血清蛋白等电点

等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点

【实验原理】

等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．

【试剂与器材】

1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。

2．1％(V/V)TEMED溶液。

3．5g/L过硫酸铵 称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。

4．40％两性电解质载体。

5．0．5mmol/L磷酸溶液 量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。

6．0．5mmol/L NaOH溶液 称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。

7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。

8．酸性乙醇脱色液 乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。

9．血清样本 血清无须稀释，但最好透析去除离子。

10．电泳仪 选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。

11．电泳槽 圆盘电泳槽及电泳玻管。

12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。

血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳

[原理]

蛋白质由氨基酸组成，是一种两性电解质，在一定pH条件下可带电荷，带电荷的蛋白质在电场中可发生泳动，这种现象叫电泳。

各种蛋白质都有一定的等电点，在等电点时它呈电中性，在电场中既不向阳极也不向阴极移动。血清蛋白质的等电点一般低于7.3，在pH高于它们等电点的缓冲液中带负电荷，在电场中向阳极移动。由于各种蛋白质分子大小和所带的电荷量不同，在电场中泳动的速度也不相同，蛋白质分子小，带电荷多者泳动速度较快，反之较慢。因此，利用醋酸纤维素薄膜为支持物可将血清蛋白质分为清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白和-球蛋白。经染色后，则成有色区带，各区带的宽窄及色带深浅表示各种蛋白质含量的多少（图12），可用比色法分别测出各种蛋白质的百分含量（表13）。

醋酸纤维素薄膜电泳由于具有对样品没有吸附现象、电泳时各区带分界清楚、 拖尾现象不明显、样品用量少和电泳时间短等优点，已被广泛应用于临床诊断。

临床上常用此法测定血清蛋白质各组分的百分含量，以协助诊断肝脏、肾脏等疾病。

表13 正常人血清蛋白质各组分理化性质

血清蛋白组分 pI 分子量 迁移率(10-5) 百分含量

(万) cm/s/伏 (%)

清蛋白 4.6～4.7 6.9 5.9 57～72

1-球蛋白 5.06 20 5.1 2～5

2-球蛋白 5.06 30 4.1 4～9

常见蛋白质等电点参考值

蛋白质 等电点

鲑精蛋白[salmine] 12.1

鲱精蛋白[clupeine] 12.1

鲟精蛋白[sturline] 11.71

胸腺组蛋白[thymohistone] 10.8

珠蛋白（人）[globin(human)] 7.5

卵白蛋白[ovalbuin] 4.71；4.59

伴清蛋白[conal bumin] 6.8，7.1

血清白蛋白[serum albumin] 4.7－4.9

肌清蛋白[myoal bumin] 3.5

肌浆蛋白[myogen A] 6.3

β-乳球蛋白[β-lactoglobulin] 5.1－5.3

卵黄蛋白[livetin] 4.8－5.0

γ1—球蛋白（人）[γ1-globulin(human)] 5.8，6.6，7.3，8.2

γ2—球蛋白（人）[γ2-globulin(human)] 5.2－5.5

肌球蛋白A[myosin A] 5.1

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告

实验原理

1. 电泳的基本原理

带电颗粒在电场中向着与其电性相反方向移动的现象称为电泳。

电泳时不同的带电粒子在同一电场中泳动速度不同。带电颗粒 ( 球形分子 ) 在电场中的电泳速度 (V )

从上式看出，带电颗粒在电场中的移动速度 (V ) 与颗粒带电荷量 (Q ) 以及电场强度 (E ) 成正比，与球形分子的大小 ( 半径为 r ) 及所在介质的粘度

(η) 成反比。因此 , 在同一电场、同一介质中进行电泳时，带不同电荷，不同大小的颗粒就可以通过电泳而被分离。

在实际操作中，为了不考虑不同电压对电泳速度的影响，我们常用迁移率（ move

rate,M ）来表示带电颗粒的电泳特性，迁移率指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度，即

可见，带电颗粒的净电荷越多，分子颗粒越小，在电场中的迁移率就越快；反之越慢。但电泳速度和电泳迁移率是两个不同的概念，后者有利于不同电场强度下电泳结果的比较，各种带电颗粒在一定条件下测得的迁移率是一个常数。

2. 影响电泳的主要因素

(1) 电泳介质 pH 值的影响 : 对于蛋白质和氨基酸等两性分子，电泳介质的

pH 值影响蛋白质的电离情况，即可决定蛋白质的带电量 (Q ) 。 pH 值小于等电点，分子带正电荷，向负极泳动，如果 pH 大于等电点，分子带负电荷，向正极泳动。 pH 值偏离等电点越远，分子所带净电荷越多，其泳动速度越快。当缓冲液 pH 等于其等电点时，分子处于等电状态，不移动。由于血清蛋白质的等电点多在 pH4 ～ 6 之间，因此，分离血清蛋白常用 pH 8.6 的巴比妥缓冲液或三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 缓冲液。

(2) 缓冲液的离子强度 : 离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持 pH 的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量 ( 压缩双电层 )