酶工程复习整理

酶⼯程复习整理

酶⼯程复习整理

酶⼯程的概念：酶⼯程⼜称酶技术，是酶的⽣产与应⽤的技术过程，其主要任务是通过⼈⼯操作，获得⼈们所需的酶，并通过各种⽅法使酶发挥其催化功能。

酶⼯程的发展阶段：1.从动物、植物或微⽣物细胞和组织中提取酶，加以利⽤的阶段 2,发酵法⽣产，揭开近代酶⼯业的序幕。

酶催化作⽤的机制：

邻近效应；底物与底物之间、酶的催化基团与底物之间结合于同⼀分⼦，从⽽使反应速率⼤⼤增加。

定向效应：酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取向产⽣的效应。

底物的形变(distortion)和诱导契合(induced fit)：酶中某些基团或离⼦可以使底物分⼦产⽣“电⼦张⼒”，底物分⼦发⽣形变，接近过渡态，降低了反应活化能。

酸碱催化(acid-base catalysis)：通过瞬时向反应物提供质⼦或从反应物接受质⼦以稳定过渡态，加速反应的⼀类催化机制。

共价催化(covalent catalysis)：⼜称亲核催化(nucleophilic catalysis)或亲电⼦催化(electrophonic catalysis)。亲核催化剂(亲电⼦催化剂)能放出电⼦(汲取电⼦)并作⽤于底物的缺电⼦中⼼(负电中⼼)，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能。

⾦属离⼦催化：（1）通过结合底物为反应定向；（2）通过可逆改变⾦属离⼦的氧化态调节氧化还原应；（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷。

活性部位微环境的影响

酶催化反应的特点a.催化剂的特性：

⽤量少⽽催化效率⾼；

不改变化学反应的平衡点；

参与反应，但在反应前后本⾝⽆变化

b.酶催化的特性：

1.⾼效性（原因）

a.酶可极⼤程度上降低反应所需的活化能

b.酶催化是多种催化因素的协同作⽤（邻近效应、定向效应，扭曲变形和构象变化的催化效应，⼴义的酸碱催化、共价催化及酶活性中⼼微环境）2.专⼀性

3.反应条件温和

4.酶的活性是受调节控制的

专⼀性的分类：

绝对专⼀性

结构专⼀性族的专⼀性

酶的专⼀性键的专⼀性

光学异构专⼀性

⽴体化学专⼀性

⼏何异构专⼀性光学异构专⼀性：当底物具有旋光异构体时，酶只能催化L型和D型两个对映体中的⼀个。⼏何异构专⼀性：酶能识别顺反异构体。

键专⼀性：酶只要求作⽤于⼀定的键，对键两端的基团⽆要求。

基团专⼀性(族专⼀性)：除了对键要求以外，还要求键⼀侧的基团为特定的基团。

绝对专⼀性：对唯⼀的底物催化唯⼀的反应。

酶活性中⼼的构成：

酶的活性中⼼(active center)：酶分⼦上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域。包括结合部位 Binding site：酶分⼦中与底物结合的部位或区域（结合部位决定酶的专⼀性）以及活性中⼼－催化部位 catalytic site：酶分⼦中促使底物发⽣化学变化的部位（催化部位决定酶所催化反应的性质。）

酶活性中⼼有7种氨基酸残基参加的频率最⾼，它们是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。

双底物酶催化反应的类型：

连续机制：反应过程中形成三元配合物，分为a.序列有序机制：两种底物按⼀定的顺序与酶结合，只有当第⼀个酶与底物结合后，第⼆个底物才能结合上去。产物也是按照⼀定的顺序释放。依赖NAD＋或NADP＋的脱氢酶的反应就属于这种类型。b.序列随机机制：两种底物不按⼀定的顺序结合，产物的释放也是随机的。某些激酶例如肌酸激酶等就服从随机反应机理。

乒乓机制：酶⾸先和⼀个底物结合，释放出⼀个产物以后，再与另⼀个底物结合，并释放出产物，不形成三元配合物。转氨酶、某些黄素酶在内的许多酶都具乒乓反应机制

酶抑制作⽤的类型：A. 可逆抑制作⽤（reversible inhibition）：抑制剂与酶以⾮共价键结合，⽤透析、超滤或凝胶过滤等⽅法可以除去抑制剂，恢复酶活性。B．不可逆抑制作⽤（irreversible inhibition）：抑制剂与酶以共价键结合，⽤上述物理⽅法不能除去抑制剂和恢复酶活性。

A．可逆抑制作⽤ reversible inhibition 类型①竞争性抑制作⽤②反竞争性抑制作⽤③⾮竞争性抑制作⽤④混合型抑制作⽤

底物浓度增⼤，反竞争抑制作⽤减⼩，竞争抑制作⽤增强，⾮竞争抑制作⽤不受影响

⾮专⼀性的不可逆抑制作⽤B．不可逆抑制作⽤

1.⾮专⼀性的不可逆抑制作⽤：抑制剂能和酶上的⼀类或⼏类基团反应。

2.专⼀性不可逆抑制作⽤：抑制剂只能与酶分⼦上的酶活性部位有关的基团发⽣化学反应，并共价地连接在酶分⼦的必须基团上，阻碍了底物与酶分⼦的结合或者破坏了酶的催化基团的抑制作⽤。分为两种类型：Ks 型专⼀性不可逆抑制剂（亲和标记）：与底物结构相似，能与酶的底物结合部位结合，同时还带有⼀个活性基团，可以和附近的相应基团反应，形成共价键。有结合专⼀性，但没有反应专⼀性。Kcat 型不可逆抑制剂（⾃杀底物）：既能与活性中⼼结合，⼜能被活性中⼼催化反应，反应后在抑制剂分⼦上产⽣活性基团，再与活性中⼼的必需基团反应，产⽣共价修饰。专⼀性⾼

酶的⽣产过程中需要控制的条件以及控制⽅法

酶分离纯化的评价指标：

产率=(⽬的酶的总活⼒/粗抽提液中⽬的酶总活⼒)*100%——反映提纯过程酶活⼒的损失情况

提纯倍数=⽬的酶的⽐活⼒/粗抽提液中⽬的酶⽐活⼒——提纯⽅法的效率

常⽤的分离纯化⽅法：1）根据溶解度：盐析，有机溶剂沉淀法，选择性沉淀法，共沉淀法，PEG沉淀法、等电点沉淀法

2）根据分⼦⼤⼩差异：凝胶过滤，超过滤，离⼼，超离⼼

3)电学、解离特性差异：吸附，离⼦交换，电泳（区带、等电聚焦），聚焦层析，疏⽔层析，⾼压层析(HPLC)

4)稳定性差异：选择性热变性，选择性酸碱变性，选择性表⾯变性

5）特殊基团差异: 亲和层析

到分离。

电泳：根据各种蛋⽩质解离、电学性质上的差异，利⽤它们在电场中的迁移⽅向与迁移速度不同⽽进⾏纯化的⼀类⽅法。

固定化的⽅法有哪些1．载体结合法：将酶结合于⽔不溶性载体的⼀种固定化⽅法。

根据结合的⽅式不同，⼜可分为物理吸附、离⼦结合和共价结合三种。A．物理吸附：作⽤⼒：氢键、范德华⼒、疏⽔键等。吸附剂包括⽆机吸附剂（⾼岭⼟、皂⼟、硅酸、氧化铝等）和有机吸附剂（纤维素、胶原等）

⽐较受重视。B．离⼦结合：通过离⼦键结合于具有离⼦交换基团的⽔不溶性载体的固定化⽅法。吸附剂：离⼦交换纤维素，离⼦交换葡聚糖，离⼦交换树脂等。C．共价结合：通过共价键，把与酶蛋⽩活性⽆关的氨基酸功能基团连接在不溶于⽔的载体上。包括重氮化法，烷化法。

2.共价交联法：双功能试剂与酶蛋⽩质中的氨基酸残基作⽤，使酶与酶之间交联成⽹，凝集成固定化酶. 常⽤的是戊⼆醛

3.包埋法：格⼦型固定化酶，微型胶囊法

固定化酶的哪些性质会发⽣变化：1 对底物的特异性。对低分⼦底物作⽤变化不⼤，⽽对⾼分⼦底物的催化作⽤明显减弱。是由于载体的空间位阻引起的。

2 酶反应最适PH值的改变与载体性质有关

3 动⼒学常数的改变。⽶⽒常数和最⼤反应速度会改变

4 酶反应温度的改变

5 增加酶的稳定性。对热、PH值、有机溶媒、蛋⽩质变性剂、蛋⽩质分解酶的稳定性增加。连续化反应稳定性好。——固定化酶的最⼤好处

评价固定化酶的指标相对活⼒＝固定化酶活⼒/相同蛋⽩量的游离酶活⼒＊100%

酶结合效率＝（加⼊的总酶活⼒－未结合的酶活⼒）/加⼊的总酶活⼒＊100%

酶活⼒回收率＝固定化酶总活⼒/加⼊的总酶活⼒＊100%

当固定化⽅法对酶活⼒没有明显影响时，酶结合效率与酶活⼒回收率近似。

酶修饰的基本⽅法1．酶分⼦侧链基团的化学修饰

⼏种重要的修饰反应：酰化及其相关反应，烷基化反应，氧化和还原反应，芳⾹环取代反应特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰：巯基，氨基，羧基，

分⼦内交联修饰2．有机⼤分⼦对酶的化学修饰：利⽤⽔溶性⼤分⼦与酶结合，使酶的空间结构发⽣某些精细的改变，从⽽改变酶的特性。糖及糖的衍⽣物，聚⼄⼆醇、⼤分⼦多聚物，具有⽣物活性的⼤分⼦物质（如肝素），溴化氰法、⾼碘酸氮化法、戊⼆醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等3．蛋⽩质类及其他

化学修饰的基本原理：1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性

酶与修饰剂交联后，使酶的天然构象产⽣“刚性”，不易伸展打开，从⽽增强酶的热稳定性。

2．保护酶活性部位与抗抑制剂

⼤分⼦修饰剂与酶共价交联后，其产⽣的空间障碍或静电斥⼒能有效地阻挡抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖”保护酶活性部位，使抑制剂和酶结合的难度增加，使酶的抗抑制剂能⼒增强。3．维持酶功能结构的完整性与抗蛋⽩⽔解酶

⼤分⼦修饰剂产⽣的空间障碍可阻挡蛋⽩⽔解酶接近酶分⼦，能“遮盖”酶分⼦上敏感键免遭破坏。

酶分⼦上许多敏感基团参与修饰反应，也减少了酶分⼦遭受蛋⽩⽔解酶攻击破坏的可能性。4. 消除酶的抗原性

有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键，破坏了酶分⼦上抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低乃⾄消除。

能“遮盖“抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产⽣结合反应。

什么是酶分⼦的定向进化：

酶分⼦的定向进化技术就是⼈为的创造特殊的进化条件，模拟⾃然进化机制，在体外对基因进⾏随机突变，从⼀个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者⼈为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建⼀个⼈⼯突变酶库，通过⼀定的筛选或选择⽅法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。

有机介质中酶催化反应的优点

⒈有利于疏⽔性底物的反应。（主要提⾼脂溶性底物的溶解度，有利于⾼浓度底物连续⽣物转化。）

⒉可提⾼酶的热稳定性，提⾼反应温度加速反应。

⒊能催化在⽔中不能进⾏的反应（有许多难溶于⽔的⾮极性底物能够溶于有机溶剂中）

有机介质中酶催化反应的条件

保证必需⽔含量:⽔是保证酶催化反应的必需条件，活性构象是⽔分⼦直接或间接由氢键等⾮共价键

相互作⽤来维持。必需⽔：是维系酶构象稳定和酶催化活性所必需的那部分最少量的⽔分⼦，有时也

叫结合⽔，或者束缚⽔。只要那部分必需⽔不丢失, 其他的⼤部分⽔可以由有机溶剂代替。

选择合适的酶及酶形式:

酶种类的选择：应具有对抗有机介质变性的潜在能⼒，在有机介质中能保持其催化活性构象。酶是否适于在有机介质中反应，除与酶性质有关外，还取决于酶-底物、产物-溶剂间的关系问题。这完全需要⽤实验来决定。

酶形式的选择⑴酶粉：将酶做成冻⼲粉，然后在有机介质中充分搅拌，超声波处理，使得颗粒变⼩，悬浮于介质中。

⑵化学修饰酶：化学修饰可以改变酶的⼀些理化性质，有利于酶在有机溶剂中的稳定性，原先不稳定的酶经过修饰变得稳定，主要是因为改变了酶的⼀些理化性质。

选择合适的溶剂及反应体系:⽔溶性有机溶剂：甲醇、⼄醇、丙醇、正丁醇、⽢油、丙酮、⼄腈等。

⽔不溶性的有：⽯油醚、⼰烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、⼄醚、戊醚等。

核酶:

核酶的分类1、剪接型核酶

剪接型核酶的作⽤机制是通过既剪⼜接的⽅式除去内含⼦（Intron).

剪接型核酶分类

I类内含⼦

II类内含⼦

2、剪切型核酶

1)、⾃⾝催化剪切型RNA

剪切机制

这类RNA进⾏⾃⾝催化的反应是只切不接。