(25.368km)且遗传距离最大(0.112),而RD居群与SD居群地理距离最近(6.698km)且遗传距离最小(0.043)㊂整体可看出研究区兜兰属植物同种间,地理距离越远的居群,遗传距离就越远㊂Mantel检验对研究区兜兰属19个居群的Nei s遗传距离与地理距离分析,结果显示各居群间Nei s遗传距离与地理距离无显著相关性(r=0.239,P=0.982),即研究区兜兰属植物遗传多样性无明显的地理趋势㊂2.7㊀聚类分析基于Nei s遗传相似性系数和UPGMA非加权算术平均法构建19个兜兰属植物居群的树状聚类图(图3)㊂遗传相似系数为0.762时,19个居群聚为两类,第一类为宽瓣亚属,第二类为兜兰亚属㊂遗传相似系数为0.788时,19个居群聚为4个亚类,其中宽瓣亚属类分为小萼组和同色组,兜兰亚属类分为多花长瓣组和兜兰组㊂当遗传相似系数为0.822时,19个居群聚为6类,遗传相似系数为0.852时,硬叶兜兰的6个居群中,安龙县居群单独成一类,再与其余5个居群聚为一类,表明该居群与其他居群之间的亲缘关系较远;第二类为麻栗坡兜兰的2个居群;第三类为巨瓣兜兰,其4个居群中,贞丰县居群与关岭县居群亲缘关系较近,六枝特区居群与晴隆居群亲缘关系较近;第四类为长瓣兜兰的2个居群;第五类为小叶兜兰的2个居群;第六类为带叶兜兰,其3个居群均在望谟县,其中两个居群先聚为一类,再与剩余的居群聚集,可见3个居群中,RD居群与SD居群亲缘关系较近㊂图3㊀基于Nei s遗传距离的19个兜兰属植物居群的UPGMA聚类分析注:AY㊁BY㊁CY㊁DY㊁EY㊁FY为硬叶兜兰居群;GJ㊁HJ㊁IJ㊁JJ为巨瓣兜兰居群;KC㊁LC为长瓣兜兰居群;MM㊁NM为麻栗坡兜兰;OX㊁PX小叶兜兰;QD㊁RD㊁SD为带叶兜兰居群Fig.3㊀UPGMA clustering analysis of19Paphiopedilum populations based on Nei s genetic distance表9㊀北盘江流域19个兜兰属植物居群的地理距离和Nei s遗传距离Tab.9㊀Geographical distances and Nei s genetic distances of19Paphiopedilum populations in Beipan River居群编号AY BY CY DY EY FY GJ HJ IJ JJ AY∗∗∗∗69.78099.501105.851110.513101.34761.80574.476118.16191.503 BY0.159∗∗∗∗81.13271.80350.83532.06754.55265.022129.674103.613 CY0.1130.104∗∗∗∗21.56462.17284.94038.40025.03257.59741.767 DY0.1710.0520.093∗∗∗∗42.27768.44744.89935.77978.62463.024 EY0.1990.1060.1230.082∗∗∗∗31.02563.53363.528119.714100.448 FY0.1540.0750.1040.0390.063∗∗∗∗71.99177.701140.419117.441 GJ0.3880.2870.2990.2720.3170.232∗∗∗∗13.95675.75449.125 HJ0.3630.2520.2820.2320.2760.2280.050∗∗∗∗64.75039.863 IJ0.3710.2460.2730.2330.3200.2270.0850.052∗∗∗∗27.775 JJ0.3510.2410.2610.2350.2690.2190.0640.0520.049∗∗∗∗KC0.3380.2680.2470.2380.2650.2060.2960.2720.2800.297 LC0.3990.3170.3110.2720.2780.2450.3300.2980.3210.333 MM0.2590.1930.1810.1450.1950.1340.2930.2850.2850.275 NM0.2780.2040.1930.1640.2350.1620.3060.3130.2660.282 OX0.3340.2840.3170.2630.3090.2590.3280.2940.3050.323 PX0.3200.3080.3070.2800.3030.2520.3290.3100.3040.327 QD0.4860.3390.4250.3150.3530.2780.3620.3700.3780.371 RD0.4220.2810.3670.2720.3220.2600.2840.2760.2850.323 SD0.3590.2670.2990.2500.3100.2310.2270.2230.2240.276 49西㊀部㊀林㊀业㊀科㊀学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年㊀续表9居群编号KC LC MM NM OX PX QD RD SD AY67.56392.20667.56338.87670.867113.45974.79292.20698.770 BY 3.27522.518 3.27531.0238.429142.8517.92122.51829.005 CY78.49784.91578.49780.82089.54383.88288.15084.91588.805 DY69.75970.35569.75979.70780.099105.42577.73770.35573.115 EY50.69837.24250.69874.20257.002143.59652.93337.24236.924 FY33.8889.98933.88862.47834.306159.63929.6669.989 6.136 GJ51.35067.51251.35044.33462.12588.87362.44967.51273.379 HJ61.96774.79361.96758.08173.04282.02272.74174.79380.054 IJ126.570138.748126.570117.804137.56333.972137.445138.748143.523 JJ100.433114.645100.43390.151111.25043.148111.484114.645119.909 KC∗∗∗∗24.6550.35328.70011.149139.59011.18024.65531.267 LC0.034∗∗∗∗24.65553.35424.316156.10919.676 1.352 6.698 MM0.2480.273∗∗∗∗28.70011.149139.59011.18024.65531.267 NM0.2550.2760.038∗∗∗∗33.223124.15636.66653.35459.947 OX0.3010.3170.2760.272∗∗∗∗149.876 4.64024.31629.956 PX0.2690.2860.2440.2160.055∗∗∗∗150.769156.109161.699 QD0.2180.2390.2800.2750.2570.195∗∗∗∗19.67625.368 RD0.2090.2170.2900.2770.2130.1660.104∗∗∗∗ 6.698 SD0.1570.2030.2680.2600.1870.1660.1120.043∗∗∗∗注:对角线以上为地理距离;对角线以下为Nei s遗传距离㊂3㊀讨论与结论研究物种遗传多样性是揭示其生存能力㊁适应性㊁种群进化方向和发展潜力的主要途径[30]㊂本研究发现北盘江兜兰属植物在长期遗传进化过程中,基因组DNA发生丰富的变异,各物种间Nei s 基因多样性整体较高,且整体遗传稳定性较好[31]㊂植物居群间遗传分化(Gst=0.5369>0.25)程度较高,而基因流(Nm=0.4313<1)水平偏低,遗传漂变可能影响其居群遗传结构㊂由于北盘江流域严酷的生境,环境压力也可能是导致的原因[32]㊂孙彩云等[33]对中国兜兰属种间亲缘关系研究显示, RAPD标记和同工酶2种手段对种间亲缘关系的划分与传统分类大致吻合,朱亚艳等[34]使用SRAP 标记手段对贵州南部兜兰属植物遗传多样性也揭示聚类结果与传统形态学分类的结果一致㊂本研究对北盘江流域兜兰属植物种间亲缘关系表明北盘江流域6种兜兰属植物的19个居群划分成兜兰亚属和宽瓣亚属2个亚属,形成明显的遗传聚类,与刘仲健[35]形态学分类的结果完全一致;黄家林等[36]对硬叶兜兰的遗传多样性研究揭示地理距离是引起居群遗传分化的自然因素㊂而本研究表明研究区兜兰属植物遗传多样性无明显的地理趋势,但在同一物种中,地理距离最远的居群间Nei s遗传距离越远,李菁等[37]对西藏杓兰(Cypripedium tibeticum)遗传多样性研究结果也证实其种群间遗传距离与地理隔离不具有显著相关性㊂兜兰属植物在我国常生长于喀斯特严酷脆弱的生态系统中,一旦种群遭受破坏,将面临灭绝风险㊂北盘江流域地区是喀斯特发育典型区域,导致兜兰属植物生境十分脆弱㊂不过本研究发现北盘江流域的兜兰属植物具有较丰富的遗传多样性,可推测当前该流域兜兰属植物种群还未出现因环境退化导致遗传多样性衰退现象㊂但需注意是,兜兰属植物由于其生长特性使其在喀斯特环境中呈斑块状狭窄聚集分布,加之颇具观赏价值易被盗采,因此,对北盘江流域兜兰属植物的保护工作迫在眉睫㊂基于本研究结果与兜兰属植物生存现状,建议从以下两方面开展保护:一方面,结合兜兰属植物在北盘江流域的资源现状,及时开展就地保护,开展珍稀濒危植物资源宣传,提升全民保护意识;另一方面,充分利用北盘江流域兜兰属植物遗传多样性高的特点进行资源扩繁,依靠现代生物技术进行人工培育,合理开发利用以此满足社会对兜兰属花卉的需求,从而减少兜兰属植物野生资源的生存压力㊂59㊀第2期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀田力等:贵州北盘江流域野生兜兰属植物遗传多样性分析。

紫茎泽兰内生真菌多样性及其在周围环境分布的动态研究近年来生物入侵在全球范围广泛发生,已成为热门研究问题之一。

在中国,紫茎泽兰(Ageratina adenohora)入侵西南地区,不仅严重威胁当地生态平衡,更是造成了经济上的巨大损失。

“积累当地病原微生物假说”(Accumulation of local pathogens)认为,入侵植物可以富集当地植物的病原菌从而获得竞争优势。

一方面,我们猜测富集在紫茎泽兰叶内生的部分真菌是本地植物病原菌,可由紫茎泽兰的叶片释放,通过孢子的形式向周围环境扩散,进而感染本地植物;另一方面,当紫茎泽兰的叶片衰老、凋落,进而通过土壤、水流传播感染本地植物。

基于上述背景,本实验利用传统分离培养技术和高通量测序技术,调查云南省境内六个地区紫茎泽兰根、茎、叶的内生真菌及其周围空气和土壤环境中的真菌组成,培养法共分离获取真菌4439株,通过形态菌落归类后,对1177个代表菌株的ITS片段进行测序,将ITS相似度为97%的序列定义为一个OUT,共计获得200个OTUs,高通量测序共计获得4216个OTUs。

试图探明紫茎泽兰内生真菌在周围环境中的动态分布情况。

实验得到以下几个主要结论:1、紫茎泽兰内生真菌在不同组织部位的分布有明显差异。

紫茎泽兰的根、茎、叶各部位优势内生真菌有所差别。

叶片中的优势内生真菌主要是炭疽菌属(Colletotrihum),分离比例达到55.09%;茎中的优势内生真菌主要是隔孢壳菌属(Didymella),分离比例达到31.85%;根部的优势内生真菌是镰刀菌属(Fusarium),分离比例达到37.50%。

紫茎泽兰根、茎、叶中均有间坐壳属(Diaporthe)的分布。

2、紫茎泽兰地上部分的内生真菌主要经空气传播,地下部分内生真菌主要经土壤传播。

实验通过韦恩图、主成分和代表种属单倍型分析对紫茎泽兰内生真菌和其周围环境中真菌的同源性进行比较发现,空气与紫茎泽兰内生真菌的重叠率叶&gt;茎&gt;根;紫茎泽兰内生真菌与无紫茎泽兰入侵地区的空气真菌组成的物种交叉低于与有紫茎泽兰入侵地区的空气;紫茎泽兰叶和茎的优势种属炭疽菌属(Colletotrichum)、间坐壳属(Diaporthe)、隔孢壳菌属(Didymella)、链格孢菌属(Alternaria)在空气中的数量分布均高于土壤环境。