具有双活性序列的新型抗菌肽的设计及性质

计算机与现代化2013年第2期JISUANJI YU XIANDAIHUA总第210期文章编号：1006-2475（2013）02-0138-05收稿日期：2012-10-17基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20110008110002）；国家自然科学基金资助项目（31272476）作者简介：杨丽敏（1989-），女，河南新乡人，中国农业大学信息与电气工程学院硕士研究生，研究方向：计算机应用；黄燕（1964-），副教授，硕士生导师，研究方向：生物信息技术，网络技术，数据统计分析；张日俊（1962-），中国农业大学饲料生物技术实验室，动物营养学国家重点实验室教授，博士生导师，研究方向：饲料生物技术，动物微生态，分子营养。

新抗菌肽设计及活性与功能预测杨丽敏1，黄燕1，张日俊2(1．中国农业大学信息与电气工程学院，北京100083;2．中国农业大学饲料生物技术实验室，动物营养学国家重点实验室，北京100083)摘要：通过对影响抗菌肽活性因子的分析，确定可量化的因子参数，并对已有抗菌肽的活性因子数据进行统计分析，得到参数取值范围。

采用Java 技术，对已有抗菌肽序列进行剪切拼接，得到新肽。

根据参数取值范围判断新肽，是否有活性，并进行功能预测，同时对抗菌肽构建三维空间结构图。

分析证明，亲水端正电荷量是四类抗菌肽具有抗菌活性的重要共性;疏水氨基酸残基百分比和α-螺旋百分比两因子对区分四类抗菌肽功能效果显著。

关键词：α-螺旋;活性因子;活性预测;功能预测;抗菌肽;3D 结构中图分类号：TP319文献标识码：Adoi :10．3969/j．issn．1006-2475．2013．02．034Design of New Antimicrobial Peptides and Prediction of Its Activity and FunctionYANG Li-min 1，HUANG Yan 1，ZHANG Ri-jun 2（1．College of Information and Electrical Engineering ，China Agricultural University ，Beijing 100083，China ；2．Laboratory of Feed Biotechnology ，State Key Lab．of Animal Nutrition ，China Agricultural University ，Beijing 100083，China ）Abstract ：This paper determines the parameters of quantization factor through analyzing the impact of antimicrobial peptide activi-ty factor．Then ，it analyzes activity factor data of existing antimicrobial peptide ，and obtains range of parameters．To get new pep-tide ，it shears and links existing antimicrobial peptides ’sequence by using Java technology．At last ，according to the parameterrange it predicts activity and function of new peptide．At the same time ，it builds the three-dimensional structure of antimicrobial peptide．The results show that net charge of four antimicrobial peptides is identical ；however ，it is essential to antibacterial activi-ty．Hydrophobic residue%and α-helix%have significant effect on distinguishing four types of antimicrobial peptides．Key words ：α-helix ；activity factors ；activity prediction ；function prediction ；antimicrobial peptides ；three-dimensional structure0引言抗菌肽是生物先天免疫系统的重要组成，不仅对细菌有高效广谱的抗性，而且对真菌、病毒、寄生虫和癌症也有一定的杀伤作用［1］，有着广阔的发展前景。

新型抗菌肽的设计与合成1. 引言抗生素的广泛应用已经引发了耐药菌株的迅速出现和传播，这对全球公共卫生安全构成了严重威胁。

寻找新的抗菌剂来对抗耐药菌株变得至关重要。

新型抗菌肽由于其广谱抗菌活性和较小的抗菌靶标，成为了研究热点。

本报告将通过现状分析、问题存在和对策建议，探讨新型抗菌肽的设计和合成。

2. 现状分析2.1 抗菌肽的定义和分类抗菌肽是一类天然存在于生物体内的小分子蛋白质，具有杀菌或抑菌作用。

根据其基本结构和来源，抗菌肽可以分为防御素类、微生物产物类和人工合成类。

防御素类包括非特异免疫相关的抗菌肽，如胸腺素、抗菌肽LL-37等；微生物产物类是通过微生物自身合成和分泌出来的抗菌肽，如红霉素；人工合成类是通过人工合成方式获得的抗菌肽，如抗菌肽D2A21。

2.2 设计抗菌肽的策略设计新型抗菌肽的策略主要有以下几种：2.2.1 人工合成通过人工合成抗菌肽，可以得到结构简单、抗菌活性较强的分子。

这种策略可以改变抗菌肽的氨基酸组成，以增强其疏水性和亲合性，提高其抗菌活性。

2.2.2 调整自然抗菌肽的序列通过改变自然抗菌肽的氨基酸序列，可以调整其抗菌性能。

这个方法可以在一定程度上提高抗菌肽的稳定性和生物活性。

2.2.3 杂化设计将不同抗菌肽序列结合在一起，形成新的抗菌肽，可以产生更广谱的抗菌活性。

杂化设计可以结合两种抗菌肽的优势，使新抗菌肽具有更好的抗菌效果。

2.3 抗菌肽的合成方法目前，合成抗菌肽的方法主要有化学合成法、生化合成法和生物合成法。

化学合成法是一种较为常用的方法，可以通过固相合成和液相合成得到目标抗菌肽。

生化合成法是利用微生物内切酶体系将抗菌肽的前体蛋白切割生成目标抗菌肽。

生物合成法则是通过转基因技术在大肠杆菌中表达目标抗菌肽。

3. 存在问题3.1 抗菌肽的稳定性抗菌肽在体内外稳定性较差，容易受到蛋白酶和其他环境因素的降解。

这限制了其应用范围和实际应用效果。

3.2 抗菌肽的毒性一些抗菌肽在高浓度下可能会对宿主细胞造成毒性作用，从而导致治疗无法进行或产生不良反应。

新型抗菌肽的设计与研究——生物活性及与磷脂膜相互作用的开题报告一、研究背景随着人类历史上对疾病的不断探索和治疗的不断进步，传统抗生素在临床应用中已相对成熟，但随之而来的是细菌抗药性问题的日益突出。

传统抗生素几乎都是针对细菌细胞壁、蛋白质合成、核酸合成或界面活性剂等细菌特定的靶点进行作用，因此，细菌抗药性在遗传和表型上的多种途径为其逃过抗生素的杀伤追击提供了可乘之机。

反之，抗菌肽（Antimicrobial Peptides，AMPs）是存在于自然生物体各种组织、器官、细胞中的能够杀灭多种病原细菌、真菌、病毒等的广谱抗菌药物。

AMPs的抗菌靶点与传统抗生素不同，尤其是它们具有对膜的破坏作用。

因此，开发抗菌肽可能为人类战胜细菌抗药性带来突破性变革。

抗菌肽具有多种生物活性，例如抗病毒、抗真菌、抗癌、抗炎性等。

尽管无疑受到人们的高度关注，抗菌肽的使用作为新的治疗手段受到了很多挑战。

在制作抗菌肽中，很常见的问题是抗菌肽的生物活性受到很大损害，这与其结构有关。

为了解决这些问题，抗菌肽的结构应被合理设计。

抗菌肽的结构和功能在 21 世纪获得了广泛的研究，且在近几年中获得了高度的关注。

二、研究目的本研究旨在设计新型抗菌肽，并探索其在与磷脂膜相互作用过程中的生物活性。

具体地，在本研究中，将利用计算机辅助预测和设计方法，设计一些新型的抗菌肽，并从中筛选出一些生物活性较强、具有潜在临床应用前景的分子。

同时，通过合成和表征新抗菌肽的形态、构象和生物活性，分析其与磷脂膜相互作用的规律，探究抗菌肽对细胞膜的破坏机理，为设计更加理想的抗菌药物提供理论指导。

三、研究内容本研究拟从以下几个方面进行：1、抗菌肽的设计：根据已有的研究成果和分子动力学模拟结果，选择合适的氨基酸序列、总的长度以及特定的二级结构形态等，设计新型的抗菌肽。

2、抗菌肽的合成和纯化：采用合理的合成方法，合成设计好的抗菌肽，并通过HPLC等各种方法进行纯化。

3、抗菌肽的表征：利用实验手段对新抗菌肽的性质进行表征，包括质谱、UV 光谱、荧光等，以确定样品的纯度、分子量等参数。

小分子抗菌肽的设计、合成、与生物活性研究全球每年的细菌感染病患高达15亿人,其中死亡人数460万,特别是多药耐药菌(MDRB)感染导致的高死亡率,严重威胁公众健康;欧洲与美国每年因细菌感染防治的支出高达70亿欧元和65亿美元,而发展中国家则需为此承担更为高昂的代价。

抗菌肽(AMP)是生物体为抵御外源性病原菌入侵而产生的一类多肽物质,也是自然免疫的重要组成部分,具有阳离子性和两亲性的基本结构特征。

AMP与传统抗生素相比,具有抗菌谱广、杀菌快速、耐药性低等传统抗生素无法比拟的系列优点,有望开发成为一类高效、低毒的新型抗菌药物。

本文以现有小分子抗菌活性多肽为基础,使用计算机辅助药物设计方法建立定量预测模型,确定AMP的优势位点与优势氨基酸;以牛乳铁蛋白片断LfcinB64-9(RRWQWR)为模板,结合抗菌肽的结构特征与定量预测模型研究结果,设计并筛选获得3条抗菌活性较高、溶血活性低、细胞毒性小、稳定性好的小分子抗菌肽。

本研究主要开展了如下工作:1、从多肽数据库(APD2)和文献中收集抗菌多肽序列,基于氨基酸保守序列分析与构效关系研究,确定AMP序列模式、优势位点及优势氨基酸,以LfcinB64-9为模板,结合AMP序列特征,虚拟组合设计小分子AMP;2、利用定量预测模型筛选获得14条候选小分子抗菌肽,使用固相合成方法合成抗菌肽及其模板,所有抗菌肽纯度达到95%以上,并由质谱鉴定结构;3、对小分子抗菌肽进行系列生物活性实验验证,主要包括抑菌试验、红细胞溶血毒性试验、细胞毒性实验、血浆中稳定性试验、脂质膜溶解实验,确定AMP的抗菌效果以及毒性效应,为下一步成药研究奠定基础。

本研究所取得的主要成果如下:1、建立了小分子抗菌肽组合设计、虚拟筛选、定量预测、活性验证的完整技术方案,为小分子AMP的设计与改造奠定了基础。

2、本研究筛选获得了3条(RWRWRW、RRWWRF、RRWWRW)抗菌活性高、毒副作用小、稳定性好的小分子抗菌肽,其中RRWWRW的对鲍曼不动杆菌具有良好抑菌效果,其最小抑菌浓度为16μg/ml,而且在512μg/ml时的细胞毒性与红细胞溶解活性低于5%。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910342748.2(22)申请日 2019.04.26(71)申请人 常州大学地址 213164 江苏省常州市武进区滆湖路1号(72)发明人 王建浩　雷晓玲　周舒文　崔朋飞　邱琳　柳丽　刘晓骞　贾文静　(74)专利代理机构 常州市英诺创信专利代理事务所(普通合伙) 32258代理人 谢新萍(51)Int.Cl.C07K 14/00(2006.01)C07K 1/20(2006.01)C07K 1/13(2006.01)C07K 1/06(2006.01)C07K 1/04(2006.01)A61P 31/04(2006.01)(54)发明名称一种Ce6标记的双链抗菌肽及其合成方法和应用(57)摘要本发明属于生物医药领域，具体涉及一种Ce6标记的双链抗菌肽及其合成方法和应用，该抗菌肽为双链多肽，其氨基酸序列为：本发明还通过引入光敏剂Ce6进行光动力抗菌化学疗法(PACT)抗菌，利用它在激光的照射下产生活性氧(ROS)导致微生物分子氧化并导致细胞损伤和死亡，与抗菌肽(AMP)产生协同作用。

本发明还公开了此抗菌肽的合成方法及其在治疗金黄色葡萄球菌感染的药物开发或抗菌剂中的应用。

采用固相化学法合成，与传统单链抗菌肽相比具有序列短、结构稳定、抗菌活性强、合成方便的优点。

权利要求书1页 说明书4页 附图4页CN 110028557 A 2019.07.19C N 110028557A1.一种Ce6标记的双链抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为：2.一种如权利要求1所述的双链抗菌肽的合成方法，其特征在于，所述合成方法步骤如下：(1)采用固相合成法合成双链抗菌肽；(2)采用Ce6标记抗菌肽(AMP -Ce6)。

3.如权利要求2所述的双链抗菌肽的合成方法，其特征在于，所述双链抗菌肽的合成方法为：采用常规的固相Fmoc法，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸链接到树脂上，使肽链从C末端向N末端延伸，在合成第五个氨基酸时，采用氨基酸(Fmoc -Lys(Fmoc)-OH)，并用溶于DMF 的20％哌啶切割此保护基团，切掉两个Fmoc后，后面接的氨基酸形成双链，反复循环添加单体氨基酸，直到合成完成。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910342748.2(22)申请日 2019.04.26(71)申请人 常州大学地址 213164 江苏省常州市武进区滆湖路1号(72)发明人 王建浩　雷晓玲　周舒文　崔朋飞　邱琳　柳丽　刘晓骞　贾文静　(74)专利代理机构 常州市英诺创信专利代理事务所(普通合伙) 32258代理人 谢新萍(51)Int.Cl.C07K 14/00(2006.01)C07K 1/20(2006.01)C07K 1/13(2006.01)C07K 1/06(2006.01)C07K 1/04(2006.01)A61P 31/04(2006.01)(54)发明名称一种Ce6标记的双链抗菌肽及其合成方法和应用(57)摘要本发明属于生物医药领域，具体涉及一种Ce6标记的双链抗菌肽及其合成方法和应用，该抗菌肽为双链多肽，其氨基酸序列为：本发明还通过引入光敏剂Ce6进行光动力抗菌化学疗法(PACT)抗菌，利用它在激光的照射下产生活性氧(ROS)导致微生物分子氧化并导致细胞损伤和死亡，与抗菌肽(AMP)产生协同作用。

本发明还公开了此抗菌肽的合成方法及其在治疗金黄色葡萄球菌感染的药物开发或抗菌剂中的应用。

采用固相化学法合成，与传统单链抗菌肽相比具有序列短、结构稳定、抗菌活性强、合成方便的优点。

权利要求书1页 说明书4页 附图4页CN 110028557 A 2019.07.19C N 110028557A1.一种Ce6标记的双链抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为：2.一种如权利要求1所述的双链抗菌肽的合成方法，其特征在于，所述合成方法步骤如下：(1)采用固相合成法合成双链抗菌肽；(2)采用Ce6标记抗菌肽(AMP -Ce6)。

3.如权利要求2所述的双链抗菌肽的合成方法，其特征在于，所述双链抗菌肽的合成方法为：采用常规的固相Fmoc法，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸链接到树脂上，使肽链从C末端向N末端延伸，在合成第五个氨基酸时，采用氨基酸(Fmoc -Lys(Fmoc)-OH)，并用溶于DMF 的20％哌啶切割此保护基团，切掉两个Fmoc后，后面接的氨基酸形成双链，反复循环添加单体氨基酸，直到合成完成。

两栖类抗菌肽Temporin-1CEa对乳腺癌细胞作用机制的研究的开题报告1. 研究背景和意义乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势，严重威胁着女性健康。

抗菌肽是一类天然存在于生物体内的小分子肽，具有多种生物活性，能够对抗病原微生物和肿瘤细胞等。

因此，抗菌肽的应用具有极大的潜力，已成为近年来研究的热点之一。

Temporin-1CEa是一种源自意大利红腹蛙的两栖动物抗菌肽，具有广泛的抗菌活性和良好的生物稳定性，但其对乳腺癌细胞的作用机制尚不清楚。

2. 研究目的本研究旨在探究Temporin-1CEa对乳腺癌细胞的作用机制，包括其对细胞增殖、凋亡、周期、迁移和侵袭的影响，从分子水平揭示其作用机制，为其在临床上的应用提供理论基础和实验依据。

3. 研究内容和方法本研究将以乳腺癌MCF-7细胞系为实验对象，通过MTT法检测Temporin-1CEa对细胞增殖的影响；采用细胞凋亡检测试剂盒和Annexin V-PI染色技术检测其对细胞凋亡的影响；通过细胞周期分析和Western blot法检测其对细胞周期的影响；Transwell室法和scratch划痕实验检测其对细胞迁移和侵袭的影响；最后采用实时荧光定量PCR和Westernblot法检测其对细胞增殖、凋亡、周期、迁移和侵袭相关蛋白的表达水平的影响。

4. 预期结果我们预期Temporin-1CEa能够抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、调控细胞周期和促进细胞凋亡，同时抑制细胞迁移和侵袭，并进一步弄清其作用机制。

5. 研究意义本研究将为Temporin-1CEa的临床应用提供实验依据和理论基础，推广抗菌肽的应用，为乳腺癌的治疗提供新思路和新方法。

Vol.33高等学校化学学报No.122012年12月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 2681~2687新型抗菌肽的设计㊁活性研究及与磷脂相互作用的计算模拟于岚岚1,冉　瑜1,白希希1,李爱荣2,朱艳艳1,覃　韵2,屈凌波1,3(1.郑州大学化学与分子工程学院,2.药学院,郑州450001;3.河南工业大学化学化工学院,郑州450052)摘要　设计合成了多个具有2个活性序列的线性和环状多肽及具有单个活性序列的短链多肽,研究了它们的杀菌活性,发现其杀菌活性顺序为长链肽>环状肽>短链肽,特别是线性的Linear⁃KT 和Linear⁃KS 对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有较高的杀菌活性.采用MTT 法考察了Linear⁃KT 和Linear⁃KS 对正常细胞的毒性,其中Linear⁃KS 表现出较低的细胞毒性,优于阳性对照多粘菌素B.利用计算模拟的方法计算了多肽与细菌细胞膜中磷脂酰甘油(DMPG)的相互作用.结果表明,多肽和DMPG 的结合能也表现出长链肽>环状肽>短链肽的规律,特别是Linear⁃KT 和Linear⁃KS 具有较高的结合能.长链肽含有2个活性序列,可提供多个荷正电的氨基酸与荷负电的磷脂结合,结合能较大,杀菌活性较强.同时,柔性的结构及Linear⁃KT 和Linear⁃KS 中丝氨酸和苏氨酸的茁碳上的羟基可与磷脂上的羰基形成多个氢键,进一步增大了结合能.计算模拟的方法为抗菌肽的杀菌活性从理论上提供了一定的依据.关键词　抗菌肽;杀菌活性;毒性;磷脂酰甘油;计算模拟中图分类号　O629.72;R966 文献标识码　A doi :10.7503/cjcu20120476收稿日期:2012⁃05⁃16.基金项目:国家自然科学基金(批准号:21002093)㊁教育部留学回国人员科研启动基金㊁中国博士后科学基金和河南省教育厅自然科学研究计划项目(批准号:2011B150039)资助.联系人简介:屈凌波,男,博士,教授,主要从事分析化学研究.Email:qulingbo@抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是宿主防御体系中天然免疫系统所产生的具有一定杀菌效果的短肽类物质,广泛分布于自然界中,具有广谱抗菌性.很多抗菌肽不仅对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌具有杀菌作用,而且对某些真菌㊁原生生物㊁甚至肿瘤细胞和病毒也具有一定的抑制作用[1~4].研究表明,抗菌肽的主要作用机理是针对生物膜,通过破坏生物膜的完整性,使其产生孔洞或者生物膜瓦解而使内部物质外流,或者穿透生物膜进入细胞内部,干预一些重要的细胞过程,从而起到杀菌的作用[5].由于抗菌肽作用主要针对于细胞膜结构,其普遍具有比较低的抗药性,因此也被认为是抗生素的替代品和增效剂,用以解决日益严重的细菌抗药性问题[6].根据天然抗菌肽的特性进行全新的抗菌肽设计是发现新抗菌肽的重要途径[7],其中很多含有多个活性片段的多肽具有较高的生物活性.如含有2个碱性溶解单位的24个氨基酸残基的多肽WLBU2比具有单个碱性溶解单位的多肽LBU 及色氨酸取代的WLBU 表现出更高的杀菌活性及选择性[8].Frecer 等[9]从头设计出新型的具有双活性序列HBHPHBH 或HBHBHBH(B:带正电的氨基酸;H:疏水性氨基酸;P:极性氨基酸)的环状抗菌肽.其中1个环状抗菌肽(V4,CVKVQVKVGSGVKVQVKVC)具有较高的抗菌性,其双活性序列使两亲性加强,有助于抗菌肽生物活性的表现.但该肽由于含有大量疏水性缬氨酸,水溶性差,限制了其应用[10,11].除WLBU2和V4外,不少抗菌肽也存在类似的现象.根据抗菌肽Tritrpticin 设计的对称模拟肽具有比Tritrpticin 高2~8倍的抗菌肽活性[12].Sushi 3抗菌肽的二聚体比单体具有更高的破坏脂多糖胶团的能力[13].Pexiganan(MSI⁃78)和PG⁃1在溶液中是单体,当其与生物膜相结合时,形成两亲的二聚体,表明二聚体是活性构象[14].二聚体也可看成是分子中含有2个活性序列.此外,某些天然抗菌肽序列中也包含有2个相同的多肽片段,如Gramicidin S (Cyclo VOLdFPVOLdFP)由2个相同的片段环化而成[15].因此,具有双活性序列的多肽可能具有潜在的生物活性.本文设计了含有双活性序列的抗菌肽并考察了其活性,研究了双活性序列是否有助于提高抗菌肽的活性.鉴于多肽的化学合成成本,具备抗菌活性的短肽具有大批量生产的潜力,因此选取具有较短序列的多肽作为活性序列,设计了包含2个相同活性序列的多肽,测试了其抗菌活性及毒性,并运用计算模拟的方法计算了所设计的多肽与细菌的细胞膜中一种重要的磷脂 磷脂酰甘油(DMPG)的结合能,并对二者进行了比较.由于二硫键的环化有助于稳定多肽的结构,因此还设计了同时具有单个二硫键和环状结构的多肽,研究了其抗菌活性和环状结构的关系,为具有环状结构的抗菌肽的结构和活性关系研究以及抗菌肽的设计提供依据.1　实验部分1.1　试剂与仪器革兰氏阴性菌包括大肠杆菌(Escherichia coli )㊁铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa )和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii );革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus )和藤黄微球菌(Micrococcus lut eus).其中,大肠杆菌㊁金黄色葡萄球菌及藤黄微球菌由河南省药品检验所提供,其余菌株由临床分离得到.人支气管上皮细胞株(BEAS⁃2B 细胞)由郑州大学吴卫东教授馈赠;多粘菌素B(Polymyxin B,PB)和四甲基偶氮(MTT)购自Sigma 公司;人工设计的多肽由上海吉尔生化有限公司合成,纯度>85%;其它化学试剂均为国产分析纯;实验用水为二次蒸馏水.Spectra MR 酶标仪(美国DYNEX 公司);IS10⁃OMNIL8型红外吸收光谱仪(美国Thermo Fisher 公司);J⁃815型圆二色光谱仪(日本JASCO 公司).1.2　实验过程1.2.1　杀菌实验　挑取适量菌种在固体Luria⁃Bertani(LB)培养基中划线,置于37℃培养箱中过夜培养.挑取适量处于对数生长期的细菌于生理盐水中,配制0.5~1麦氏浊度的菌悬液,此时细菌菌落数约为1×108cfu /mL,使用时稀释至1×106cfu /mL.配制浓度为2mg /mL 的多肽溶液.采用微量肉汤二倍稀释法测定合成多肽对各细菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)[16],同时进行溶剂㊁只加菌液不加多肽的阴性对照和加入多粘菌素B 的阳性对照,每个多肽平行进行3次.于37℃恒温箱中培养12h,观察孔内溶液的混浊情况,96孔板同排中肉眼所见澄清孔所对应的最小浓度即为该多肽的MIC 值.采用半数有效剂量(ED 50)评价多肽的杀菌效率.采用酶标仪测定上述96孔板600nm 处的光密度值(OD 600).按下式计算杀菌百分数,作图得出多肽杀伤细菌的半数有效剂量.Inhibition(%)=1-OD 600(after incubation with peptide)OD 600(without incubation with peptide éëêùûú)×100%(1)1.2.2　细胞毒性实验　采用MTT 法测定细胞毒性[17].用含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI1640(含100U /mL 青霉素和100U /mL 链霉素)培养基常规培养BEAS⁃2B 细胞.采用对数生长期的BEAS⁃2B 细胞,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调节细胞浓度为5×104Cell /mL,接种到96孔板上,每孔200μL.培养12h 后,加入不同浓度的多肽(终浓度分别为2.5,5,10,20,40,80,160和320μg /mL),每种多肽浓度设4个复孔,并设不加细胞液的调零孔和只加细胞液㊁不加肽液的空白对照孔.培养4h 后,每孔加入180μL 不含血清的RPMI 1640培养液和20μL 5g /L 的MTT 试剂,继续孵育4h,弃去上清液,加入180μL DMSO,轻轻振荡10min,于490nm 波长下测定光密度值.1.2.3　红外光谱测定　取多肽试样约1mg 与KBr 混匀,压片,测定多肽的红外光谱.1.2.4　圆二色光谱测定　在室温下,采用0.1mm 石英比色皿测定多肽在水溶液中的远紫外圆二色光谱.扫描范围175~260nm,每条多肽扫描3次,扫描速度1000nm /min,多肽浓度为1mg /mL.1.2.5　计算方法　磷脂酰甘油(DMPG)是细菌的细胞膜中的一种重要组成成分,带有负电荷,在抗菌肽和细菌细胞膜结合过程中具有重要作用.采用DMPG 模拟细菌细胞膜,对多肽和DMPG 的结合能进行了计算.多肽与DMPG 分子的初始构型由Gaussian View 和Amber 软件中的leap 模块共同构建,计算使用Gaussian 09软件[18],采用PM3半经验算法对DMPG 及各个多肽分子进行构型优化.然后对多肽与DMPG 分子的复合物进行优化来模拟多肽与DMPG 分子的相互作用,由于多肽与DMPG 分子的复2862高等学校化学学报 Vol.33　合物分子量较大,模拟时仍然采用PM3半经验算法进行优化.多肽与DMPG 分子主要通过静电作用结合在一起,同时还会形成氢键,计算时需要同时考虑2种作用.通过结合能来衡量多肽与DMPG 分子间的相互作用程度,结合能计算方法如下:ΔE =E (Complex)-∑E (Individual component)(2)式中,E 为优化后各组分的单点能.计算时尽量考虑不同的结合模式,以使多肽与DMPG 达到最好的结合.2　结果与讨论2.1　多肽的设计内毒素又称脂多糖,是革兰氏阴性菌外层细胞膜的重要成分之一,主要位于膜的外侧,是与各种外源性物质最先接触的部分.Lipid A 是内毒素中具有生物活性的保守部分.研究表明[9],与内毒素结合的宿主防御蛋白由富含带正电的氨基酸组成两亲性结构,具有杀菌功能,因此基于宿主防御蛋白的结合基元设计合成的多肽可能保留其杀菌活性,具有潜在的应用价值.Frecer 等[19]基于此计算了多个多肽片断和Lipid A 的结合能,发现KFNFK,KFTFK 及KFSFK 序列多肽与Lipid A 结合释放了较高的结合能,构象较稳定,从理论上预测了这3个多肽片断可能具有抗菌活性.KFNFK,KFTFK 和KFSFK 的极性和非极性氨基酸交叉排列,分别形成疏水面和亲水面,氨基酸序列符合BHPHB 分布规律.具有与Lipid A 较高的结合能表明这3个多肽可能更容易和细菌的细胞膜结合.因此本文将这3个多肽视为一个活性序列,参照V4抗菌肽的设计,采用GSG 将2个活性序列连接形成含有双活性序列的线性多肽Linear⁃KT,Linear⁃KS 和Linear⁃KN.为进一步固定多肽的构象,使疏水面更疏水,亲水面更亲水,采用二硫键环化线性多肽,形成环状的含有双活性序列的多肽Cyclic⁃KS,Cyclic⁃KN 和Cyclic⁃KT(具体序列见表1).Table 1　MICs of peptides against Gram⁃negative and Gram⁃positive bacteriaSequenceMIC /(μg㊃mL -1)Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Staphyloccocus aureus Micrococcus luteus Ac⁃CKFSFKGSGKFSFKC⁃NH 2(Cyclic⁃KS)5005002506464Ac⁃CKFNFKGSGKFNFKC⁃NH 2(Cyclic⁃KN)>500500>500250250Ac⁃CKFTFKGSGKFTFKC⁃NH 2(Cyclic⁃KT)50050025050064Ac⁃KFTFKGSGKFTFK⁃NH 2(Linear⁃KT)32642501616Ac⁃KFSFKGSGKFSFK⁃NH 2(Linear⁃KS)321252501616Ac⁃KFNFKGSGKFNFK⁃NH 2(Linear⁃KN)500500>500125125Ac⁃KFTFK⁃NH 2(KT)>500>500>500>500>500Ac⁃KFSFK⁃NH 2(KS)>500500500>500>500Ac⁃KFNFK⁃NH 2(KN)>500>500>500>500>500Polymyxin B 8288840%Acetonitrile >500>500>500>500>50010%DMSO >500>500>500>500>5002.2　多肽的最小抑菌浓度的确定采用目视法,观察肉眼所见的澄清孔所对应的最小浓度,考察了多肽对多种革兰氏阴性菌和阳性菌的抗菌活性,结果列于表1.由表1数据可以看出,具有单个活性序列的多肽KT,KS 及KN 对5种细菌的杀菌活性均不理想,最小抑菌浓度均不低于500m g /mL,说明具有单个结合序列的多肽活性不高.具有双活性序列的线性多肽对细菌的杀菌活性较具有单个活性序列的多肽有所提高,特别是Line⁃ar⁃KT 和Linear⁃KS,对金黄色葡萄球菌及藤黄微球菌的最小抑菌浓度低至16m g /mL.而环状的多肽对细菌的杀菌活性普遍较低,介于具有单个活性序列和双活性序列的线性多肽之间.在对5种细菌的杀菌活性检验中,含有双活性序列的多肽Linear⁃KT 和Linear⁃KS 均比Linear⁃KN 表现出较高的杀菌活性,而Linear⁃KT 和Linear⁃KS 的活性则相近.具有一定活性的多肽对革兰氏阳性菌的杀菌活性均略强于革兰氏阴性菌.3862　No.12　于岚岚等:新型抗菌肽的设计㊁活性研究及与磷脂相互作用的计算模拟2.3　多肽对细菌的半数有效剂量的确定由公式(1)计算得出多肽在各浓度下的杀菌百分数,绘制其杀菌率曲线并获得半数有效剂量ED 50,结果列于表2.图1为Linear⁃KT 和Linear⁃KS 对金黄色葡萄球菌的杀菌率曲线.Table 2　ED 50values of Linear⁃KT and Linear⁃KS against Gram⁃negative and Gram⁃positive bacteria SequenceED 50/(μg㊃mL -1)Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Staphyloccocus aureus Micrococcus luteus Linear⁃KT 17.444.7109.711.220.4Linear⁃KS 22.481.3102.311.06.8Fig.1　Antimicrobial activities of Linear⁃KT (A )and Linear⁃KS (B )against Staphyloccocus aureus2.4　细胞毒性实验选取所设计多肽中杀菌效果较好的Linear⁃KT 和Linear⁃KS 进行细胞毒性实验,结果见图2.阳性Fig.2　Inhibition of polymyxin B(),Linear⁃KT()and Linear⁃KS()against cells对照多肽类抗菌素多粘菌素B 虽具有较强的杀菌活性(表1),但也引起部分正常细胞的死亡,特别是其浓度高于80m g /mL 时,多粘菌素B 可导致较高的细胞死亡率.Linear⁃KT 的细胞毒性较大,在大部分的研究浓度下均对细胞有毒性.相比之下,Linear⁃KS 对细胞的毒性较小,在浓度不高于160μg /mL 时,其对细胞的抑制率均不超过15%,低浓度时毒性更低.Linear⁃KS 具有较高的杀菌活性且细胞毒性较低,因此Linear⁃KS 具有进一步研究的价值和潜在的应用价值.Fig.3　IR spectra of KT (A ),Linear⁃KT (B )and Cyclic⁃KT (C )2.5　红外光谱解析红外光谱是解析多肽以及蛋白质二级结构的有力手段.多肽和蛋白质在红外光谱区有若干特征吸收带,主要有酰胺Ⅰ带(1600~1700cm -1)和酰胺Ⅱ带(1600~1500cm -1).酰胺Ⅰ带主要由多肽骨架肽链CO 的伸缩振动引起,对研究二级结构最有价值[20].图3为KT,Linear⁃KT 和Cyclic⁃KT 的红外光谱图.可见,KT 在1600~1700cm -1处有1个明显的强峰,峰形较宽;Linear⁃KT 在1679及1632cm -14862高等学校化学学报 Vol.33　处有2个很强的吸收峰;而Cyclic⁃KT 在1677及1631cm -1处也有2个很强的吸收峰.因此,Linear⁃KT 和Cyclic⁃KT 均可能形成折叠结构.采用红外光谱虽然可从一定程度上提供多肽的二级结构信息,但由于1600~1700cm -1波段受干扰因素较多,且红外光谱测试中多肽处于固体状态,不能反映出多肽在水溶液中的状态,因此进一步采用圆二色光谱考察了多肽在水中的二级结构.2.6　圆二色光谱测定图4为短链多肽KT㊁线性多肽Linear⁃KT 及环状多肽Cyclic⁃KT 的圆二色光谱.短链多肽KT 在200nm 处有1个负峰,为无规卷曲结构的特征峰[21,22].KT 只包含5个氨基酸残基,肽链长度较短,不Fig.4　CD spectra of KT (a ),Linear⁃KT (b )and Cyclic⁃KT (c )足以形成二级结构,因此以无规结构存在于溶液中.多肽Linear⁃KT 在200nm 处也有1个负峰,表明Linear⁃KT在水溶液中也呈无规结构.环状多肽Cyclic⁃KT 在202及213nm 处有2个负峰,且在195nm 处有1个正峰.典型的β⁃sheet 结构在216nm 处有1个负峰,195nm 处有1个正峰,因此Cyclic⁃KT 在溶液中可能以无规及部分β⁃sheet 结构存在.Cyclic⁃KT 以二硫键将多肽链环化,使得多肽的构象相对固定,因此表现出部分β⁃sheet 二级结构.本研究中所用多肽长度较短,因此不足以形成明显的二级结构,圆二色光谱信号总体较低.2.7　模拟计算Linear⁃KT 和Linear⁃KS 对革兰氏阴性菌和阳性菌均表现出较好的杀菌活性,特别是对革兰氏阳性菌.这2条多肽均含有双活性序列,是由2条具有单活性序列的多肽通过简单的氨基酸残基相连而形成,但比相应的具有单活性序列的多肽表现出显著提高的杀菌活性.因此本文采用计算模拟的方法计算了所设计的多肽与磷脂相互作用时的结合能,以评价多肽和细胞膜的结合程度.磷脂是细胞膜的主要组成成分,细菌的细胞膜含有较高含量的DMPG,而哺乳动物的细胞膜中DMPG 的含量则很少,因此本文采用DMPG 为研究对象考察其与多肽的结合能力.采用Gaussian 09中的PM3半经验算法优化DMPG 及各多肽的分子构型.红外光谱图提示线性和环状的多肽形成折叠结构,圆二色光谱也表明环状多肽可能具有部分β⁃sheet 二级结构,因此以折叠结构优化线性及环状多肽,在优化过程中将多肽与DMPG 分子的骨架部分进行固定以缩短优化时间,结果见图5.根据多肽和DMPG 的构型优化结果构建多肽和DMPG 形成的复合物,并对复合物进一步优化,复合物的构型见图6.计算时主要考虑多肽与DMPG 分子的静电和氢键结合,同时考虑尽可能多的结合模式.以结合能最低为原则[23],根据公式(2)计算出多肽与DMPG 形成的复合物和各单体之间的能量差即得到结合能,数据列于表3.由表3可见,所有多肽与DMPG 分子结合过程的能量差均为负值,说明多肽与DMPG 的相互作用过程释放能量,能量差的绝对值越大说明二者的结合能越大.长链肽和环状肽与DMPG 分子结合时具有较大的结 Fig.5　Optimized conformations of DMPG (A ),peptide KT (B ),Linear⁃KT (C )and Cyclic⁃KT (D )Fig.6　Optimized conformations of complex of DMPG with peptide KT (A ),Linear⁃KT (B ),Cyclic⁃KT (C )and Linear⁃KN (D )5862　No.12　于岚岚等:新型抗菌肽的设计㊁活性研究及与磷脂相互作用的计算模拟6862高等学校化学学报 Vol.33　合能,远高于短链肽.结合能越大,说明该类多肽更易与DMPG分子产生相互作用,进而产生杀菌效果.DMPG分子头基带负电,可与带正电的氨基酸产生静电作用.DMPG的负电头基在与长链肽和环肽结合的过程中,可同时与2个带正电的赖氨酸产生静电作用,而在与短链肽的结合过程中只能与1个带正电的赖氨酸产生静电作用.这是造成短链肽的结合能远小于长链肽与环状肽的主要原因.此结果和实验所得的杀菌活性数据基本一致,即具有2个活性序列的长链肽和环状肽比具有单个活性序列的短链肽杀菌活性更强.Table3　Binding energies(D E)of the complexes of DMPG with peptidesComplexΔE/a.u.ΔE/(kJ㊃mol-1)ComplexΔE/a.u.ΔE/(kJ㊃mol-1)　KN+DMPG-0.20306935-533.16　Linear⁃KS+DMPG-0.33423409-877.53　KT+DMPG-0.20957031-550.23　Cyclic⁃KN+DMPG-0.28579697-750.36　KS+DMPG-0.21099303-553.96　Cyclic⁃KT+DMPG-0.31498189-826.98　Linear⁃KN+DMPG-0.31931691-838.37　Cyclic⁃KS+DMPG-0.31847687-836.16　Linear⁃KT+DMPG-0.33190714-871.42 在长链肽和环状肽中,序列中含有丝氨酸和苏氨酸的多肽比相应的含有天冬酰胺的多肽结合能大,这是因为丝氨酸和苏氨酸的β碳上的羟基可与磷脂分子2条碳链上的羰基形成氢键,从而增大了结合能.杀菌实验结果也证明含有丝氨酸和苏氨酸的多肽活性高于含天冬酰胺的多肽.Frecer等[19]计算表明,KFTFK,KFSFK和KFNFK与内毒素的活性部分Lipid A结合的Gibbs自由能分别为-67,-75和-55kJ/mol;KFTFK和KFSFK序列与Lipid A的结合能更大,该结果与本文结果一致.与环状肽相比,长链肽与DMPG分子的结合能略高于环状肽,这可能是由于多肽结构的影响.长链肽在水溶液中基本以无规结构存在,因此多肽结构柔性较大,可根据所结合的对象采取更适合的结构与之结合.特别是Linear⁃KT和Linear⁃KS,其柔性结构使丝氨酸和苏氨酸的β碳上的羟基均可与DMPG分子中2条碳链上的羰基形成氢键,增大结合能.而环状肽由于受折叠结构和二硫键的限制,肽的结构相对固定,肽环的大小受限,使磷脂分子不能完全插入肽环中,只能在肽环平面的侧面与其结合,只与DMPG分子中1条碳链上的羰基形成氢键,氢键数目减少,结合能降低,因此环状肽的活性不及长链肽.3　结 论设计合成了多个具有2个活性序列的线性和环状多肽及具有单个活性序列的短链多肽,研究了其杀菌活性,并采用计算模拟的方法计算了多肽与细菌细胞膜中重要成分磷脂酰甘油的结合能,从理论上解释了其活性.结果表明,静电作用和氢键在多肽与磷脂的结合过程中起重要作用.线性的Linear⁃KT和Linear⁃KS具有双活性序列,可同时提供2个荷正电氨基酸与磷脂结合,杀菌活性远远大于单活性序列.将双活性序列引入同一分子,可起到提高杀菌活性的作用.同时Linear⁃KT和Linear⁃KS的柔性结构能够使多肽与磷脂上的羰基形成多个氢键,因此结合能较大,具有较强的杀菌活性.计算模拟的方法为抗菌肽的杀菌活性预测从理论上提供了一定的依据.利用该方法可在一定程度上预测抗菌肽的杀菌活性,提高抗菌肽的研发效率,为抗菌肽的设计与开发提供了新途径.参　考　文　献[1]　Zasloff M..Nature[J],2002,415(6870):389 395[2]　FU Nan⁃Yan(傅南雁),XU Jia⁃Xi(许家喜).Chemistry of Life(生命的化学)[J],1998,18(2):25 28[3]　HUANG Yi⁃Bing(黄宜兵),ZHAI Nai⁃Cui(翟乃翠),GAO Gui(高贵),CHEN Yu⁃Xin(陈育新).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2012,33(6):1252 1258[4]　Wimley W.C.,Hristova K..J.Membr.Biol.[J],2011,239(1/2):27 34[5]　Hoskin 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Its Computer Simulation with PhospholipidYU Lan⁃Lan 1,RAN Yu 1,BAI Xi⁃Xi 1,LI Ai⁃Rong 2,ZHU Yan⁃Yan 1,QIN Yun 2,QU Ling⁃Bo 1,3*(1.College of Chemistry and Molecular Engineering ,2.School of Pharmaceutical Sciences ,Zhengzhou University ,Zhengzhou 450001,China ;3.College of Chemistry and Chemical Engineering ,Henan University of Technology ,Zhengzhou 450052,China )Abstract Linear and cyclic peptides with two bioactive sequences and peptides with single bioactive se⁃quence were designed and synthesized,followed by the investigation of their antibacterial activities.The re⁃sults showed that the antibacterial activity sequence was linear peptides>cyclic peptides>short peptides.Espe⁃cially linear peptides Linear⁃KT and Linear⁃KS showed high antibacterial activity against Gram⁃negative and Gram⁃positive bacteria.The toxicities of Linear⁃KT and Linear⁃KS against normal cell were also investigated by MTT method.Linear⁃KS showed low cell toxicity,which is better than the positive control Polymyxin B,implying a potential further investigation and application.The interaction between peptides and an important component of bacterial cell membrane phosphatidylglycerol(DMPG)was investigated by computer simulation.The results indicated that the binding energy between peptides and DMPG shows linear peptides>cyclic pep⁃tides>short peptides,especially Linear⁃KT and Linear⁃KS with higher binding energy.Linear peptides with two bioactive sequence provide more positively charged amino acids,which bind to negatively charged phos⁃pholipid,leading to higher binding energy and stronger antibacterial activity.Simultaneously flexible confor⁃mation and the hydroxyl group on β⁃C of serine and threonine in Linear⁃KT and Linear⁃KS could form more hy⁃drogen bonds with carbonyl group in phospholipid,which further increases the binding energy.The computer simulation method provides theoretical evidence for antibacterial activity of antimicrobial peptides to some ex⁃tent.Keywords Antimicrobial peptide;Antibacterial activity;Toxicity;Phosphatidylglycerol;Computer simula⁃tion (Ed.:H ,Z ,N ,K )7862　No.12　于岚岚等:新型抗菌肽的设计㊁活性研究及与磷脂相互作用的计算模拟。

收稿日期:2008-05-10作者简介:周庆峰(1977-),男,辽宁省盘锦市人,药学博士,从事于药物生物技术方面的研究,E 2mail:zhouqingfeng715@1631com 。

doi ∶1013969/j 1issn 11008-9632120091021035新型抗菌肽Perinerin 在大肠杆菌中的融合表达周庆峰1,李明月2,李成伟1,奚　涛2(11商丘师范学院,河南商丘　476000;21中国药科大学生命科学学院,南京　210009)摘　要:为了获得新型抗菌肽perinerin 在大肠杆菌中的高效和可溶表达,实验首先采用S OE 法(重叠PCR 法)获得的perinerin 基因序列,对目的基因密码子优化,然后将其连接到pET32a 载体中获得重组表达载体pET32a -PE N,通过改变诱导时间和温度、诱导剂I PTG 浓度以及诱变工程菌株等条件和方法,观察重组蛋白的表达效果,并运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化。

S DS 2P AGE 显示重组菌诱导后表达的融合蛋白分子量约为26k D,采用变异重组菌株MUT 3诱导表达,在2×YT 培养基培养条件下,30℃诱导4h 可获得高效表达的perinerin 融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的50%左右,重组蛋白主要以可溶性表达形式存在,可溶性产物最高可达重组蛋白总表达量的60%。

融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化,纯度可达90%以上。

关键词:perinerin;融合蛋白;诱导表达;优化中图分类号:Q786文献标识码:A文章编号:1008-9632(2009)02-0035-04 Perinerin 是从海洋生物亚洲海蚕中分离纯化得到的一种小分子多肽,其具有广谱的抗革兰阳性和阴性细菌及真菌的活性,尤其对临床上耐药性明显的绿脓杆菌有显著的抑制效果,最小抑菌浓度仅为3～6μg/mL 。

另外,perinerin 的结构独特,与目前所有已知的抗菌肽均不相同,这提示其有潜力成为一种新的抗菌肽作用机制研究模型[1]。