发酵工程第四章发酵工业的无菌技术

丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶， 发酵液粘度增加，过滤困难 预处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮凝 剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶 媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生 乳化
➢染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白 和其它杂质。 ➢采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化， 很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 ➢采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、 庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面 ，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的 交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时 与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死 物料或设备中所有有生命物质的过程。
消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死 空气、地表以及容器和器具表面的微生物。
除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或 液体中的微生物及其孢子。
防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或 抑制微生物的生长和繁殖 。
C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌
D. 疫苗生产:危害很大,现在疫苗多采用深 层培养，这是一类不加提纯而直接使用的 产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂 菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全 部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂 菌后的损失也越大。
污染其它杂菌 ➢有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫， 即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵 过程的通气搅拌。 ➢有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH 下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢 杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次 染菌后会反复染菌。
➢链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成 不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养，干扰 生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。 ➢灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑 制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
（2）不同发酵时期染菌对发酵的影响
1）种子培养期染菌 ➢ 由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势
，而且培养基营养丰富，容易污染杂菌。种子 染菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌， 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
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2）发酵前期染菌
➢发酵前期最易染菌。
➢原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势 ；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌 能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。
2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后 发酵液某些理化性质的改变，使产物的提取 变得困难，造成得率降低或使产品质量下降；
3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；
4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH ，从而使生物化学反应发生异常变化；
5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生 产失败等。
（3）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响 ➢染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶， 所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导 致过滤困难。
➢污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如 污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过 滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵 液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平 衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低 过滤收率，直接影响提取总收率。
➢措施 如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可 以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。
3）发酵中期染菌
➢ 发酵中期染菌，处理困难，危害很大。
➢发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量 产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘 ，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已 产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量 泡沫。
实例
加压蒸气灭 70%酒精消 冷藏、干燥、抗生素、磺
菌，辐射灭 毒、巴氏消 糖渍、盐腌、胺药、生物
菌、化学杀 毒法
缺氧、化学 药物素
菌剂
防腐剂
什么是染菌？
➢ 发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌 生长繁殖。
4.2.1 杂菌污染的危害
1）由于杂菌污染，使发酵培养基因杂菌的消耗 而损失，造成产率的下降；
➢措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况 。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗 生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌 罐，抑制杂菌。
4）发酵后期染菌
➢发酵后期发酵液内已积累大量的产物， 特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀 灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响 不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可 以提前放罐。
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
控制有害微生物主要有以下几种措施：
杀灭一切微生物
杀灭病原微生物
比较项目 处理因素
处理对象
灭菌
消毒
防腐
化疗
强、理化因 素
任何物体内 外
理、化因素
生物体表， 酒、乳等
理、化因素
有机物体内 外
化学治疗剂 宿主体内
微生物类型 一切微生物 有关病原菌 一切微生物 有关病原菌
对微生物作 彻底杀灭 用
杀死或抑制 抑制或杀死 抑制或杀死
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不
太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基
丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重 抑制菌生长和合成代谢产物。
B. 霉菌 PenG：绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，
而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。 不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉 素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。 青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无 所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。